Aspergillus niger のamylaseの生成にたいする金属塩類の影響に関する研究
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(2) 9 4. 近 畿 大 学 農 学 部 紀 要. 第. Ⅰ 緒. 5号. (1972). 論. amya lseは動物,植物,微 生物 に存在す る.糸状 菌 は一般 に強い amyl ase を生産 するが,その なか で も As yz aeの amyl pe r gi l L usor aseは非常 に強 い｡amyl ase は高純度 に精 製 され, また結 晶. aseは α-amyl ase であ るこ とか見 出 され た三)2pe r gi L L uso , yz aeの amyl 化 され てお り,As また Rhi z o p usden lu l rの生産 す る酵素 で gu lc amyl aseと呼ばれてい るものは,β- amyl ase に. 3 . ) 4 ). 類似 してい る と報告 されてい る. Bai c l lss u u. b l f. L i sにおけ る α-amyl ase の生成 は細胞 内 よ りも細胞外に分 泌 され る ものが 多 く, α-amyl aseの生成 は2. 41dii nt ro-phenol ,chl oramphenc iolにより阻害 され る｡5) またJ .M. co N NE L LN A 等 6) tl i dazoe lお よび tt は Ba c i l lss u ubl i l iの s α- a. myl ase. は N-acey mi erani t romet hane に よ り不 活性 に な るこ とを認め た｡. amyl aseは微生物 の細胞内や 培養 液 中に見 出 され る｡ その酵素 の生成は,通常培地 中のでんぷ んの消 費に よって増加 し, また窒素源や少量の塩類 に よって も効 果 の あ るこ とが認め られて い る:). aseの生成 につ いては,合成培地 と酵素 との関係 を研 究 した結果, リン酸や微 量 細菌型液化 amyl ase の生成 にたいす る無機塩 類 の効 果 につ いては, まだ の MgS04が有効 であ る8)｡ しか し amyl. pe r g. i L L u. sor yz aeの生産 す る amyl ase につ いてはか な り 不 明 な問題が 多 く, 糸状菌 につ いて も As 研 究 され てい るが,他 の糸状菌 につ いての研 究 は充分 ではない｡. pe r g. i L Lsn u i ge rvan Ti eghem を使用 し,各種 の金属塩 頬の amyl aseの 本報文 は, 糸状菌 に As 生成 にたいす る影響 につ いて検 索 した もの であ る｡. Ⅰ Ⅰ 実. 験. 方. 法. 供 試菌 には As per g. i l lsn u i ge r va. n Ti eghem を使用 した.基本培地 の組成は,可 溶性 でんぷん. NH4) 10 .g, ( 2SO4 2.. 0 g,Na2HPO.10 .g,K2SO｡ 05 .1 g, .g,MgSO｡ 0. 2 g,FeSO｡ 00 CaC12 00 .1 g. 0に調製 した｡ ,酵母 エ キス00 . 1 g,蒸溜水 lJであ り,pH 5. ase生産 に たいす る各種 の金属塩 類の効 果 につ いては,基本培地 に CuSO｡, C o. C12,Ni amyl C12, .,ZnSO｡, HgC12, BaC12,A12 ( SO.) 3をそれ ぞれ 1 0 3M, 1 04 M, MnC12,SnC12,PbCl. 0 6M,10 7M添加 した もの と,無添加 の ものす なわ ち基本培地 を対 照区 として,供 試菌 1 0 5. M ,1 Cで振 とう培養 したO経時的に一定 量 を採 取 した培養 液 を, ろ過 したの ち遠心分離 し を接種 し35o ase の測定に用いた｡ す なわ ち液化 て菌体 を除去 した.上 音液 を蒸滑水 で24時 間透 析 して amyl amyl ase, 糖化 amyl aseの測定 には上澄液 を酵素 液 として使用 した｡ lseについては ヨー ド反応 9) に よ り,酵素 液 1mほ 用 い,反応 時間を3 0分 とし, 700 液化 amya mi Lで吸光度 を測定 したO酵素 液. . I. lmLの代 りに水 1mほ 用 いて同様 に処理 した もの を盲験 とし,.
(3) 鎌E E l 秀郎 :As per gl l ls u ni ger の amya Lseの生成 にたいす る金属塩頬の影響に関す る研究. 9 5. その吸光度 ( Do) を測定 した｡酵素単位 は, この条件下 で吸光度 Doの1% 0 を消失 させ る酵素 の量 を 1単位 とした｡ 糖化 amya )テル酸 法 10)に よ り,酵素液 1mほ 用い,反応 時間 を 3分 lseについては ジニ トロサ ･ と し,5 4. 0mF Lで吸光度 を測定 した｡盲験 は酵素液 1mlの代 りに水 1ml を用 いて行 ったO この条 件下 で mal. t ose lmg を遊 離す る酵 素の量 を 1単位 とした｡. Ⅰ Ⅰ Ⅰ 結果 および考察 ase,糖化 amya 対 照区 ( 基本培地 )では液化 amyl l seともに 3 日目か ら酵素 の生成が認め られ,. 4 日目で顕著 に増加 し, 6日目まで増加 の傾 向が認め られた｡. .J. 1 u STtun. (. 0 5. Sa c c h a r l f y mga my l a s e 0 4. ). 0 3 0 2 0 1. t ^ T 3 Uea S‡ ue Ju .a S 冨. L7. JUuT. t g.I. Ef Fi f ectoftea h ddi i o nof I n c ua bt 1 0 nt ) m e( d a y. ). -. co nr to l. H. 1 0 -5M. E. I n c ua bt l O nt i me( d a y). - ｡1 0 -3 M 16 M ∇ 一 寸 1 0. △ ･ . - 04 M ◎一 一 - 1 0 -7 M 1 -. m oramyl as e CuSO4Of t or pe r gi / l ugni g e rVan byAs Tih eg em.. 0 4. Js. ( t . u 一tun). 0 5. Sa h a r. l f y l n. my l a s e c c ga. 0 3 0 2 0 1. ^ L T U e a S号 ∈ t !uLaSa t 2 JUul. A TI. 1 2 3 4 5 6. I n c ua bt l O nt l me( d a y) -｡1 0 15M. ▽-イ. ｡. 1 -. .. 1 2 3 4 5 6. 0. I n c ua bいO nt l me( d a y) 1 0 山 -. 6. ト. ◎ 07 M 1 -. t Fi g･2･ Ef f ectoftea h ddi i on of 2t Of or m ofamyl as e CoC1 byAs pe r g i l l usni g e rVan eghem. Ti.
(4) 9 6. 第 5号. 近 畿 大 学 農 学 部 紀 要. (1972). cuso.を添加 した場合 には灯 3 M と高溝度 では菌 の生育 を抑制 し,液化 al nya lseの生 成は認め. られ なか ったが,低 濃度 の 1 0 6Mでは酵素 の生成 に効 果 が認め られ最適 濃度 であ る01ー 04 M,1 0. 5. Mでは菌 の生育がか な り抑制 されて酵素 の生成 が少 なか ったが,1 0 7Mでは無添加 の もの と類 mya lseの生成 は高 濃度 でほ とんど認め られ なか ったが,1 0 -6. Mの添加 似 の傾 向 を示 した｡糖化 a で促 進効 果が あ り, それ よ り低 濃度 では効 果が ない もの と考 え られ る｡高濃度 では生育 も抑制 さ れ わo. u. (1. 5 0. l. t u n). JS. Sacca h rl fi yn gamyl ase. 4 0. 言. ^ t 一 3 t" t !. StL ( u J d uta S t n 3Ul. 3 0. 2 0. 1 0. 1. 1 2 3 4 5 6 I ncua bt i o ntme( l da y). l nc ua bt i ont l me( day ). e c toftea h ddi t i onofNi C12 t Of or mof Fi g･3･ Ef f a s ebyAs a myl pe r g i l l usni g e rvanTi e he g m･ -. conr to1. -8 1 15M 0 0. ∇-. 1 0 13M ∇ 1 0 16 M. - 1 0 14M - 1 M 0 17. △･ ･. ⑳-. へ1. o 5 o 4 o 3. T. o 2. l ! u n) A)^ t ) U . " 号 S t J . .". u JS. my l a s e Sa c ch a r l t i n ga. 0 1. !a S 雷. J T. J｡t. 1 2 3 4 5 I ncua bt l ont i me ( da y). I ncua dt i o nt l me( da y). Fi g･ 4･ Ef f e c toftea h ddi t i onofMnC1 2t Of mof or pe r gi l l u sni g e rva e he g m･ a myl a s ebyAs nTi =. I. ?. 0 n 去 ;o'. =. 王 : -6 3 ㍍ 1. ニ. ; : -4 ㍍ -.
(5) lseの生成 に T 鎌 田秀郎 :As pergi l lsn u i ger の amya =いす る金属 塩頬の影響 に関す る研 究 ase,糖化 amyl aseともに1 coc12 を添加 した場合 には,液化 amyl 0-3 -1 0. 9 7. 4M では生成が少 な. く,菌 の生育 も抑制 され たが,Cu SO.の場合 と異 な り10 5 Mで もか な り酵素 の生成が認め られた｡ 10-6 M , 10 7M と添加 濃度 を減少 させ て も酵素 の生成 に促 進効果が なか った｡ Ni C12の場合 は, CoC12 と類似 の傾 向 を示 した｡す なわ ち 2種 の amyl aseは ともに高濃度の添加 で生 成は少量 であ. Mでは無 添加 の ものに ちか い値 を示 した｡ しか しそれ よ り低 濃度 においては促 進効 ったが, 10 S 果 は認め られ なか った｡ MnC12 を添加 した場合 には, 液化 amyl aseの生成 は1 0 3M で少量 であ り,1 0 -4M では無 添加 の. もの よ り少 なか ったがか な り酵素 の生成が あ り, 1 0ー5- 1 0 7M にお いては明 らか に促 進効 果 が認 aseの生 成 も, 10 3 M で阻害 され たが め られ, 10 6M が最適 濃度 であ る と考 え られ る｡糖化 amyl 016 M で最 も効果 が あ らわれ10 5 M,1 0 7M にお いて もか な り有効 であ り,1 0I4M では酵 素 の生 1. 成 を僅 かに阻害 した｡ ( 1uJ J S一 t u r L) L! T ^ ( t oe aS e t Lu. Sa c c h a r i E y ) n ga my l a s e. e J. t u a Sea Ou T. 0 1 2 3 4 5 6. 1 n c ua bt l O nt l me( d a y. ). to 1 - conr (. o 5. 1 uLJ. 1 0 14M. …. - - - = - - ) 1 2 3 4 5 6. I n c ua bt i o l me( d a y) nt 0 103 M. -. 1g 10 -5 M. 9. △･. 1 0 14 M. 砂_ 梱. 一. 1I. 07 M. Fi g.5. Effectoftea h ddi t i onof SnC1 or as e 2t Of m Oramyl. byAs pe r gt ' l L usnt ge rvan eg hem. Ti. 0 4. Sl t u n). c c n ga Sa h a r i E yl my l a s e. o 3. tこ. L 7 t^ t7U. o 2. l. S t!LL u e. o 1. n5. u T. t J! aS t. ∩. 1 2 3 4 5 6. 1 2 3 4 5 6. I n c ua bt i o nt i me( d a y) - Co n t r o l. nt l n c ua bt l O i me( d a y). ･. ･ . ･ . ･ . ･ ･. -. トー 01 0 -5M. 一. 1 0 -3 M. 々1 0 -6M ･. t l. H. L. 1 0 -4M. ◎ 一 一 0 -7M → 1. Fi g. 6. Ef f e ctofh teaddit i on of PbS O4tOfor mOramy se b yAs perg i l l usntgerTan Ti eh gem _ la.
(6) 9 8. 近 畿 大 学 農 学 部 紀 要. 第. 5号. (1972. ). snc12の場合 は, 各々の amya lseにおいて10 3-1 0 5 M で生成が著 し く少 な く,菌 の生育 も強 06 -1 0-7 M と低 濃度 で も促 進効 果 が認め られ なか った｡PbS04の場合 には1. 0 3 く抑制 され,1 1 0. -7 M添加 においていずれの濃度 にお いて も,菌 の生育 の抑制 がみ られ特 に高 濃度 において顕著 であ って a mya lseの生 成 は無添加 の もの と比較 して少 なか った｡低 濃度 の1 07 M で も無添加 の も のの約7% 0 の生成 しか認め られ なか った｡. nb c uat"ntl me( day). c u b a t ] on te l m( d a y ). 1n. J. Fi g.7 . Ef f ectoft he a di t i onofZnSO. Of r m t o. of. i e hc a mylse b y As pe r gi s i gerv aT g m･ 4. d. llu. a. ーConr to). ･. n一. 七1 0 T5M. n. n. 一 一 11 0 -3 M. . >. ∇ -1 0-6M. か. 014. M 41 増 10 17. M. ( .T tu n. E ＼S 一 )L. Sac ch a rl fl ynga mya 】se. lU e a S t!tL E t !. T T^ t. uT a Sa e 3 JU t. 0 1 2 3 4 5 6. 0 1 2 3 4 5 6. I nc ua bt "nt me( da y) i. I ncua. bt 1 0. nt i. me( da y). Fi g. 8. Ef f e c tofte ha ddi t i onofHg C1. 2t Of or mof a myl a s ebyAs pe r gi l l usnt ie rv a nTi e g m･ he. t ll. ･ 一 一 一･Conr tol. . 中. 0. -5 M. E H 1. 9. l o -3 M. 0 ー4 M -や 1. a . ･ . ･ . 也1 0 -6 M 一鳩1 0 -7 M. 中.
(7) 鎌 田秀郎 :Aspergi l l us ni ger の amyl aseの生成 に たいす る金属塩頬の影響 に関す る研 究. 99. znso.を添加 した場合 には,高濃度 で酵素の生成が少な く,1 0 6M,1 07 Mでも促進効果はな か った｡HgC12では1 0 3- 1 0ー6Mにおいて菌の生育 を著 しく阻害 し,酵素の生成はあ ま り認め ら. 0 であって,他 の金属塩類 07 Mで も無添加 の ものにたい して酵素の生成が約5% れず,低 濃度の1 よ りも菌 の生育や酵素の生成にたいす る阻害作用が顕著 である｡. BaC12添加 で も1 0 3- 1 07 Mの範囲において, いずれの濃度の場合 も菌の生育や酵素 の生成 を お さえ,1 0 7Mでは無添加 の ものの約8% 0 の生成が あって,HgC12の場合 ほど阻害が若 しくはな か った｡. 4 0. i ). 0 ‖ 0 0 0 ⋮ 43 2 一 uJS J一 t u n) ! ^ t 7 3ta ZS t ! T LE d uTaSt ! L aU u I (.. 5 0 Ll queyn figamyl as e. 3 0. 2 0. 1 0. 1 2 3 4 5 6 I nc ua bt l Ont l me( da y). T ncua bt 1 0nI ) me( da y). e c toftea h ddi Cl 2t Of or mof Fi g. 9. Ef f t i onofBa pe r g7 ' l l usni ge rv a a s ebyAs nTi e he g m. a myl ･ …. conr to1. 1 0 15 M. -. 1 0 -3 M. △. → ∇-. 1 0 -6 M. ･ t H. -. M 1 0 -4. ∼灯 7 M. (. T uJ 0 4. S 一lu n ). 0 0 3 2 t ^T 3 D " t S e t Lu. L7 e. 0 0 1 a s t n JUUt. ut. 0 1 2 3 4 5 6 Incua bt i ont l me( da y). 0 1 2 3 4 5 6 I ncua dt l Ont l me ( day). 3t Fi g. 1 0.Ef f e c toft hea ddi t i onofAl l(O S 4) Of or m pe r gi l l usnz ie rv a nTi e g m. he ofa myl a s ebyAs ･ . ･ . ･ . ･ - Conr to1 1. 05 M. ; i′. -. 1 0 13M. ぺ 1 0 -4M. △･ -.
(8) 1 00. 近 畿 大 学 農 学 部 紀 要. 第 5号. (1972). Al2( soヰ) ｡を添加 した場合 には,1 0-6-1 0 -7M において amyl aseの生 成が促進 され最適濃度は. 0S Mとか な り濃度が高 くて も無添加 の ものにたい して約 この範 囲内にあ る もの と考 え られ る｡1 8 0 % の酵素 の生成が認め られ, それ よ り高 濃度 ではAl 什の阻害作用が あ らわれて くる｡ 高濃度 の金属塩類 を添 加 した場合 には菌 の生育 が抑制 され,amyl aseの生成 もほ とん ど認め ら れ ないか少量 であ るか, その生 成量や塩類 濃度 の範囲は塩類 の種類 に よって著 し く異な るこ とが 認め られ た｡. amyl aseの生成には比較的過剰 の窒素 源が よ く, リン酸 の添加や ,Ca≠. 有効 であ る とB.S.. 1 ) は報告 してい る｡液化 amyl aseは 1分子 中に 2原子 のCaが含 まれてお り,Ca≠ は LU L L A 等1 amyl aseの作用 を促 進 させ , また酵素 の保護作用 をもってい る｡ aseについては,Ca≠ で保 護 され, その作用 は Mg≠ ,K+,Na+ で も代用 され, 細菌 amyl aseではCl 動物 よ りえ られた液化 amyl. に より活性化 され る｡ しか し酵素 の活性化 イオ ン とし. ase,糖化 amyl aseに どの よ うな効果 があるかは末 て知 られてい る各種の金属 イオ ンが液化 amyl だ充分 明 らか に され ていない｡. Mn≠ は種 々の酵素す なわち,ATPase,ri bof l avi n ki nase,phosphopyruvae tse, t,hydraa aase, p. yruvat edecaro b xy l ase,ma8 Al ≠ al kal i ne phosphf 1t edehydrogenaseな どを活性 化 し, はpyruvat edecarboxya lse の活性化 イオ ンであ り, またCu廿 は cyo tchrome C oxi dase,. ascorbi. cac. i dox. i dasep , henoloxi daseに含有 されている｡ さらに またMn廿 に よって活性化 さ れ る酵素 には enoa lse,oxao laceaed tt ecarboxya lse,i soci t rat edey h drogenase,oxao laceae tt. iase 等があ る｡MnC12,AI…(S o. ヰ) 3,CuSO｡ の添加 に よ り amyl ase の生成に hydroa lse,argn 促 進効 果の あ ったのは,前記の酵素か関係 してい る炭水化物代 乱. TCAcyce l お よびア ミノ酸代. 謝等 に これ らの金属 が効 果的に作用 して細 胞の代謝 を活発に し, その結果 として効 果が あ らわれ た もの と推察 した｡Hg≠ ,Pb≠ ,Ba≠ は酵 素 の活性 化 イオンではな く,む しろ殺菌剤等 とし. aseの生成にたい して阻害 的に作用 した もの と考 え られ る｡Zn≠ , て広 く利用 されてお りamyl Co≠ ,N了 は酵素の活性化 イオンとして知 られ て い るか,amyl aseの生 成に促 進効 果が認め ら れず,Sn廿 は活性化 イオ ン としての作用 はあ ま り認め られてお らず,や は り酵素 の生成 に促 進. aseの生成 と直接 関係 を持 たない もの と推察 した｡ 効 果が なか ったこ とか ら, これ らの金属 は amyl. Ⅳ. 要. 約. As perg. i l lsn u i ge r va. n Ti eghem に よる液化 amyl ase,糖化 amyl ase の生 成に たいす る各種 の金属塩頬の影響 につ いて検 索 した｡. MnC12, AI…( Soヰ)3C ,uSO｡の添加 に よ り, 液化 amyl aseおよび糖 化 amyl aseの生成 にたい して促. 0 -5 -1 0 7M,Al2( Sod) ｡では 1 0 -. 16-1 0. -7M,CuSO｡ 進効果か認め られ, その濃度 は MnClZでは 1.
(9) 鎌 田秀郎 :Aseg prl l lsT u l ie grの. a myae lsの生成にたいす る金属塩類の影響 に関す る研究. 1 0 1. では 1 0JIM であ った｡ と くにMnC12,AI皇( SO.) ｡の添加 は酵素 の生成 に有効 であ るこ とが認め ら れ わo. HgCl2,PbSO.,BaC12の添加 の場合 には,amyl aseの生成は 1 0-7M で も阻害 され,HgCl ㌔･ は1 0ー3 -1 06 M,PbSO.では1 03 -1 05 M,BaC12 では1 03 -1 05 M で酵素 の生成が あまり認め られず,菌 の生育の抑制 も著 しい｡. snc12,CoC12,Ni C12,ZnSO.では低 濃度 の 1 06 M,1 0 7M にお いて も amyl aseの生成にた い し促 進効 果が認め られ なか った｡. Mn+ ,A l 廿 ,cu廿 の促 進効 果 は ,TCAcyce l,炭水化物代謝,ア ミノ酵代謝 を活 域に し, そ の結果 として効 果が あ らわれた もの と推察 した｡. Ⅴ. 文. 献. 1)M. L CALDWELL RM. . CHET S ER,AH ..DOEBBuNG ad n G. VoLZ:. J BilC o. he m･11. ,6, 361 へ3 ′65(9 145). M.HANRAHAN, M. C e .o. S c,75,0 4 30∼4034(9 153) 2)V. L CALDWELL :. J Am.hm 3)LLPHILP n L CALDWELL :ii L IS adM.. bd. ,73,3559へ3 .563(9 151a ) L PHILP L IS adM.. n L CALDWELL :ii bd. ,73,3563へ3 ノ568(9 151b) 4)L. 5)G. CoLEMAN adW n . H.ELLO ITT :Bice ohm.. J,83,256′ ヽ263(9 162) 6) J. CoNNELLAN a M. ndDC ..SHAW :JB . ilC o. he mリ245,2845へ2 ノ851(9 170). LJACOBB :J.Bat c. ,55,813へ8 ノ21t9 148) 7)NM. n . ERB,RT ..WIT S HOFF adW.. 1 943) 8)橋本 :日農化 , 19,487-503 ( 9)植物栄養実験編集委 員会 :植物栄養学実験 ,P1 86,朝倉書店 ( 1 959). 1 0)植物栄養学実験編集委 員会 :植物栄養 学実験 ,P1 87,朝倉書店 ( 1 959). ll)BS ..LuLLA :Bi oc hi.t m eBi oph y, sAc T a ,7,4 2 4∼259(9 1 51 ). l l i.
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