油粕および油粕製造環境のサルモネラ汚染の制御に関する研究
（Studies of the Control of Salmonella Contamination in Oil Meal and Oil Meal Production Environments）
学位論文の内容の要約
日本獣医生命科学大学大学院獣医生命科学研究科
北澤 秀基
（指導教員：小林 眞理子）
序 論
油 粕 は 飼 料 や 肥 料 の 原 料 、 味 噌 や 醤 油 な ど の 醸 造 用 原 料 な ど に 幅 広 く 用 い ら れ て お り 、 食 品 生 産 流 通 網 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。 特 に 飼 料 原 料 と し て の 需 要 は 多 く 、 主 要 な た ん ぱ く 源 の 一 つ と し て 古 く か ら 使 用 さ れ て き た 。 油 粕 の 品 質 上 の 課 題 と し て サ ル モ ネ ラ 汚 染 が 指 摘 さ れ て お り 、 そ の 製 造 環 境 か ら は 高 頻 度 で サ ル モ ネ ラ が 分 離 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 油 粕 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 を 完 全 に 制 御 す る た め に は 、 製 造 環 境 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 を 軽 減 す る 必 要 が あ る 。
そ こ で 、 本 研 究 で は 製 品 油 粕 お よ び 製 造 環 境 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 を 制 御 す る こ と を 目 的 と し て 、 油 粕 工 場 に 適 し た 検 出 法 を 評 価 し た 。 さ ら に 、 実 際 の 工 場 お よ び 工 程 を 対 象 に 、 製 造 環 境 お よ び 油 粕 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 対 策 を 確 立 し た 。
第 一 章 油 粕 工 場 に お け る 遅 延 二 次 増 菌 培 養 法 の 検 討
油 粕 製 造 環 境 の サ ル モ ネ ラ を 効 率 的 に 分 離 す る 検 出 法 と し て 、 遅 延 二 次 増 菌 培 養 法（DSE 法 ）を 評 価 し た 。飼 料 分 析 基 準 に 準 じ た 方 法（ 飼 分 法 ）と 選 択 増 菌 培 地 に ハ ー ナ・テ ト ラ チ オ ン 酸 塩 基 礎 培 地 を 用 い た DSE法 を 比 較 し た 結 果 、 DSE法 で は 飼 分 法 で 陰 性 と 判 定 さ れ た2検 体 か ら サ ル モ ネ ラ を 分 離 す る こ と が で き た 。 試 料 別 で は 、 汚 染 菌 数 が 高 い 環 境 拭 き 取 り 試 料 で は 飼 分 法 と DSE 法 の 検 査 結 果 は 一 致 し た が 、 汚 染 菌 数 の 低 い 油 粕 原 料 で は DSE 法 の 方 が 検 出 率 は 高 か っ た 。 選 択 増 菌 培 地 に ラ パ ポ ー ト ・ バ シ リ ア デ ィ ス サ ル モ ネ ラ 増 菌 培 地 お よ び テ ト ラ チ オ ネ イ ト ・ ブ リ リ ア ン ト グ リ ン 胆 汁 増 菌 培 地 を 用 い た 場 合 に お い て も 、DSE 法 で は そ れ ぞ れ 飼 分 法 で 陰 性 と 判 定 さ れ た 1検 体 か ら サ ル モ ネ ラ を 分 離 す る こ と が で き た 。
分 離 株 に お け る O 抗 原 群 別 の 結 果 、 飼 分 法 と DSE 法 で と も に サ ル モ ネ ラ が 分 離 さ れ た 試 料 の う ち 10.0～43.8%は O 抗 原 が 異 な っ て い た 。さ ら に 複 数 検 体 に つ い て は 、 飼 分 法 で 検 出 さ れ な か っ た O 抗 原 の サ ル モ ネ ラ を 、DSE 法 で は 分 離 す る こ と が で き た 。
以 上 の 結 果 か ら 、 飼 分 法 と DSE 法 の 併 用 は 油 粕 工 場 の 疫 学 解 析 を 目 的 と し た 検 出 法 と し て 効 果 的 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。
第 二 章 油 粕 製 造 環 境 に お け る サ ル モ ネ ラ 汚 染 実 態 と そ の 対 策 油 粕 製 造 環 境 に お け る サ ル モ ネ ラ 汚 染 実 態
油 粕 工 場 が サ ル モ ネ ラ に 汚 染 さ れ る 機 序 を 明 ら か に す る た め 、 日 本 と イ ン ド の 計 4工 場 を 対 象 に 、 製 造 環 境 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 実 態 を 調 査 し た 。 原 料 保 管 エ リ ア の 汚 染 調 査 の 結 果 、 イ ン ド の 工 場 の 汚 染 率 は 60.0%で 、 日 本 の 3工 場 と 比
較 し て 著 し く 高 い こ と が 判 明 し た 。 油 粕 原 料 は 日 本 で は サ イ ロ に 隔 離 保 管 さ れ る こ と に 対 し 、 今 回 調 査 し た イ ン ド の 工 場 で は 、 倉 庫 に 麻 袋 ま た は 野 積 み の 状 態 で 保 管 さ れ る 。 そ の た め 、 油 粕 原 料 と と も に 油 粕 工 場 に 侵 入 し た サ ル モ ネ ラ が 、 原 料 搬 入 作 業 お よ び 作 業 者 の 移 動 、 衛 生 動 物 を 介 し て 原 料 保 管 エ リ ア 全 体 に 拡 散 し た も の と 考 え ら れ た 。
次 に 、 油 粕 製 造 エ リ ア の 汚 染 調 査 を 実 施 し た 結 果 、 油 分 の 高 い 菜 種 を 扱 う 工 場 の 方 が 、 油 分 の 低 い 大 豆 の み を 扱 う 工 場 よ り も 汚 染 率 が 高 い 傾 向 を 示 し た 。 サ ル モ ネ ラ 汚 染 の 増 加 に 油 分 の 存 在 が 関 与 し て い る こ と が 改 め て 確 認 さ れ た 。 4 工 場 す べ て に お い て 、 原 料 保 管 エ リ ア で 確 認 さ れ た 血 清 型 の ほ と ん ど は 、 同 工 場 の 油 粕 製 造 エ リ ア で も 確 認 さ れ た 。 こ れ は 油 粕 原 料 を 介 し て 油 粕 工 場 に 侵 入 し た サ ル モ ネ ラ の 一 部 が 、 原 料 保 管 エ リ ア を 汚 染 し た 後 、 作 業 者 や 衛 生 動 物 に よ っ て 油 粕 製 造 エ リ ア に 拡 散 し た こ と を 裏 付 け た 。 ま た 、 こ れ ら の 血 清 型 は 他 の 血 清 型 よ り も 生 残 性 が 優 れ て い る と 考 え ら れ 、 工 場 内 で 常 在 化 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
油 粕 製 造 環 境 に お け る サ ル モ ネ ラ 汚 染 対 策
油 粕 製 造 エ リ ア の 環 境 汚 染 対 策 を 確 立 す る 目 的 で 、 作 業 床 に 使 用 す る た め の 効 果 的 な 消 毒 剤 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 ジ デ シ ル ジ メ チ ル ア ン モ ニ ウ ム ク ロ ラ イ ド を 主 成 分 と す る 界 面 活 性 剤 の 10 倍 希 釈 液 が 、 殺 菌 効 果 、 安 全 性 お よ び 経 済 性 に 優 れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。
次 に 日 本 B 工 場 を 対 象 に 、靴 裏 消 毒 、床 面 の 平 滑 化 塗 装 お よ び 作 業 床 の 消 毒 の 3 つ の 対 策 を 実 施 し た 。 油 粕 製 造 エ リ ア は ス ペ ー ス が 広 い た め 、 従 業 員 の 作 業 負 荷 を 考 慮 し 、高 油 分 区 域 の み を 1ヶ 月 に 1回 の 頻 度 で 消 毒 す る こ と と し た 。 そ の 結 果 、高 油 分 区 域 の 汚 染 率 は 靴 裏 消 毒 の み を 実 施 し た 場 合 は 89.5％ で あ っ た が 、 靴 裏 消 毒 、 床 塗 装 お よ び 作 業 床 の 消 毒 の す べ て を 実 施 し た 場 合 は 25.0%
に ま で 低 下 し た 。
以 上 の こ と か ら 、こ れ ら 3 つ の 対 策 は サ ル モ ネ ラ の 常 在 化 を 防 止 す る 有 効 な 手 段 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、 サ ル モ ネ ラ が 作 業 者 を 介 し て 高 油 分 区 域 か ら 低 油 分 区 域 に 拡 散 し て い る こ と が 改 め て 確 認 さ れ た 。 従 っ て 、 本 対 策 の 継 続 は サ ル モ ネ ラ の 拡 散 防 止 に も 有 効 で あ る と 考 え ら れ た 。
第 三 章 油 粕 製 造 に お け る サ ル モ ネ ラ 制 御 技 術 の 確 立
油 粕 製 造 工 程 の サ ル モ ネ ラ 制 御 方 法 を 確 立 す る 目 的 で 、 イ ン ド の 工 場 を 対 象 に 、 加 熱 工 程 以 降 の 製 造 工 程 内 の 残 留 物 の 汚 染 実 態 を 調 査 し た 。 そ の 結 果 、 水 平 コ ン ベ ア の 入 口 と 出 口 、 垂 直 コ ン ベ ア の 下 部 で 汚 染 率 が 高 か っ た 。 ま た 、 微 粉 回 収 工 程 内 で は 、 ダ ク ト 水 平 部 や サ イ ク ロ ン 出 口 シ ュ ー ト の 汚 染 率 が 高 く 、
ダ ク ト 垂 直 部 は す べ て 陰 性 と な っ た 。 検 出 率 の 高 い 箇 所 は 、 工 程 内 残 留 物 の 多 い 箇 所 と 一 致 し て お り 、 残 留 物 中 に サ ル モ ネ ラ が 長 期 間 生 残 し た も の と 考 え ら れ た 。 製 造 工 程 内 に サ ル モ ネ ラ が 確 認 さ れ た こ と か ら 、 加 熱 工 程 以 降 の 油 粕 工 程 内 の 残 留 物 を 除 去 す る と と も に 、 本 来 、 製 造 工 程 に 添 加 さ れ て い る 汚 染 率 の 高 い 微 粉 を 工 程 外 に 除 去 し た 。 そ の 結 果 、 製 品 油 粕 は 残 留 物 除 去 後 の 製 造 に お い て は す べ て 陰 性 と な っ た 。 一 方 、 微 粉 は 残 留 物 除 去 後 に は 残 留 物 除 去 前 よ り 汚 染 率 が 低 下 し た も の の 、 有 意 差 は 確 認 さ れ な か っ た （p>0.05）。
微 粉 の 工 程 は 一 般 的 に 構 造 上 開 放 で き る 箇 所 が 少 な く 、 残 留 物 お よ び 残 留 物 中 に 生 残 す る サ ル モ ネ ラ を 完 全 に 除 去 す る こ と が 困 難 で あ る 。 す な わ ち 、 油 粕 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 率 を 低 減 さ せ る た め に は 、 製 造 工 程 内 、 特 に 水 平 コ ン ベ ア の 入 口 と 出 口 、 垂 直 コ ン ベ ア の 下 部 な ど を 集 中 的 か つ 定 期 的 に 清 掃 し 、 残 留 物 を 除 去 す る こ と が 効 果 的 で あ る こ と が 考 え ら れ た 。 さ ら に 、 微 粉 か ら の サ ル モ ネ ラ 混 入 を 防 止 す る た め に は 、 微 粉 の 除 去 が 必 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
第 四 章 製 品 油 粕 を 対 象 と し た サ ル モ ネ ラ 簡 易 迅 速 検 出 法
我 が 国 の 油 粕 工 場 は 製 品 の 保 管 能 力 が 不 足 し て い る 場 合 が 多 く 、 サ ル モ ネ ラ 検 査 の 判 定 前 に 製 品 を 出 荷 す る こ と が 少 な く な い 。そ の た め 、油 粕 工 場 で は 24 時 間 程 度 で 検 査 結 果 が 判 明 す る 、PCRを 原 理 と し た 簡 易 迅 速 検 出 法 が 広 く 採 用 さ れ て い る 。 し か し 、 迅 速 性 は 不 十 分 で あ り 、 検 査 開 始 か ら 10 時 間 程 度 で 判 定 で き る サ ル モ ネ ラ 検 出 法 の 確 立 が 求 め ら れ て い る 。
前 増 菌 培 養 時 間 を 短 縮 す る た め 、MP 培 地 を ペ プ ト ン 水 （ BPW）、
Enterobacteriaceae Enrichment Mannitol 培 地 お よ び 乳 糖 培 地 と 比 較 す る こ と に よ り 評 価 し た 。 そ の 結 果 、MP 培 地 の 7 時 間 培 養 後 の 菌 数 は 、 他 の 培 地 と 比 較 し 有 意 に 高 か っ た （p<0.001）。ま た 、人 工 汚 染 試 料 お よ び 自 然 汚 染 試 料 を 用 い て 、BPW で の 18 時 間 培 養 と MP 培 地 で の 14 時 間 培 養 を 比 較 し た 結 果 、 BPWと MP培 地 は 同 等 の 検 出 率 と な っ た 。以 上 の こ と か ら 、MP培 地 を 採 用 す る こ と に よ り 、 前 増 菌 培 養 時 間 を 14 時 間 に 短 縮 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 次 に 前 増 菌 培 養 後 の 二 次 増 菌 お よ び 溶 菌 操 作 に 要 す る 時 間 の 短 縮 を 目 的 に 、 QuickGene-mini80を 評 価 し た 。サ ル モ ネ ラ 菌 液 を 用 い て 、ク オ リ バ ッ ク ス T M シ ス テ ム を 使 用 し た 方 法 （BAX 法 ） と ク オ リ バ ッ ク ス T M シ ス テ ム お よ び QuickGene-mini80 を 組 み 合 わ せ た 方 法 （QuickGene-BAX 法 ） を 比 較 し た 結 果 、QuickGene-BAX 法 は BAX 法 よ り も 検 出 感 度 が 高 か っ た 。自 然 汚 染 試 料 を 用 い た 評 価 に お い て も 、QuickGene-BAX法 で は BAX 法 で 陰 性 と 判 定 さ れ た 1 試 料 か ら サ ル モ ネ ラ を 検 出 す る こ と が で き た 。
以 上 の 結 果 か ら 、QuickGene-mini80 を 用 い る こ と に よ り 、BAX 法 の 検 出 感
度 が 向 上 す る こ と が 明 ら か と な り 、 前 増 菌 培 養 時 間 を 短 縮 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、MP 培 地 で の 培 養 時 間 を 7 時 間 に 短 縮 し 、100cfu/25g の 人 工 汚 染 試 料 を 検 査 し た 結 果 、QuickGene-BAX 法 の 検 出 率 は 100％ と な っ た 。 ま た 、 自 然 汚 染 試 料 を 用 い た 評 価 に お い て も 、7 時 間 培 養 の QuickGene-BAX 法 の 検 査 結 果 は 培 養 法 と 同 等 で あ っ た 。QuickGene-BAX 法 を 用 い る こ と に よ り 前 増 菌 培 養 時 間 を 7時 間 に 短 縮 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
総 括
油 粕 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 を 制 御 す る た め に は 、 製 造 環 境 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 を 軽 減 す る 必 要 が あ る 。そ の た め に は 、DSE 法 に よ り 製 造 環 境 か ら 効 率 良 く サ ル モ ネ ラ を 分 離 す る こ と が 重 要 で あ る 。 ま た 、 製 造 環 境 を 汚 染 さ せ な い た め の 手 法 と し て 、1)油 粕 原 料 は 原 料 サ イ ロ で 隔 離 保 管 す る 、2)原 料 保 管 エ リ ア と 油 粕 製 造 エ リ ア を 可 能 な 限 り 隔 離 し 、 作 業 者 や 衛 生 動 物 の 往 来 を 制 限 す る 、3)種 子 中 の 含 有 油 分 の 多 い 油 粕 原 料 を 扱 う 工 場 で は 、 特 に 、 油 分 の 除 去 を 徹 底 す る 、 な ど が 本 研 究 か ら 明 ら か と な っ た 。 さ ら に 、 汚 染 さ れ た 製 造 環 境 を 改 善 す る た め に は 、1)靴 裏 消 毒 、2)床 面 の 平 滑 化 塗 装 、3) 効 果 的 な 消 毒 剤 に よ る 高 油 分 区 域 の 定 期 的 な 噴 霧 消 毒 、 の 3 つ の 対 策 す べ て を 実 施 す る こ と が 効 果 的 で あ っ た 。 ま た 、 油 粕 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 対 策 と し て 、1)工 程 内 残 留 物 の 除 去 、2)微 粉 の 除 去 、 の 2 つ が 効 果 的 で あ っ た 。 製 造 環 境 お よ び 油 粕 の サ ル モ ネ ラ 汚 染 対 策 は 、 い ず れ も 実 際 の 工 場 お よ び 工 程 を 対 象 に 評 価 し 、 そ の 効 果 を 確 認 し た も の で あ り 、 紛 体 を 扱 う 多 く の 飼 料 ・ 食 品 工 場 で 応 用 が 可 能 で あ る 。
