2.6.6
毒性試験の概要文の目次
2.6.6.1 まとめ ... 4 2.6.6.2 単回投与毒性試験 ... 10 2.6.6.2.1 げっ歯類を用いた単回投与毒性試験 ... 10 2.6.6.2.2 非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験 ... 10 2.6.6.3 反復投与毒性試験（トキシコキネティクス評価を含む） ... 11 2.6.6.3.1 マウスを用いた反復投与毒性試験 ... 11 2.6.6.3.1.1 マウス 2 週間混餌投与試験 ... 11 2.6.6.3.1.2 マウス 13 週間混餌投与試験（1 回目）... 12 2.6.6.3.1.3 マウス 13 週間混餌投与試験（2 回目）... 13 2.6.6.3.2 ラットを用いた反復投与毒性試験 ... 14 2.6.6.3.2.1 ラット 2 週間混餌投与試験 ... 14 2.6.6.3.2.2 ラット 4 週間経口投与試験 ... 15 2.6.6.3.2.3 ラット 13 週間経口投与試験 ... 17 2.6.6.3.2.4 ラット 13 週間混餌（用量調整）投与試験 ... 18 2.6.6.3.2.5 ラット 26 週間経口投与試験 ... 20 2.6.6.3.3 非げっ歯類を用いた反復投与毒性試験 ... 21 2.6.6.3.3.1 イヌ 4 週間経口投与試験 ... 21 2.6.6.3.3.2 イヌ 13 週間経口投与試験 ... 22 2.6.6.3.3.3 イヌ 26 週間経口投与試験 ... 24 2.6.6.3.3.4 イヌ 52 週間経口投与試験 ... 25 2.6.6.4 遺伝毒性試験 ... 27 2.6.6.4.1In vitro
... 27 2.6.6.4.1.1 サルモネラ／ミクロソーム試験（Ames 試験）... 27 2.6.6.4.1.2 チャイニーズハムスターV79 細胞を用いる染色体異常試 験（in vitro） ... 27 2.6.6.4.2In vivo
... 28 2.6.6.4.2.1 マウス小核試験 ... 28 2.6.6.4.2.2 マウス骨髄細胞染色体異常試験 ... 28 2.6.6.5 がん原性試験（トキシコキネティクス評価を含む） ... 29 2.6.6.5.1 マウスがん原性試験 ... 29 2.6.6.5.2 ラットがん原性試験 ... 312.6.6.6 生殖発生毒性試験（用量設定試験及びトキシコキネティクス評 価を含む）... 34 2.6.6.6.1 ラット受胎能及び初期胚発生に関する試験 ... 34 2.6.6.6.2 ラット胚・胎児発生に関する試験 ... 34 2.6.6.6.3 ウサギ胚・胎児発生に関する試験 ... 36 2.6.6.6.4 ラット出生前・出生後発生に関する試験 ... 37 2.6.6.7 幼若動物を用いた試験 ... 38 2.6.6.7.1 幼若ラットパイロット 2 週間経口投与試験 ... 38 2.6.6.7.2 幼若ラット 4/13/14 週間経口投与試験 ... 39 2.6.6.8 局所刺激性試験 ... 40 2.6.6.8.1 ウサギ静脈内投与局所刺激性試験 ... 40 2.6.6.8.2 イヌ冠動脈内投与局所刺激性試験 ... 41 2.6.6.9 その他の毒性試験 ... 41 2.6.6.9.1 抗原性試験 ... 41 2.6.6.9.2 免疫毒性試験 ... 41 2.6.6.9.3 作用機序に関する試験 ... 41 2.6.6.9.3.1 成体ラットを用いた骨密度及び骨形態に関する試験 ... 41 2.6.6.9.4 依存性試験 ... 43 2.6.6.9.5 代謝物に関する試験 ... 44 2.6.6.9.5.1 代謝物 M-1（BAY 60-4552）の単回投与毒性試験... 44 2.6.6.9.5.2 代謝物 M-1（BAY 60-4552）の反復投与毒性試験... 44 2.6.6.9.5.2.1 マウスを用いた反復投与毒性試験 ... 44 2.6.6.9.5.2.2 ラットを用いた反復投与毒性試験 ... 45 2.6.6.9.5.2.3 イヌを用いた反復投与毒性試験 ... 48 2.6.6.9.5.3 代謝物 M-1（BAY 60-4552）の遺伝毒性試験... 50 2.6.6.9.5.4 代謝物 M-1（BAY 60-4552）のがん原性試験... 51 2.6.6.9.5.5 代謝物 M-1（BAY 60-4552）の生殖毒性試験... 51 2.6.6.9.5.6 代謝物 M-1（BAY 60-4552）のその他の試験... 53 2.6.6.9.5.6.1 3T3 NRU（ニュートラルレッド取り込み）光毒性試験 ... 53 2.6.6.9.5.6.2 腎毒性の機序に関する試験 ... 53 2.6.6.9.5.6.3 バルデナフィルとの併用毒性試験 ... 55 2.6.6.9.6 不純物の毒性 ... 55 2.6.6.9.6.1 原薬及び製剤中の不純物の毒性評価 ... 55 2.6.6.9.6.2 製造中間体 の Ames 試験 ... 56 2.6.6.9.7 その他の試験 ... 57 2.6.6.9.7.1 3T3 NRU（ニュートラルレッド取り込み）光毒性試験 ... 57
2.6.6.9.7.2 局所リンパ節試験／皮膚反応の識別のための統合モデル
（LLNA/IMDS） ... 57 2.6.6.10 考察及び結論 ... 58 2.6.6.11 引用文献一覧 ... 81
2.6.6
毒性試験の概要文
2.6.6.1
まとめ
リオシグアト（BAY 63-2521）の毒性及びトキシコキネティクスの特性を明らかにするために、 包括的な毒性試験プログラムを実施した。プログラムは、リオシグアトの長期使用に対する現行 の毒性試験法ガイドライン並びに規制要件に従った。毒性試験プログラムの概要を表 2.6.6.1-1及び 2.6.7.1 に示す。 最大推奨臨床用量（MRHD）は 2.5mg の 1 日 3 回経口投与（7.5mg／日）である。非臨床におけ るリスク評価及び安全域の推定は、この推奨される最大 1 日用量に基づいて行った。 臨床適用経路に従い、動物試験の投与経路は経口とした。単回投与毒性試験はマウス及びラッ トを用いて実施した。患者への長期投与を支持するための反復投与毒性試験は、投与期間がラッ トで最長 26 週間まで、イヌで最長 52 週間までの試験により評価した。非げっ歯類の動物種とし て、代謝及び動態プロファイルがヒトに類似しており、更にリオシグアトの薬理学的作用に応答 するイヌを使用した。 また、広範な遺伝毒性試験に加えて一連の生殖発生毒性試験をラット及びウサギを用いて実施 した。 短期パイロット試験を含む投与期間が 13 週間までのマウス及びラットによる用量設定試験を 実施し、がん原性試験の投与量、投与用調製物及び投与経路を設定し、ラット及びマウスを用い てリオシグアトの 2 年間投与によるがん原性試験を実施した。 ヒトにおける絶対的バイオアベイラビリティ試験を支持するために、ウサギを用いてリオシグ アトの静脈内投与による局所刺激性試験を実施した。加えて、冠状動脈内投与によるリオシグア トの局所刺激性を評価する試験を実施した。 リオシグアトは 290～720nm の波長範囲で軽微な光吸収を示すことから、in vitro 光毒性試験 及び局所リンパ節試験を実施した。 更に、リオシグアトの主代謝物である M-1（BAY 60-4552）については別の化合物として臨床 開発中であったことから、包括的な毒性試験プログラム（表 2.6.6.1- 2）を実施した。 主要な試験のすべては GLP に準拠して実施した。特に断らない限り、試験はすべて Bayer HealthCare 社毒性部門（ブッパタール、ドイツ）にて実施した。表 2.6.6.1- 1 リオシグアトの毒性試験一覧 Type of Study/
Treatment duration
Species &
Strain Method of Admin. Doses/Concentrations GLP Report No. Single-Dose Toxicity
Single-dose
toxicity Mouse, NMRI Oral, Intravenous Oral: up to 2000 mg/kgIV: up to 200 mg/kg Yes PH-33139 Single-dose
toxicity Rat, Wistar Oral up to 2000 mg/kg Yes PH-33139 Repeat-Dose Toxicity
2-week Mouse, CD-1 Oral,
feeding 0, 50, 200, 800 ppm No PH-34519 13-week Mouse, CD-1 Oral,
feeding 0, 16, 80, 400 ppm Yes PH-34866 13-week Mouse, CD-1 Oral,
feeding 0, 200 ppm Yes PH-34865 2-week Rat, Wistar Oral,
feeding 0, 50, 200, 800 ppm No PH-34791 4-week Rat, Wistar Oral 0, 1.5, 5, 15, 30 mg/kg Yes PH-33408 13-week Rat, Wistar Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH-34674 13-week Rat, Wistar Oral,
feeding 0, 4, 20, 100 mg/kg Yes PH-34877 26-week Rat, Wistar Oral 0, 2.5, 10, 40 mg/kg Yes PH-35002 4-week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 (bid) mg/kg Yes PH-33454 13-week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH-34778 26-week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH-35050 52-week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes A45725a
Genotoxicity
Ames Test Salmonella strains
In vitro Up to 5000 µg/plate Yes PH-33132 Cytogenetics in
vitro V79 cells
In vitro Up to 450 µg/ml Yes PH-33094 Micronucleus
Test Mouse, NMRI Intra-peritoneal 0, 100, 200, 400, 800 mg/kg Yes PH-33313 Cytogenetics in
vivo Mouse, NMRI Intra-peritoneal 0, 200, 400, 800 mg/kg Yes PH-33314 Carcinogenicity
2-year Mouse, CD1 Oral,
feeding 0, 50, 100, 200 ppm Yes PH-36818 2-year Rat, Wistar Oral,
feeding 0, 5, 10, 20 mg/kg Yes PH-36817
表 2.6.6.1- 1 リオシグアトの毒性試験一覧（続き） Type of Study/
Treatment duration
Species &
Strain Method of Admin. Doses/Concentrations GLP Report No. Reproductive and Developmental Toxicity
Fertility and early develop-mental toxicity
Rat, Wistar Oral, 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH-33564
Developmental
toxicity Rat, Wistar Oral 0, 1, 5, 25 mg/kg Yes PH-34563 Developmental
toxicity Rabbit, Himalayan Oral 0, 0.5, 1.5, 5 mg/kg Yes PH-34628 Pre- and
postnatal development
Rat, Wistar Oral 0, 1.5, 5, 15 mg/kg Yes PH-36162
Juvenile Animal studies
2-week Rat, Wistar Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg No PH-36257 4/13/14-week Rat, Wistar Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH-36659 Local Tolerance
Single Dose Rabbit, New Zieland White
Intravenous 25 ml of clinical formulation used in the total BA study
Yes A42058 a
Single Dose Dog, Mongrel
Intra-coronary
10 ml of clinical formulation used in the total BA study
No PH-36244
Other Studies
3T3 NRU test Mouse fibroblasts (3T3.A31 cells)
In vitro Up to 300 µg/mL Yes PH-33704
LLNA/IMDS Mouse,
NMRI Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH-33511 Chronic
mecha-nistic study on bone findings
Rat, Wistar Oral 0, 10, 50/25 mg/kg Yes A43289a
表 2.6.6.1- 2 代謝物 M-1（BAY 60-4552）の毒性試験一覧 Type of Study/
Treatment duration
Species &
Strain Method of Admin. Doses/Concentrations GLP Report No. Single-dose toxicity
Single dose
toxicity Mouse, NMRI Oral,Intravenous Oral: 2000 mg/kgIV: up to 200 mg/kg Yes PH-34362 Single dose
toxicity
Rat, Wistar Oral 2000 mg/kg Yes PH-34362 Repeat-dose toxicity
2-week Mouse, CD-1 Oral,
feeding 0, 150, 500, 1500 ppm No PH-36240 14-week Mouse, CD-1 Oral,
feeding 0, 100, 300, 1000 ppm Yes PH-35973 2-week Rat, Wistar Oral,
feeding 0, 150, 500, 1500 ppm No PH-36027 4-week Rat, Wistar Oral 0, 4, 20, 100 mg/kg Yes PH-34599
Version 2 13-week Rat, Wistar Oral M: 0, 5, 15, 50 mg/kg
F: 0, 10, 30, 100 mg/kg
Yes PH-35365 13-week +
4-week rec.
Rat, Wistar Oral M: 0, 50 mg/kg F: 0, 100 mg/kg
Yes PH-35978 13-week Rat, Wistar Oral 0, 10, 30, 100 mg/kg Yes PH-35987 28-week Rat, Wistar Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH-35976 4-week
combination study with vardenafil
Rat, Wistar Oral 0,1, 5 mg/kg Yes A46694 a
2-week Dog, Beagle Oral 0, 1, 3, 10 mg/kg Yes PH-34800 4-week Dog, Beagle Oral 0, 0.5, 1.5, 5 mg/kg Yes PH-34862 13-week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH-36085 39-week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH-35948 Genotoxicity
Ames test Salmonella strains
In vitro Up to 5000 µg/plate Yes PH-34328 Cytogenetics
in vitro
V79 cells In vitro Up to 400 µg/mL Yes PH-34346 Micronucleus test Mouse, NMRI Intra-peritoneal 0, 25, 50, 100 mg/kg Yes PH-34356
表 2.6.6.1- 2 代謝物 M-1（BAY 60-4552）の毒性試験一覧（続き） Type of Study/
Treatment duration
Species &
Strain Method of Admin. Doses/Concentrations GLP Report No. Reproductive and developmental toxicity
Fertility & early embryonic development
Rat, Wistar Oral 0, 1, 4, 20, 100 mg/kg Yes PH-34932 PH-34989
Embryo-fetal
development Rat, Wistar Oral 0, 2, 10, 50 mg/kg Yes PH-35958 Embryo-fetal
development Rabbit, Himalayan Oral 0, 0.5, 1.5, 5 mg/kg Yes PH-35750 Phototoxicity 3T3 test Mouse fibroblasts (3T3.A31 cells) In vitro Up to 125 µg/mL Yes PH-34554 Mechanistic studies
3-day Rat, Wistar Oral M: 15, 50 mg/kg F: 30, 100 mg/kg
No PH-36334 13-week Rat, Wistar Oral F: 0, 100 mg/kg Yes PH-35975
以下にリオシグアトの非臨床安全性プロファイルを要約する。 リオシグアトの単回経口投与及び単回静脈内投与により、非特異的な毒性徴候が認められた のみであった。高用量で認められた臨床症状及び死亡は、リオシグアトの過剰な血行動態作 用に関連したものと考えられた。 単回及び反復投与による毒性発現は雌雄間で質的及び量的に大差はなかった。 反復投与による毒性プロファイルは細胞内 cGMP 増加に伴う二次的な影響として特徴付けら れる。試験したすべての動物種で、この薬理学的作用機序の結果として過度の平滑筋弛緩に 起因した影響が観察された。 - マウスでは、高用量で血行動態作用による死亡が認められた。試験したほぼすべて の用量で、平滑筋弛緩に続く消化管の運動性低下による消化管不忍容が認められた。 この慢性的な運動性低下の結果として、腸内毒素症及び粘膜の変性／再生を伴う慢 性炎症が認められた。 - ラットでは、血行動態作用及びそれに続発する変化、並びに幼若及び若齢ラットに おける骨の代謝及び形態の変化が認められた。骨所見は成長が完了した成体ラット にはみられなかったことから、この成長期の動物に認められた骨所見は、成人患者 集団に対しては問題になるものではないと考えられる。 - イヌでは、消化管及び心血管系が平滑筋弛緩に関連する作用機序に最も感受性が高 かった。
リオシグアトは妊孕性及び初期胚発生に影響しなかった。 主に母動物の忍容性、及び胚・胎児並びに出生前後発生がリオシグアトの薬理学的特性によ る影響を受けた。ラット胎児に心臓奇形の増加が認められたが、リオシグアトの血行動態作 用及び心臓発生期における間葉系細胞への影響によるものと推察される。 幼若動物試験では、成体ラットでの試験と比較して新たな毒性所見及び毒性標的臓器はみら れなかった。 リオシグアトは広範な
in vitro
及びin vivo
遺伝毒性試験バッテリーにおいて陰性であっ たことから、患者に対する遺伝毒性リスクはないものと考えられる。 マウスがん原性試験において、リオシグアト投与により大腸の前腫瘍性及び腫瘍性病変が増 加した。これは消化管の平滑筋弛緩により生じた、慢性的な運動性低下、腸内毒素症、慢性 炎症、粘膜の変性、再生及び再生性過形成、更には腫瘍に至る二次的な影響と考えられ、マ ウスにおいてよく知られた病理発生機序である。 ラットでは、投与に関連した総腫瘍発現率又は個々のタイプの腫瘍発現率の増加は認められ なかった。 マウスにおいてよく知られた消化管腫瘍の発生機序、ラットではがん原性を示唆する徴候は みられなかったこと、イヌでは一般状態観察で明らかな消化管の運動性障害が認められたに もかかわらず消化管に炎症性変化が生じなかったこと、及びリオシグアトの臨床試験におい て腸の慢性的な炎症性変化が認められなかったことを考慮すると、ヒトに対するがん原性リ スクはないものと考えられる。 ヒト、ラット、マウス及びイヌにおいて、リオシグアトの酸化的代謝によって主代謝物 M-1 （BAY 60-4552）が生じる。すべての主要なリオシグアトの毒性試験において、リオシグア トの最大推奨臨床用量の 7.5mg 投与時のヒトでの M-1 曝露量を超える曝露が動物で確認され た。加えて、M-1 は別の新規化合物として開発中であったことから、広範なin vitro
及びin vivo
の毒性試験において評価した。全般的に M-1 の毒性プロファイルはリオシグアトと 同様であった。ラットに対して、ヒト曝露量の 37 倍以上（AUC）及び 115 倍以上（Cmax）の高 曝露レベル（いずれもたん白結合率の種差を考慮し補正）の M-1 投与により、腎毒性が認め られた。しかしながら、M-1 の腎毒性に対して 13 倍の安全域があること、及びリオシグアト では全く問題とならない腎臓の安全性プロファイルを考慮すると、ヒトに対する危惧はない ものと考えられる。 総括すると、非臨床安全性評価に適切と考えられるマウス、ラット及びイヌを用いた単回及び 反復投与毒性試験において、リオシグアトは臓器特異毒性を示さなかった。認められた影響は主 に細胞内 cGMP 濃度の上昇に伴うリオシグアトの過度の薬理作用によるものと考えられる。遺伝 毒性試験、幼若動物試験及びがん原性試験では、特に危惧すべき所見はなかった。生殖発生毒性 試験では、ラット胎児で心臓奇形が増加した。この所見は、リオシグアト固有の催奇形性という よりも、発生段階の心臓に対する血行動態又は間葉系細胞に対する本薬の薬理作用に起因した可 能性が考えられるが、リオシグアトは妊婦には禁忌とすべきである。2.6.6.2
単回投与毒性試験
2.6.6.2.1
げっ歯類を用いた単回投与毒性試験
参照項目：4.2.3.1.1 PH-33139 リオシグアトの急性毒性を、ラット〔系統：Wistar (Hsd Cpb:WU)〕を用いて経口投与により、 また、マウス（系統：Hsd WIN: NMRI）を用いて経口投与及び静脈内投与により検討した。経口 投与ではリオシグアト（バッチ ）を 0.5％Tylose®水溶液に懸濁し、投与容量 10mL/kg で 強制経口投与した。静脈内投与ではリオシグアト（バッチ ）を PEG 400 を用いて調製し、 投与容量は 5mL/kg とした。 経口投与及び静脈内投与後に、リオシグアトに特異的な毒性症状は認められなかった。剖検に おいても、投与に関連した所見は認められなかった。 最大非致死量、最小致死量及び概略の致死量を表 2.6.6.2- 1に示す。ラット及びマウスを用 いた単回投与毒性試験の結果、ラット及びマウスへの経口投与により 300mg/kg まで死亡は認め られなかった。 表 2.6.6.2- 1 ラット及びマウスを用いた急性毒性試験の結果 Species Sex Route ofadministration Approximate lethal dose [mg/kg] Highest non-lethal dose [mg/kg] Lowest lethal dose [mg/kg] Mouse F Oral 300< <2000 300 2000 Rat F Oral 300< <2000 300 2000 Mouse F Intravenous 30 n.e. 30 n.e.= not established
2.6.6.2.2
非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験
参照項目：4.2.3.2.9 PH-33454 非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験は実施しなかった。そのため、イヌを用いた 4 週間反復 経口投与毒性試験（2.6.6.3.3.1）における初回投与後又は投与初期の所見により、リオシグア トの非げっ歯類における急性毒性を評価した。 イヌ 4 週間反復投与毒性試験では、1 群雌雄各 3 例のビーグル犬（系統：Bor:BEAG）にリオシ グアトの 0、0.3、1 及び 3mg/kg を 1 日 2 回投与（0、0.6、2 及び 6mg/kg/日）した。リオシグア トは 0.5％Tylose®水溶液に懸濁し、投与容量 5mL/kg で強制経口投与した。 リオシグアトは 2mg/kg/日の用量まで良好な忍容性を示し、投与に関連した毒性症状は何ら認 められなかった。高用量の 6mg/kg/日で、投与初期から全身状態の悪化、筋肉の痙攣、流涎、嘔 吐の増加、肛門しぶり及び不安定歩行が観察された。死亡は 6mg/kg/日の用量まで認められな かった。 以上の結果より、イヌにおける単回経口投与時の概略の致死量は 6mg/kg/日を超える用量と判 断された。2.6.6.3
反復投与毒性試験（トキシコキネティクス評価を含む）
2.6.6.3.1
マウスを用いた反復投与毒性試験
マウスを用いたがん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために、リオシグアトの混 餌投与による 13 週間投与試験を実施した。そのパイロット試験として、マウスを用いた 2 週間 混餌投与試験を実施した。 マウスにおける毒性プロファイルは、平滑筋弛緩に起因した消化管の運動性低下による胃・腸 の不忍容及び過度の血行動態作用（高用量では死亡をもたらした）により特徴付けられるもので あった。2.6.6.3.1.1
マウス 2 週間混餌投与試験
参照項目：4.2.3.2.1 PH-34519 2 週間混餌投与によるパイロット試験（非 GLP）において、1 群雌雄各 5 例のマウス〔系統： Crl:CD-1(ICR)BR〕に、リオシグアトを 0、50、200 及び 800ppm の濃度で混餌投与した。トキシ コキネティクス評価のためにサテライト群として、各薬物投与群ともに雌雄各 15 例（1 採血時 点当たり 3 例）を設けた。 一般状態を 1 日 2 回観察し、体重、摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した。臨床検 査用の血液検体を投与 2 週に採取した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量 測定を実施した。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。 200ppm までマウスの生存性及び一般状態（体重を含む）への影響はみられなかった。50 及び 200ppm の雄各 1 例が死亡したが、死因を示唆する所見がみられず偶発的なものと考えられた。 800ppm で全身状態の悪化及び腹部膨満が投与開始後 3 日以内に出現し、この群では全例が計画 屠殺前に死亡した。50ppm 以上の雄で軽度な摂餌量減少、及び 200ppm の雌で摂水量減少が認め られた。200ppm の雄で赤血球数が軽度に減少し、網赤血球数が増加した。200ppm の雌で白血球 数減少がみられた。50ppm 以上の雄及び 200ppm の雌で肝臓重量の軽度増加が、200ppm の雌雄で 脾臓の肥大及び脾臓重量の増加が認められた。200ppm で血漿中のコレステロール、トリグリセ リド及び尿素の減少が、また肝組織中の酵素活性の軽度な変動（CA-T 増加、GLU-T 減少）が認め られた。特記すべき病理組織学的所見として、50ppm 以上の雌雄に小腸の拡張及び上皮の扁平化、 800ppm の雌に大腸粘膜の炎症、及び雌雄に腎臓の遠位尿細管の軽微な肥大が認められた。 200ppm の雌に小腸のパネート細胞の明瞭化が認められ、雄に脾臓の髄外造血亢進が認められた。 800ppm を投与した数例の動物に、大腿骨の成長板の軽微な肥厚が観察された。 以上の結果より、50ppm で認められた軽度な摂餌量減少及び肝臓重量増加（いずれも雄のみ）、 及び小腸の変化（薬理作用によると考えられる）は毒性変化ではないと考え、本試験における無 毒性量は 50ppm と判断された。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 1に要約する。表 2.6.6.3- 1 マウス 2 週間混餌投与試験におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量（雌雄合算） Dose [ ppm] 50 200 800 a Dose [mg/kg] 23.5 85.7 AUC(0-24) [µg·h/L] 1376 5860 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 0.0587 0.0684 Cmax [µg/L] 89.1 379 Cmax, norm [kg/L] 0.00380 0.00443 tmax [h] 7.00 7.00 RA1 [%] 57.8 48.3 RA3 [%] 65.5 48.0 MR [%] 13.1 18.7
RA1= Cmax, Day12/ Cmax, Day 2
RA3= AUC(0-24), Day 12/ AUC(0-24), Day 2
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/riociguat AUC(0-24)norm aNo data available for 800 ppm
Source: 4.2.3.2.1, PH-34519
2.6.6.3.1.2
マウス 13 週間混餌投与試験（1 回目）
参照項目： 4.2.3.2.2 PH-34866 がん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために、1 群雌雄各 10 例のマウス〔系 統：Crl:CD-1(ICR)BR〕を用いて 13 週間混餌投与試験を実施した。トキシコキネティクス評価の ためのサテライト群として、各薬物投与群共に雌雄各 15 例（1 採血時点当たり 3 例）を設けた。 マウスには 0、16、80 及び 400ppm の濃度でリオシグアト（バッチ ）を混餌投与した。 用量はマウス 2 週間混餌投与試験（4.2.3.2.1 PH-34519）に基づいて選択した。 一般状態を 1 日 2 回観察し、体重、摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した。血液学 的検査を投与 11 週、血液化学的検査を投与 13 週に実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺 し、剖検及び臓器重量測定を実施した。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学 的検査を実施した。トキシコキネティクス評価用の採血を投与 2 日目及び投与期間終了時に行っ た。 1 日当たりの薬剤摂取量を表 2.6.6.3- 2に示す。 リオシグアトは 80ppm まで良好な忍容性を示した。400ppm でリオシグアトの平滑筋弛緩作用 又はそれに伴う消化管の運動抑制に起因した蒼白、腹囲増加、腹部膨満及び全身状態の悪化が認 められ、薬物投与に起因する死亡が雌雄に認められた。400ppm で摂水量減少がみられた。血液 学的検査において、400ppm で赤血球パラメータの減少がみられ、網赤血球数の増加並びに脾臓 及び肝臓における髄外造血の増加を伴っていた。また、白血球数、好中球数、異型リンパ球数及 び血小板数の増加並びにリンパ球数の減少が認められた。更に 400ppm では骨髄における造血亢 進が認められ、剖検では、腸の拡張、伸長及び内容物変化に加え、重量増加を伴う脾臓の肥大が 観察された。病理組織学的検査では、400ppm の雌に盲腸の炎症が認められた。400ppm の雄及び 80ppm 以上 の雌で、適応性の酵素誘導を示唆する肝臓重量の増加及び軽微～軽度の肝細胞肥大が認められた。 肝臓における単細胞壊死が 400ppm の雌雄の各 1 例に観察された。また、400ppm の雄及び 80ppm 以上の雌に小腸のパネート細胞の明瞭化が観察された。400ppm の雌で心臓重量の減少が認めら れ、リオシグアトの血管拡張作用及び／又は全身状態悪化に伴う心臓の脂肪組織の萎縮に関連し たものと考えられた。更に 400ppm で、血漿たん白や尿素の減少及び様々な臓器の重量減少や萎 縮性変化が観察された。これらはこの用量で発現した顕著な毒性に起因した二次的なものと考え られ、リオシグアトに特異的な臓器毒性を示すものではないと考えられた。 以上の結果より、80ppm における肝臓及び小腸への影響はそれぞれ適応反応及び薬理作用によ るもので毒性変化ではないと考え、マウスに 13 週間混餌したときの無毒性量は、雌雄共に 80ppm と判断された。400ppm で腸の炎症性変化及び過度の血行動態作用が認められ、投与に関連 した死亡が認められた。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 2に要約する。 表 2.6.6.3- 2 マウス 13 週間混餌投与試験（1 回目）におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量
Sex Males Females
Dose [ ppm] 16 80 400 a 16 80 400a Dose [mg/kg] 2.6 15.8 85.8 5.8 23.6 124.1 AUC(0-24) [µg·h/L] 390 2211 11359 478 2848 10628 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 0.163 0.127 0.144 0.0884 0.0940 0.0958 Cmax [µg/L] 22.8 130 559 24.6 193 711 Cmax,norm [kg/L] 0.00949 0.00749 0.00710 0.00455 0.00637 0.00641 Cmin/Cmaxa [%] 39.8 36.8 59.5 63.2 29.8 41.8 tmax [h] 14.0 4.00 14.0 7.00 4.00 7.00 RA1 [%] 64.3 72.1 n.c. 194 150 n.c. RA3 [%] 77.8 77.6 n.c. 291 135 n.c. MR [%] 15 18 n.c. 13 15 n.c.
RA1= Cmax, Day86/Cmax, Day 2
RA3= AUC(0-24), Day 86/AUC(0-24), Day 2
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm aDay 2 data only, n.c.= not calculated
Source: 4.2.3.2.2, PH-34866
2.6.6.3.1.3
マウス 13 週間混餌投与試験（2 回目）
参照項目： 4.2.3.2.3 PH-34865 前述のマウス 13 週間混餌投与試験（2.6.6.3.1.2 参照）では、400ppm で投与に関連した死亡 が生じ、明らかに最大耐量（MTD）を超えていた。一方、80ppm では明らかな毒性は認められな かった。マウスにおける MTD により近い用量を明確にするために、200ppm の単一用量での 13 週 間混餌投与による追加試験を、1 群雌雄各 10 例のマウス〔系統：Crl:CD-1(ICR)BR〕を用いて実 施した。トキシコキネティクス評価のためのサテライト群として、各群ともに雌雄各 15 例（1 採血時点当たり 3 例）を設けた。検査項目は 1 回目の試験と同一とした。1 日当たりの薬剤摂取量とトキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 3に示す。 表 2.6.6.3- 3 マウス 13 週間混餌投与試験（2 回目）における
リオシグアトの定常状態での曝露量
Sex Males Females
Dose [ ppm] 200 200 Dose [mg/kg] 41.95 67.18 AUC(0-24) [g·h/L] 4942 4305 AUC(0-24) norm [kg·h/L] 0.152 0.0904 Cmax [g/L] 299 336 Cmax, norm [kg/L] 0.00918 0.00705 Cmin/Cmax [%] 41.1 34.6 tmax [h] 7.00 4.00 RA1 [%] 60.5 58.6 RA3 [%] 54.3 41.9 MR [%] 22.5 19.5
RA1= Cmax, Day88/Cmax, Day 2
RA3= AUC(0-24), Day 88/AUC(0-24), Day 2
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
Source: 4.2.3.2.3, PH-34865 リオシグアトは、低頻度でみられた腹部膨満及び腸の拡張及び伸長を除き、臨床的に良好な忍 容性を示した。病理組織学的検査では、一部の動物に空腸及び回腸のパネート細胞の明瞭化が認 められたが、毒性を示唆する所見は認められなかった。肝臓重量の増加に対応する軽微～軽度の 肝細胞肥大が雌雄に認められた。また、網赤血球数増加、脾臓の肥大／重量増加及び髄外造血に 反映される赤血球生成の活性化が認められた。 要約すると、リオシグアト 200ppm の混餌投与は明らかな毒性所見を示さず忍容性は全般的に 良好であった。
2.6.6.3.2
ラットを用いた反復投与毒性試験
リオシグアトの主要な反復投与毒性試験として、強制経口投与による 26 週間までの試験を実 施した。また、ラットを用いたがん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために、リオ シグアトの混餌投与による 2 週間投与試験及び 13 週間投与試験を実施した。2.6.6.3.2.1
ラット 2 週間混餌投与試験
参照項目： 4.2.3.2.4 PH-34791 混餌投与による 2 週間投与試験（非 GLP）では、1 群雌雄各 5 例のラット〔系統：Wistar (Hsd Cpb:WU)〕にリオシグアトを 0、50、200 及び 800ppm の濃度で混餌投与した。これらの濃度は 1 日当たりの投与量として、それぞれ雄で 5.2、22.5 及び 99.0mg/kg、雌で 7.2、30.4 及び 101.2mg/kg に相当する。薬物投与群に対して、トキシコキネティクス評価のためのサテライト 群として、各群ともに雌雄各 6 例（1 採血時点雌雄各 3 例）を設けた。一般状態を 1 日 2 回観察し、体重、摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した。臨床検 査を投与 2 週に実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施し た。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。 800ppm まで死亡はみられなかった。800ppm の雌雄で体重増加抑制が認められた。一般状態観 察では、800ppm で腹部膨満とこれに関連する消化管の肉眼及び病理組織所見（腸拡張など）、 及び皮膚(耳)の発赤が観察された。800ppm で血管拡張作用に起因した陰茎勃起が認められた。 200ppm 以上で雌の摂水量が増加した。また、800ppm で摂餌量の軽度な変動（雄で増加、雌で減 少）がみられた。血液化学的検査における特記すべき所見として、800ppm の雄でクレアチニン の軽度増加、及び雌雄で総ビリルビンの増加が認められた。病理組織学的検査では、200ppm 以 上の雄、及び 800ppm の雌に肝細胞の軽微～軽度な細胞質変化／肥大が認められた。また、体重 増加抑制に起因したと考えられる肝細胞の蓄積脂肪の減少が 800ppm の雄に認められた。 以上の結果より、ラットに 2 週間混餌投与したときの無毒性量は、800ppm での体重増加抑制 に基づき 200ppm と判断された。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 4に要約する。 表 2.6.6.3- 4 ラット 2 週間混餌投与試験におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量（雌雄合算） Dose [ ppm] 50 200 800 AUC(0-20) [µg·h/L] 872 3034 18675 AUC(0-20)norm [kg·h/L] 0.141 0.115 0.187 Cmax [µg/L] 54.3 279 1408 Cmax, norm [kg/L] 0.00875 0.0106 0.0141 RA1 [%] 85.7 133 168 RA3 [%] 89.9 97.5 160
RA1= Cmax, Day14/ Cmax, Day 2
RA3= AUC(0-20)norm, Day 14/ AUC(0-20), Day 2
Source: 4.2.3.2.4, PH-34791
2.6.6.3.2.2
ラット 4 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.5 PH-33408 強制経口投与による 4 週間投与試験を、ラット〔系統：Wistar (Hsd Cpb:WU)〕を用いて実施 した。リオシグアト（バッチ ）の投与量は 0、1.5、5、15 及び 30mg/kg/日とした。リオ シグアトを 0.5％Tylose®水溶液に懸濁し、投与容量は 10mL/kg とした。ラットは、1 群雌雄各 10 例からなる対照群（媒体投与）及び 4 薬物投与群に無作為に配置した。また、トキシコキネ ティクス評価用に各群にサテライト群（1 採血時点雌雄各 3 例）を設けるとともに、対照群及び 高用量群に投与後 2 週間休薬による回復試験群（雌雄各 10 例／群）を設定した。 一般状態観察、及び体重、摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施した。トキシコ キネティクス評価は投与 1 日目及び 29 日目に実施し、投与後 0.5、1、2、4、7 及び 24 時間に採 血した。臨床検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与 4 週（主試験群）及び回 復期間終了時に実施した。投与期間及び回復期間終了時にそれぞれ生存動物を屠殺し、剖検及び 臓器重量測定を実施した。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。剖検時に肝臓組織を採取し、ホモジネートした肝臓組織中の酵素活性を測定した。さらに、 免疫毒性学的検査を実施した。 リオシグアトは、1.5mg/kg 以上の雌で網赤血球数増加を伴う赤血球パラメータの軽微な増加 がみられたが、5mg/kg まで概ね良好な忍容性を示した。一般状態観察において、30mg/kg で陰茎 勃起及び一過性の体重増加抑制が認められた。血清中カルシウム濃度が統計学的に有意に増加し たが（雄：15mg/kg 以上、雌：1.5mg/kg 以上）、用量との関連はみられなかった。30mg/kg の雌 雄で血清中カリウム濃度の軽度な減少が認められた。5mg/kg 以上の雄で血漿中の尿素が増加し たが、尿細管損傷の指標となる尿中 LDH は増加しておらず、むしろわずかな減少を示した。回復 群では、赤血球パラメータの軽微な増加（網赤血球は減少）がわずかに認められたが、血液化学 的検査及び尿検査において影響はみられなくなった。 肝臓相対重量の可逆的な増加（雄：5mg/kg 以上、雌：30mg/kg）及び肝細胞の軽微～軽度な細 胞質の変化（雄：5mg/kg 以上、雌：15mg/kg 以上）は毒性ではなく適応性の変化と考えられる。 30mg/kg の雄で副腎重量増加及び雌で脾臓重量増加が認められた。15mg/kg 以上の雄で胸腺重量 の低下がみられたが、この試験で行った免疫毒性に関する評価では 30mg/kg まで免疫系への影響 は認められなかった。いずれの変化も回復群では認められなかった。 病理組織学的検査では、15mg/kg 以上で大腿骨成長板の肥厚（雄）及び腸間膜リンパ節におけ る組織球の増加が認められた。回復群では、大腿骨成長板の肥厚（雄）は頻度が減少し、腸間膜 リンパ節における組織球の増加は認められなかった。 以上の結果より、ラットに 4 週間投与したときの無毒性量は、大腿骨成長板及び腸間膜リンパ 節の組織学的変化を毒性所見と捉え、5mg/kg/日と判断された。 トキシコキネティクスデータでは、ほぼ用量に比例した曝露の増加がすべての用量で認められ た。その結果を表 2.6.6.3- 5に示す。 表 2.6.6.3- 5 ラット 4 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量
Sex Males Females
Dose [mg/kg] 1.5 5 15 30 1.5 5 15 30 AUC(0-24) [g·h/L] 394 1140 3795 9723 370 1244 3035 6766 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 0.263 0.228 0.253 0.324 0.247 0.249 0.202 0.226 Cmax [g/L] 59.1 159 428 1173 80.1 207 397 1086 Cmax,norm [kg/L] 0.039 0.032 0.029 0.039 0.053 0.041 0.027 0.036 C(24)/Cmax [%] n.c. 0.344 0.765 2.41 n.c. 0.271 1.59 2.75 tmax [h] 1.00 1.00 4.00 1.00 1.00 1.00 0.50 1.00 RA1 [%] 113 126 143 219 142 132 132 212 RA3 [%] 164 166 151 133 133 111 112 126
RA1= Cmax, Day 29/ Cmax, Day 1
RA3= AUC(0-24), Day 29/ AUC(0-24), Day 1
n.c. = not calculated
2.6.6.3.2.3
ラット 13 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.6 PH-34674 強制経口投与による 13 週間反復投与試験を、ラット〔系統：Wistar (Hsd Cpb:WU)〕を用いて 実施した。リオシグアト（バッチ ）の投与量は 0、3、10 及び 30mg/kg/日とした。リオ シグアトを 0.5％Tylose®水溶液に懸濁し、投与容量は 10mL/kg とした。ラットは、1 群雌雄各 10 例からなる対照群（媒体投与）及び 3 薬物投与群に無作為に配置した。また、トキシコキネ ティクス評価用（1 採血時点雌雄各 3 例）及び免疫毒性評価用（雌雄各 8 例／群）に動物を追加 した。投与量は 4 週間試験（2.6.6.3.2.2 参照）の結果に基づいて選択した。 一般状態観察及び体重、摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施し、また眼科学的 検査を実施した。トキシコキネティクス評価は投与 1 日目及び 91 日目に行い、薬物投与群では 投与後 0.5、1、2、4、7 及び 24 時間に、対照群では投与後 1、7 及び 24 時間に採血した。臨床 検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与 5 週及び 13 週目に主試験群の全例に ついて実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施した。摘出 した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。主試験群の動物から脾臓 検体及び血液検体を採取し、FACS（Fluorescence Activated Cell Scan）解析及び免疫グロブリ ン測定に使用した。免疫毒性学的検査に供した動物について、ヒツジ赤血球で免疫した後にプ ラークアッセイを実施した。 一般状態観察において、耳の発赤（10mg/kg 以上）、一過性の陰茎勃起（30mg/kg）及び体温 の軽度低下（30mg/kg の雄）が観察された。10mg/kg 以上の雌で立ち上がり回数が減少し、高用 量群の雄では活動性の軽度低下が認められた。更に、30mg/kg の雄で軽度の体重増加抑制及び削 痩が認められた。10mg/kg 以上の雄及び 30mg/kg の雌で摂水量の増加が観察された。雌では、 3mg/kg 以上でみられた骨髄細胞の活性化を反映したヘマトクリット値、赤血球数及びヘモグロ ビン濃度の軽度増加が認められた。また、30mg/kg の雌に単球数及び異型白血球数の軽度増加が 認められた。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の約 20％程度の増加が単発的に認めら れたが（30mg/kg の雄）、生物学的に意味がないものと考えられた。3mg/kg 以上の雄で血漿総た ん白濃度の低下及び 30mg/kg の雄でトリグリセライドの低下がそれぞれ軽度に認められた。また、 30mg/kg の雄及び 10mg/kg 以上の雌で血清中の無機リン濃度が軽度に上昇し、また 30mg/kg の雌 でカルシウム濃度が軽度に上昇した。尿検査では、10mg/kg 以上の雄で尿量が増加し、その結果 として尿比重及び尿素、クレアチニン及びたん白の尿中濃度が低下した。肝ホモジネートの解析 では、10mg/kg 以上の雌で第Ⅰ相薬物代謝酵素（EROD、ECOD、ALD、CA-T、EH）及び第Ⅱ相薬物 代謝酵素（GS-T、GLU-T）の増加が認められ、これに一致して肝臓相対重量の軽度増加及び肝細 胞の細胞質濃縮が認められた。30mg/kg の雄に認められた前立腺、精嚢腺及び精巣上体の絶対重 量の減少は、この用量でみられた体重増加抑制に関連したものと考えられる。免疫毒性学的検査 では投与による影響は認められなかった。 病理組織学的検査では、3mg/kg 以上の雄、及び 10mg/kg 以上の雌に副腎球状帯の肥大が認め られた。これに伴い 10mg/kg 以上の雌で副腎重量が増加した。3mg/kg 以上で骨髄における造血 亢進が認められた。10mg/kg 以上、特に 30mg/kg の雄で腸間膜静脈の血管間隙の拡張（網状変 化）が認められた。また、10mg/kg 以上でパネート細胞の空胞化が観察された。 以上の結果より、ラットに 13 週間投与したときの無毒性量は、体重増加抑制を毒性所見と捉 え雄で 10mg/kg/日、及び雌で 30mg/kg/日と判断された。 定常状態でのトキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 6に要約する。表 2.6.6.3- 6 ラット 13 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量
Sex Males Females
Dose [mg/kg] 3 10 30 3 10 30 AUC(0-24) [g·h/L] 827 4003 10388 1176 3651 10404 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 0.276 0.400 0.346 0.392 0.365 0.347 Cmax [g/L] 152 656 1686 212 849 1959 Cmax,norm [kg/L] 0.0506 0.0656 0.0562 0.0708 0.0849 0.0653 C(24)/Cmax [%] 0.828 2.06 2.79 4.73 4.30 2.76 tmax [h] 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 RA1 [%] 140.7 308.7 325.2 145.0 326.1 453.1 RA3 [%] 88.3 169.4 151.4 134.0 202.5 169.1 MR [%] n.c. 11.4 10.5 5.71 9.40 12.0 RA1= Cmax, Day 91/ Cmax, Day 1
RA3= AUC(0-24), Day 91/ AUC(0-24), Day 1
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
Source: 4.2.3.2.6, PH-34674
2.6.6.3.2.4
ラット 13 週間混餌（用量調整）投与試験
参照項目： 4.2.3.2.7 PH-34877 ラットを用いたがん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために、投与量を調整した 13 週間混餌投与試験を、ラット〔系統：Wistar (Hsd Cpb:WU)〕を用いて実施した。ラットは、 1 群雌雄各 10 例からなる対照群（純飼料）及び 3 薬物投与群に無作為に配置した。また、トキ シコキネティクス評価用（1 採血時点雌雄各 3 例）に動物を追加し、投与 3/4 日目及び 88/89 日 目にそれぞれ 4 時間間隔で 6 時点から採血した。主試験群とトキシコキネティクス評価用動物に はリオシグアト（バッチ ）を 13 週間混餌投与した。mg/kg 単位での一定した被験物質摂 取量を確保し、リオシグアトの投与量が 0、4、20 及び 100mg/kg となるように週単位で混餌濃度 を調整した。投与期間を通じての平均投与量は、雄で 3.9、20.2 及び 101.6mg/kg、雌で 4.0、 20.7 及び 105.3mg/kg であった。 一般状態観察及び体重、摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施し、また眼科学的 検査を実施した。臨床検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与 13 週に主試験 群の全例について実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施 した。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。剖検時に、肝 ホモジネート中の酵素活性を測定するために肝臓検体を採取した。 一般状態観察において、100mg/kg で腹部膨満及び下痢（雌雄）、陰茎勃起、るいそう、立毛、 鶏状歩行（以上、雄）及び粗毛（雌）が認められた。20mg/kg 以上の雄で体重増加抑制が認めら れた。この用量以上で摂餌量の増加が雌雄に認められた。また、100mg/kg の雄及び 20mg/kg 以 上の雌で摂水量の増加が認められた。赤血球パラメータ（20mg/kg 以上）及び網赤血球数 （4mg/kg 以上）が雌雄で軽度に増加した。20mg/kg 以上の雌で尿量が増加し、その結果として尿 比重、及び尿素及びクレアチニンの尿中濃度が低下した。血液化学的検査では、20mg/kg 以上で トリグリセリド、100mg/kg で総たん白及びカルシウム濃度がそれぞれ軽度に低下した。100mg/kg の雄で脳、副腎及び精巣、雌雄で脾臓のそれぞれ相対重量増加、及び雄で胸腺相対 重量減少が認められた。20mg/kg 以上の雌で肝臓相対重量増加が認められた。加えて、心臓相対 重量の増加（雄：100mg/kg、雌：20mg/kg 以上）、及び前立腺（20mg/kg 以上）及び精嚢腺 （100mg/kg）の相対重量の減少が認められた。 強制経口投与後と同様に、20mg/kg 以上（主に雌）で第Ⅰ相及び第Ⅱ相薬物代謝酵素の誘導が 認められた。 剖検では、腸の伸長（雄：4mg/kg 以上、雌：20mg/kg 以上）及び盲腸の拡張（雄：100mg/kg） が、一般状態観察でみられた腹部膨満に付随して認められた。 病理組織学的検査では、100mg/kg の雌雄に心臓の冠動脈の中膜肥厚及び腸間膜静脈の網状変 化に加え慢性進行性腎症の発現頻度低下が認められた。20mg/kg 以上で造血亢進（骨髄、 100mg/kg で脾臓）が認められ、4mg/kg 以上の雌雄に副腎球状帯の肥大が認められた。更に、パ ネート細胞の肥大（4mg/kg 以上の雌雄）、肝細胞の細胞質濃縮（雄：20mg/kg 以上、雌： 100mg/kg）、門脈周囲の蓄積脂肪の減少（20mg/kg 以上の雌雄）、門脈周囲炎（100mg/kg の雌） 及び腎臓における尿細管の色素沈着増加（雄：100mg/kg、雌：20mg/kg 以上）が観察された。 100mg/kg の雄に副甲状腺の細胞活性化／肥大、及び雌雄に胆管の活性化／過形成が認められた。 20mg/kg 以上の雄及び 100mg/kg の雌に大腿骨及び胸骨のリモデリング促進が認められた。 以上の結果より、ラットに 13 週間混餌投与したときの無毒性量は、4mg/kg における網赤血球 数の軽度増加及び副腎球状帯肥大は毒性所見ではないと考え、4mg/kg/日と判断された。 定常状態でのトキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 7に要約する。 表 2.6.6.3- 7 ラット 13 週間混餌（用量調整）投与試験におけるリオシグアトの定常状態での 曝露量 Male Female Dose [mg/kg] 4 20 100 4 20 100 AUC(0-24) [µg·h/L] 1059 5141 34058 983 4127 25786 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 0.294 0.306 0.439 0.317 0.277 0.300 Cmax [µg/L] 80.3 311 2013 57.5 258 1715 Cmax, norm [kg/L] 0.0223 0.0185 0.0259 0.0186 0.0173 0.0200 Cmin/Cmax [%] 18.6 29.3 29.5 26.8 37.1 32.3 tmax [h] 4.00 4.00 0.00 4.00 4.00 4.00 RA1 [%] 110 103 346 94.1 84.2 178 RA3 [%] 102 115 300 99.3 89.0 193 MR [%] 13.1 13.7 15.2 7.5 8.1 7.9 RA1= Cmax, Day88/ Cmax, Day 3
RA3= AUC(0-24), Day 88/ AUC(0-24), Day 3
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
2.6.6.3.2.5
ラット 26 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.8 PH-35002 強制経口投与による 26 週間投与試験を、ラット〔系統：Wistar (Hsd Cpb:WU)〕を用いて実施 した。ラットは、1 群雌雄各 20 例からなる対照群（媒体投与）及び 3 薬物投与群に無作為に配 置した。また、トキシコキネティクス評価用（1 採血時点雌雄各 3 例）に動物を追加した。リオ シグアト（バッチ ）の投与量は 0、2.5、10 及び 40mg/kg/日とした。リオシグアトは 0.5％Tylose®水溶液に懸濁し、投与容量は 10mL/kg とした。投与量はラットを用いた 4 週間投与 試験（2.6.6.3.2.2 参照）及び 13 週間投与試験（2.6.6.3.2.3 参照）の結果に基づいて選択し た。 一般状態観察及び体重、摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施した。また眼科学 的検査を投与開始前(全群)及び投与期間終了時（対照群及び高用量群）について実施した。臨床 検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与 12/13 週及び 25/26 週目に各群雌雄各 10 例について実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施し た。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。剖検時に、肝ホ モジネート中の酵素活性を測定するために肝臓検体を採取した。トキシコキネティクスの評価は 投与 1、28 及び 182 日目に実施した。血液検体は、薬物投与群では投与後 0.5、1、2、4、7 及び 24 時間に、対照群では投与後 1、7 及び 24 時間に採取した。 リオシグアトは全般的に良好な忍容性を示した。対照群及び高用量群の各雌１例が死亡したが、 死因はそれぞれ悪性リンパ腫（対照群）及び採血過誤（高用量群）によるものであり、投与によ る 死 亡 は 認 め ら れ なかった。 臨 床 的に 、 皮 膚 の 発 赤 （ 2.5mg/kg 以上の 雌 雄 ）、陰茎勃起 （10mg/kg 以上）、腹囲増加（40mg/kg の雌）、一過性の体重増加抑制（40mg/kg の雄）及び摂 水量増加（10mg/kg 以上の雌雄）が観察された。40mg/kg では投与 1 週に一過性の摂餌量減少が みられたが、それ以降は対照群と差はみられなかった。40mg/kg の雌に白血球数、リンパ球数及 び異型リンパ球数の増加がみられたが、免疫系の器官に形態学的に関連する変化を伴っていな かったことから、毒性とは考えられなかった。血液化学的検査では、用量に関連しないカリウム の軽度減少がすべての用量の雄に認められた。また、たん白及びトリグリセリド減少（40mg/kg の雄及び／又は雌）、尿素増加（10mg/kg 以上の雌雄）に加え、肝薬物代謝酵素の変動は毒性変 化ではなく、肝臓の機能変化を反映したものと考えられた。10mg/kg 以上の雌で血漿中 T3 が減 少したが、投与量との相関はなく、関連する組織学的変化を伴っていなかったことから、毒性と は考えられなかった。尿検査において、摂水量増加の結果として 40mg/kg で尿量増加及び尿比重 低下が認められた。 より短期間の試験と同様に、副腎の重量増加及び球状帯肥大が 10mg/kg 以上の雌雄に認められ た。10mg/kg 以上の雌で肝臓重量が増加した。40mg/kg の雌で脾臓及び腎臓の絶対重量の増加、 雄で前立腺、精嚢腺及び精巣上体の絶対重量の減少が認められた。 剖検では、腸の伸長（10mg/kg 以上の雌雄）及び盲腸の拡張（40mg/kg の雌）、また肝臓の肥 大（雄：2.5mg/kg 以上、雌：40mg/kg）が認められた。腸の変化については剖検所見に関連する 組織学的な変化を欠いていたが、肝臓では肝細胞の肥大及び細胞質変化（40mg/kg の雌）並びに 門脈周囲の蓄積脂肪の減少（雄：40mg/kg、雌：10mg/kg 以上）が認められた。腎臓において、 40mg/kg の雄及び 2.5mg/kg 以上の雌に尿細管の色素沈着の増加が認められた。10mg/kg 以上の雄 及び 40mg/kg の雌に大腿骨のリモデリングの促進及び過骨症が認められた。40mg/kg でパネート 細胞の明瞭化（雌）及び腸間膜静脈の網状変化（雌雄）が認められた。 以上の結果より、ラットに 26 週間投与したときの無毒性量は、骨の組織学的変化を毒性と捉 え、雄で 2.5mg/kg/日、雌で 10mg/kg/日と判断された。トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 8に要約する。
表 2.6.6.3- 8 ラット 26 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量
Sex Males Females
Dose [mg/kg] 2.5 10 40 2.5 10 40 AUC(0-24) [g·h/L] n.c. 1650 14400 672 3180 14000 AUC(0-24)norm [kg·h/L] n.c. 0.165 0.361 0.269 0.318 0.349 Cmax [g/L] 93.2 337 1950 152 813 2280 Cmax,norm [kg/L] 0.0373 0.0337 0.0487 0.0608 0.0813 0.0570 C(24)/Cmax [%] n.c. 0.6 1.5 0.4 0.3 6.1 tmax [h] 1.00 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 RA1 [%] 85.6 120.1 316.8 114.3 287.8 251.0 RA3 [%] n.c. 126.3 194.5 137.7 148.6 155.6 MR [%] n.c. 10.1 13.6 6.7 10.1 12.1 RA1= Cmax, Day 182/ Cmax, Day 1
RA3= AUC(0-24), Day 182/ AUC(0-24), Day 1
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
Source: 4.2.3.2.8, PH-35002
2.6.6.3.3
非げっ歯類を用いた反復投与毒性試験
非げっ歯類を用いた反復投与毒性試験では、リオシグアトをイヌに最長 52 週間投与した。2.6.6.3.3.1
イヌ 4 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.9 PH-33454 非げっ歯類に 4 週間投与した時のリオシグアトの毒性試験において、約 33 週齢（試験開始 時）のビーグル犬（系統：Bor:BEAG）を雌雄各 3 例／群を、対照群（媒体投与）及び 3 薬物投与 群に無作為に配置した。リオシグアト（バッチ ）は 0、0.3、1 及び 3mg/kg を 1 日 2 回 （bid）4 週間強制経口投与した（0、0.6、2、6mg/kg/日）。リオシグアトは 0.5％Tylose®水溶 液に懸濁し、投与容量は 5mL/kg とした。更に回復試験用に雌雄各 2 例を対照群及び高用量群に それぞれ追加し、同様に 4 週間投与した後に 2 週間の観察期間を設けた。 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した。体重を試験期間中定期的に測定した。臨床検査 （血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与開始前、投与 2 週及び 4 週目に各群全例に ついて、また 6 週目（回復期間終了時）に回復動物の全例について実施した。心血管機能の評価 のために、心電図及び観血式血圧測定を投与開始前、投与 4 週目（投与前及び投与後 2 時間）及 び回復期間終了時に実施した。眼科学的検査、神経学的検査（反射検査）及び体温測定を投与開 始前、投与期間終了時及び回復期間終了時に全例について実施した。投与期間及び回復期間終了 時にそれぞれ生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施した。摘出した臓器・組織を適切 な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。また、剖検時に肝ホモジネート中の酵素活性を 測定するために肝臓検体を採取した。トキシコキネティクス評価を投与 1 日目及び 4 週目に行い、 薬物投与群では 1 回目投与の投与前、投与後 1.5、3、5 及び 24 時間並びに 2 回目投与後 1.5、3 及び 5 時間に採血した。対照群ではそれぞれ投与後 1.5 時間に採血した。リオシグアトは 1mg/kg bid（2mg/kg/日）まで良好な忍容性を示した。高用量の 3mg/kg bid （6mg/kg/日）で、全身状態の悪化、筋振戦、流涎、嘔吐の発現頻度増加、肛門しぶり、不安定 歩行、摂餌量低下及び体重減少が認められた。所見の重篤性から、高用量群では投与を 1 週又は 2 週で中断し、投与量を投与 3 週目に 2mg/kg bid に、更に投与 4 週目に 2mg/kg/日に減量した。 0.6mg/kg/日以上で大幅な拡張期血圧及び収縮期血圧の低下がみられ、これに伴って著しい反 射性頻脈が認められた。これらの所見は過度の血行動態作用に起因したものと考えられる。消化 管症状（嘔吐及び肛門しぶり）は消化管の平滑筋弛緩に起因したものと考えられる。 高用量群の動物で血中の尿素、たん白及び GLDH 増加、電解質変化、及び尿量減少を示す例が みられたが、全身状態の著しい悪化による非特異的な変化と考えられた。また、尿検査において、 高用量群の動物にたん白、ビリルビン、ウロビリノーゲン、三リン酸塩及び pH の高値を示す例 が散見された。病理組織学的検査では、腎臓における軽度で可逆的な好塩基性尿細管の増加及び 肝細胞のグリコーゲン貯蔵増加に関連した明細胞化が高用量群に認められた。 回復期間終了時、これらの変化には回復又は回復傾向が認められた。 以上の結果より、イヌに 4 週間投与したときの無毒性量は、3mg/kg bid（6mg/kg/日）で全身 状態の悪化及び体重減少が認められたことから、雌雄共に 1mg/kg bid（2mg/kg/日）と判断され た。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 9に要約する。 表 2.6.6.3- 9 イヌ 4 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量
Sex Males Females
Dose [mg/kg/d] 0.6 (2*0.3) (2*1)2 (2*3)6 a (1*2)2 (2*0.3)0.6 (2*1)2 (2*3)6 a (1*2)2 AUC(0-24) [g·h/L] 1160 2290 5870 1545 1040 3620 7210 3243 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 1.93 1.15 0.978 0.773 1.74 1.81 1.20 1.62 Cmax [g/L] 133 272 628 311 109 399 692 463 Cmax,norm [kg/L] 0.222 0.136 0.105 0.156 0.181 0.199 0.115 0.232 C(24)/Cmax [%] 3.7 6.3 3.1 2.7 5.8 7.7 6.9 4.7 tmax [h] 2.62 4.28 4.93 1.50 3.99 3.93 7.47 1.50 RA1 [%] 101.6 66.8 99.4 91.5 RA3 [%] 95.8 53.5 104.7 70.5
RA1= Cmax, Day 25/ Cmax, Day 1
RA3= AUC(0-24), Day 25/ AUC(0-24 ), Day 1
aDose was reduced to 2 mg/kg once daily, hence only day 1 data are available
Source: 4.2.3.2.9, PH-33454
2.6.6.3.3.2
イヌ 13 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.10 PH-34778 強制経口投与による 13 週間投与毒性試験を 24～27 週齢（試験開始時）のビーグル犬（系統： Bor:BEAG）雌雄各 16 例（1 群雌雄各 4 例）を用いて実施した。動物を対照群（媒体投与）及び 3 薬物投与群に無作為に配置した。リオシグアト（バッチ ）は 0.5％Tylose®水溶液に懸濁し、0、0.3、1 及び 3mg/kg/日の用量を、投与容量 5mL/kg で 13 週間投与した。投与量は、bid での 6mg/kg/日投与後の忍容性が不良であったことから、4 週間投与試験（2.6.6.3.3.1 参照） より用量を低くした。 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した。体重を試験期間中定期的に測定した。トキシコ キネティクス評価を投与 1 日目及び 12 週目に実施し、薬物投与群から投与後 0.5、1、2、4、7 及び 24 時間に採血した。臨床検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与開始前、 投与 4、9 及び 13 週目に各群全例について実施した。心血管機能の評価のために、心電図及び観 血式血圧測定を投与開始前、投与 1、6 及び 13 週目（投与前及び投与後 2 時間）に実施した。眼 科学的検査、神経学的検査（反射検査）及び体温測定を投与開始前、投与 6 及び 13 週目に全例 について実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施した。摘 出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を実施した。 リオシグアトは、1mg/kg 以上で嘔吐及び流涎の増加、3mg/kg で便の異常（泥状／液状／赤色 便）が認められた以外は、臨床的に良好な忍容性を示した。 薬理学的作用機序の結果として、0.3mg/kg 以上で収縮期／拡張期血圧の低下、並びに 1mg/kg 以上で心拍数増加が認められた。 臨床検査では投与に関連する影響は認められなかった。病理組織学的検査では、0.3mg/kg 以 上で軽微な心内膜炎及び心筋の動脈周囲の軽微な浮腫が認められた。1mg/kg 以上で心筋内の動 脈壁の軽微な肥厚が認められた。3mg/kg で副腎重量増加を伴う球状帯の肥大が認められた。 以上の結果より、イヌに 13 週間投与したときの無毒性量は、低用量から心臓の組織学的変化 がみられたため特定できなかった。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 10に要約する。 表 2.6.6.3- 10 イヌ 13 週間経口投与試験におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量（第 12 週）
Sex Males Females
Dose [mg/kg/d] 0.3 1 3 0.3 1 3 AUC(0-24) [g·h/L] 455 1520 3350 513 1950 4100 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 1.47 1.52 1.12 1.71 1.95 1.37 Cmax [g/L] 105 241 484 94.6 378 587 Cmax,norm [kg/L] 0.350 0.241 0.161 0.315 0.378 0.196 C(24)/Cmax [%] n.c. 3.3 5.0 2.0 0.9 4.8 tmax [h] 1.00 0.841 0.707 1.19 1.19 1.41 RA1 [%] 88.5 80.0 85.0 86.3 180.3 97.9 RA3 [%] 74.0 82.8 85.3 89.5 132.6 107.4 MR [%] 115 75.7 65.3 105.8 86.2 76.6 RA1= Cmax, Week 12/ Cmax, Day 1
RA3= AUC(0-24), Week 12/ AUC(0-24), Day 1
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
2.6.6.3.3.3
イヌ 26 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.11 PH-35050 強制経口投与による 26 週間反復投与毒性試験を 21 週齢（試験開始時）のビーグル犬（系統： Bor:BEAG）雌雄各 16 例（1 群雌雄各 4 例）を用いて実施した。動物は対照群（媒体投与）及び 3 薬物投与群に無作為に配置した。リオシグアト（バッチ ）は 0.5％Tylose®水溶液に懸濁 し、0、0.3、1 及び 3mg/kg/日の用量を、投与容量 5mL/kg で 26 週間投与した。投与量はイヌを 用いた 4 週間投与試験（2.6.6.3.3.1 参照）及び 13 週間投与試験（2.6.6.3.3.2 参照）の結果 に基づいて選択した。 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した。体重を試験期間中定期的に測定した。トキシコ キネティクス評価を投与 1 日目及び 25 週目に実施し、それぞれ投与後 0.5、1、2、4、7 及び 24 時間に採血した。臨床検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検査）を投与開始前、投与 6、 13 及び 26 週目に各群全例について実施した。心血管機能の評価のために、心電図及び観血式血 圧測定を投与開始前、投与 13 及び 26 週目（投与前及び投与後 2 時間）に実施した。眼科学的検 査、神経学的検査（反射検査）及び体温測定を投与開始前、投与 5、13 及び 26 週目に全例につ いて実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検及び臓器重量測定を実施した。摘出し た臓器・組織を適切な方法で固定した後、病理組織学的検査を実施した。 リオシグアトは 0.3mg/kg まで全般的に良好な忍容性を示した。試験開始前から体重が低かっ た高用量群の雌 1 例が投与 2 週目から体重が減少し、全身状態悪化のため投与 6 週に死亡が確認 された。剖検及び病理組織学的検査からは全身状態悪化を説明できる所見は認められなかったこ とから、投与との関連は不明であった。 3mg/kg で嘔吐及び流涎の頻度増加、1mg/kg 以上で泥状／液状便の頻度増加がみられた。薬理 学的作用機序の結果として、1mg/kg 以上で全身血圧の低下、及び心拍数増加が認められた。 1mg/kg 以上を投与した動物にわずかな QTc 延長が認められた。安全性薬理試験（2.6.2.4.2 参 照）において心血管系の安全性リスクを示す徴候がなかったことを考慮すると、この結果は、QT 間隔に対する直接的影響というよりも、Bazett や Fridericia の公式による不十分な心拍数補正 によるものと考えられる。 病理組織学的検査では、副腎の重量増加（1mg/kg 以上）を伴う球状帯の肥大が 0.3mg/kg 以上 で認められた。 以上の結果より、イヌに 26 週間投与したときの無毒性量は、一般状態所見に基づき雌雄共に 0.3mg/kg/日と判断された。0.3mg/kg 以上でみられた副腎球状帯肥大はリオシグアトの血行動態 作用によるものと考え、毒性所見とは考えなかった。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 11に要約する。表 2.6.6.3- 11 イヌ 26 週間経口投与試験におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量（第 25 週）
Sex Males Females
Dose [mg/kg/d] 0.3 1 3 0.3 1 3 AUC(0-24) [g·h/L] 1440 3370 4020 779 2830 5650 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 4.80 3.37 1.34 2.60 2.83 1.88 Cmax [g/L] 208 347 655 167 388 1210 Cmax,norm [kg/L] 0.694 0.347 0.218 0.556 0.388 0.403 C(24)/Cmax [%] 3.0 12.7 3.1 n.c. 3.4 1.1 tmax [h] 1.41 2.38 1.68 1.19 1.68 0.794 RA1 [%] 121.8 129.7 208.0 135.8 129.0 208.7 RA3 [%] 138.2 140.0 191.8 160.8 151.5 268.6 MR [%] 51.9 54.6 113 120 50.9 108 RA1= Cmax, Week 25/ Cmax, Day 1
RA3= AUC(0-24), Week 25/ AUC(0-24), Day 1
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
Source: 4.2.3.2.11, PH-35050
2.6.6.3.3.4
イヌ 52 週間経口投与試験
参照項目： 4.2.3.2.12 A45725 強制経口投与による 52 週間反復投与毒性試験を、10 ヵ月齢（試験開始時）のビーグル犬（系 統：Bor:BEAG）雌雄各 16 例（1 群雌雄各 4 例）を用いて実施した。動物は対照群（媒体投与） 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した。リオシグアト（バッチ ）は 0.5％Tylose®水溶液 に懸濁し、0、0.3、1 及び 3mg/kg/日の用量を、投与容量 5mL/kg で 52 週間投与した。投与量は イヌ 26 週間投与試験（2.6.6.3.3.3 参照）の結果に基づいて選択した。 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した。体重を試験期間中定期的に測定した。トキシコ キネティクス評価を投与 1、9、24 及び 31 日目、26 週及び 50 週目に実施し、それぞれ投与後 0.5、1、2、4、7 及び 24 時間に採血した。臨床検査（血液学的検査、血液化学的検査及び尿検 査）、眼科学的検査及び反射検査を、投与開始前及び試験期間中に 5～6 回、各群全例について 実施した。心血管機能の評価のために、心電図及び観血式血圧測定を投与開始前及び投与期間中 5 回、それぞれ投与前及び投与 2 時間後に実施した。投与期間終了時に生存動物を屠殺し、剖検 及び臓器重量測定を実施した。摘出した臓器・組織を適切な方法で固定後、病理組織学的検査を 実施した。 3mg/kg を投与した動物で、投与 1 日から 9 日にかけて著しい摂餌量減少、体重減少及び筋振 戦が認められた。そのため 3mg/kg の投与を試験 10 日目から中止した。試験 24 日目から 1mg/kg で再開し、試験 31 日目以降投与期間終了時まで 2mg/kg を投与した。 1mg/kg 以上で流涎、嘔吐、下痢及びるいそうの発現頻度の増加が認められた。更に、高用量 （2mg/kg）群に無関心、運動抑制、振戦などの一般状態の変化に加え、一過性の脱水及び摂餌量 減少が認められた。 眼科学的検査において、高用量群の雌雄各 1 例に結膜炎がみられたが、いずれも片側の所見で あり、薬物投与に関係しない偶発的なものと考えられた。高用量群の雄 1 例が全身状態の悪化、下痢（投与期間を通じて継続）、摂餌量減少及び体重減 少を示し、279 日に死亡した。病理組織学的検査により、種々の臓器のうっ血、肺水腫、僧房弁 の浮腫に加え、軽度な急性心筋変性が認められた。慢性的な心筋の変化が認められなかったこと を考慮すると、この変化は全身状態悪化や死亡の原因というよりも死戦期の苦悶により生じたも のと考えられた。 2mg/kg 群において血中 T3 の有意な低下が投与 13 週目にみられ、それ以降、投与期間を通じ て低値傾向が認められたが、血中 TSH 並びに甲状腺組織に関連付けられる変化を伴っていなかっ たことから、毒性性学的意義に乏しいものと考えられた。 心臓に対する安全性を評価するために心毒性の指標となるトロポニン T を測定したところ、変 化は認められなかった。 短期試験と同様に、リオシグアトの薬理学的作用機序に基づく血圧低下及び代償性の心拍数増 加並びに副腎重量増加が 0.3mg/kg 以上で認められた。 その他、リオシグアトの血管拡張作用により二次的に生じたと考えられる心筋の動脈の軽微な 中膜肥厚が薬物投与群の動物に散見された。 以上の結果より、イヌに 52 週間投与したときの無毒性量は、一般状態所見に基づき雌雄共に 0.3mg/kg/日と判断された。 トキシコキネティクスデータを表 2.6.6.3- 12に要約する。 表 2.6.6.3- 12 イヌ 52 週間経口投与試験におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量（第 50 週）
Sex Males Females
Dose [mg/kg/d] 0.3 1 2 0.3 1 2 AUC(0-24) [g·h/L] 712 1360 3330 963 1040 2740 AUC(0-24)norm [kg·h/L] 2.37 1.36 1.11 3.21 1.04 0.913 Cmax [g/L] 99.7 251 552 156 226 446 Cmax,norm [kg/L] 0.332 0.251 0.184 0.520 0.226 0.149 C(24)/Cmax [%] 1.5 0.8 1.4 1.7 0.7 0.8 tmax [h] 1.00 1.41 0.794 1.00 1.19 1.00 RA1 [%] 55.8 114.9 164.6a 94.2 124.5 68.2a RA3 [%] 62.1 110.5 85.0a 70.5 117.7 52.2a MR [%] 67.5 91.9 127 72.0 144 152 RA1= Cmax, Week 50 / Cmax ,Day 1
RA3= AUC(0-24), Week 50/ AUC(0-24), Day 1 a Compared to Day 31
MR = metabolic ratio of BAY 60-4552 AUC(0-24)norm/ riociguat AUC(0-24)norm
![表 2.6.6.3- 1 マウス 2 週間混餌投与試験におけるリオシグアトの 定常状態での曝露量（雌雄合算） Dose [ ppm] 50 200 800 a Dose [mg/kg] 23.5 85.7 AUC (0-24) [µg·h/L] 1376 5860 AUC (0-24)norm [kg·h/L] 0.0587 0.0684 C max [µg/L] 89.1 379 C max, norm [kg/L] 0.00380 0.00443 t max [h] 7.00 7.00 R A1 [%](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123deta/6521447.665045/12.892.106.616.197.422/マウスおけるリオシグアト定常状態曝露量雌雄合AUCµAUCCµC.webp)
![表 2.6.6.5- 1 マウスがん原性試験における途中死亡例（切迫屠殺例を含む） Males Females Dose [ ppm] 0 50 100 200 0 50 100 200 Main groups (n= 50) 23 24 24 37 34 27 31 32 Satellite groups (n= 20) 10 12 12 11 11 10 8 15 Overall mortality (n = 70) 33 36 36 48 45 37 39 47 Source: 4.2.3.4.1.1](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123deta/6521447.665045/30.892.111.703.182.305/マウスがん原性試験おける途中死亡例切迫屠殺例含むMainSatelliteOverall=Source.webp)
![表 2.6.6.5- 2 マウスがん原性試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量(投与 53 週) Males Females Dose [ ppm] 50 100 200 50 100 200 Dose [mg/kg] 6.1 12.49 25.49 6.84 14.22 29.72 AUC (0-24) [g·h/L] 917 2324 4308 1223 2925 6622 AUC (0-24) norm [kg·h/L] 0.150 0.186 0.169 0.179 0.206 0.223](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123deta/6521447.665045/31.892.106.779.181.462/マウスがん原性試験おけるリオシグアト定常状態曝露量投DoseAUCAUC.webp)
