鶏のα-アミラーゼに関する研究(その1)

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鶏のα-アミラーゼに関する研究(その1)

佐  藤  雅  子

Studies on chicken α-amylase Masako Sato 序 論 動物のα-アミラ-ゼとしては,唾液や障賊のα-アミラ-ゼがよく知られている｡ところが鶏の組 織のα-アミラーゼ活性を測定していた折,肺臓にもかなり強いα-アミラーゼ活性が認められたの で,この酵素を精製分離しその性質を検討したいと考え本実験を行なった0 実験方法 Ⅰ.試料の調製 鶏の肺臓は死後出来るだけ早く冷アセトンに浸漬し,数日後乳鉢にて磨砕し,2倍量のアセトン で3回,アセトン･エーテル等量混液で3回,最後に等量のエーテルで3回,それぞれ激しく撹拝 した後ヌッチェで吸引し,脱脂並びに脱水した｡エーテルを完全に蒸発させ,セイン状部分や肺臓 の膜などを取除いた後,真空デシケ-クーで乾燥した｡この操作により牌臓の約20%に相当する淡 褐色の粉末が得られた｡ ⅠⅠ.酵素活性の測定 α-アミラーゼ活性の測定はBlue-Value法1'に従い,アミラーゼによる澱粉のヨード呈色の変化 から求めた｡即ち1.196可溶性澱粉2mlにVeronal緩衝液lmlを混和し55-Cの恒温槽中で5分 間予温してから酵素液lmlを加え30分間反応させ0.5N酢酸10mlを添加し反応を停止させ た｡この中の1mlを,0.005%;ヨード溶液10mlと反応させ分光光電光度計で700mixの吸光度を 測定した｡対照として,酵素液のかわりに水lmlを加えて同様の操作を行った｡ 酵素活性度単位は55-C,30分間に700mjuの吸光度を10%低下せしめた基質のmg数で表わし た(DBi55-30 rng′A) 実  験  結  果 I.酵素の精製 1)抽   出 上述のごとく調製した乾燥粉末約60gを15倍量の0.25M酢酸ナト1)ウムに分散させト1)オール 及びオクチルアルコールを加え2日間徐々に撹拝しながら抽出した｡遠心分離して濃赤紫色透明液 A

を取出した｡ 2)アセトン分別 抽出液に冷アセトンを横枠しながら徐々に滴下しアセトン40-80%の分別を行った｡沈澱は150 mlの水で溶解し再びアセトン30-80%の分別を行い沈澱を75mlの水に溶解した｡ 3)硫安分別 溶液は0.1NアンモニアでpH8.0に調製し,同じpHに調製した冷飽和硫安溶液を徐々に加え 硫安0.45飽和の分別を行った｡この状態で酵素は安定していたので,酢酸抽出→硫安0.45飽和ま での操作を繰返し行い酵素を貯えた｡尚抽出操作では再抽出液についても同様の操作を行った｡抽 出-硫安分別を10回いこれらを全部合して遠心分離し沈澱を200mlの水に溶解した｡同様にして 再び冷飽和硫安溶液を加え硫安0. 35飽和の分別を行い沈澱は200 mlの水に溶解した｡ この溶液は予めlN酢酸ナトリウムで処理したAmberite CG-50, 50gの樹脂層を通過させ so42-をAc と交換した｡同様に再度,新しい樹脂層を通過させ水で洗った｡ 4)アセトン分別 引続き更にアセトンを滴下しアセトン80%の分別を行い沈澱は慧Tris緩衝液, pH8.0に溶解 L Sephadex G-25で濃縮した｡ 5) Sephadex G-75によるカラムクロマトグラフイ 濃縮液のうち10mlを予め溶媒で平衡化したSephadex G-75のカラム(2.8>く98cm)に添加

患I.0

200    BOO    400    如    QOO    アOl 溶  出 音 (*xJ 第1図  Sephadex G-75によるカラムクロマトグラフイ-溶媒:芸Tris緩衝液, pH8.0 カラム: 2.8×98cm   溶出速度: 15ml/hr

84 _{佐  藤  雅  子} し,芸Tris緩衝液, pH8.0を溶媒とし15ml/hrの流速で溶出を行-た.溶出液の蛋白量は 280maの吸光度から測定した｡ その結果第1図に示すごとく蛋白質画分Aと蛋白質画分Bとの2つの主要成分に分離した｡ 各段階に於るα-アミラーゼ活性は第1表に示した｡ 表から明らかなようにSephadexG-75により分離した2つの蛋白質画分A及びBはいずれもα-アミラーゼ活性を示した｡これら2種のα-アミラーゼを比較してみると,蛋白質画分Aはカラム に添加した試料の比活性度とほとんど大差はなかったが,蛋白質画分Bの活性度は非常に高く,比 活性度はカラム試料の約30倍に相当し,かなり純度の高いα-アミラーゼであると思われる｡ _{40 TriS} 緩衝液で溶出した蛋白質のN量はカラム試料の54%であり,残りはカラムに吸着したものと思われ m 酢酸抽出液をアセトン分別,硫安分別,ゲルロ過を行うことにより,蛋白質画分Aは酢酸抽出液 の約20倍,蛋白質画分Bでは約600倍に純度が高められたことがわかる｡ 第1表  精製過程におけるα-アミラーゼ活性 Ⅰ アセトン分別および硫安分別 D品-30' g恩糾,凝滞濫N 液   量 匡IiilD: 活 性 度 DB5m5g30'A/ml 酢 酸 抽 出 液 アセトン 40-80% 溶   解   液 アセトン 30-溶   解   液 硫 安0.45飽 和 溶   解   液 硫 安0.35飽 和 溶   解   液 ト 回 回 mm ア ン 溶溶 8解 0 %液液 解 Ⅱ 1 5 9   仙 00 00 84 1    タ 37 73 Sephadex G-75によるカラムクロマトグラフイ-ラ 自 白 力蛋蛋 0 0 5 1 3 0 1   1 0 5 0 0 4 1 5 1 0 メ      タ 8     2 4 1, 000 1, 090 29, 100 ⅠⅠ.酵素の性質 Sephadex G-75により分離した蛋白質画分A及びBは凍結乾燥し,要時水で溶解後,透析して 塩を取除き酵素溶液とした｡

1)最 適pH

種々のVeronal緩衝液を用い55-Cに於る蛋白質画分A, Bの最適pHを求め第2表に示した｡ 【コ

第2表  最    適    pH 表よりA,    両アミラーゼはいずれもpH6.75で最も高い活性を示すことがわかった｡

2)最適∑妻 温度

pH 6.75 一一ごつ条件下でA, B両酵素を種々の温度で反応させ最適温度を求めた｡その結果は第3秦 に示すようーrf一二, A, B南アミラ-ゼほいずれも最適温度55oCであり, 60oC, 65-Cでかなり酵素活 性は低下し-=i読二. 第3表  最   適   温   度 二 一五 豪､ ､ ＼､ 選 竺 _{3 5 4 0} 4 5 50 55 6 0 6 5 蛋 白 質 画 分 A 4 8 .2 1 20 1 54 1 07 1 8 1 1 27 2 00 1 59 1苧77 .6 6 4 .21 8 .9 蛋 白 質 画 分 B 3 1 .1 7 6 .4 3)分解三≒≡≡≡巨成物 澱粉溶液(.r一二A, B両アミラーゼを加え pH 6.75, 55oCで6嘩間分解し(ヨ-ド澱粉反応は無 色であった二  1,マルトース,グルコ-ス標品と共に上昇法によりペ-パークロマトを行い, A, B 南アミラー一一一一ゼの分解生成物を検討した.溶媒はn-ブタノ-ル:酢酸.･水(4:1:5)及びn-ブクー ル:ピ1)ジ =  J :水(3:2:1.5)を用い,ベンゼント1)クロル酢酸で糖の検出を行った｡その結果, A, B南ア  一一二ミラーゼは澱粉を分解してマルトースを生成することがわかった｡ 4)各穣華塞機物の影響 ･･1卵湾-蔓性澱粉にVeronal緩衝液を混和後,各種無機物を蒜になるように添加し酵素液 を加え, a-  -アミラ-ゼ活性を測定した.活性度は無機物を添加しない時の活性度を100とし,それ に対する相≒〒うー寸活性度であらわした｡ その結果i･:  -ま第4表に示すように, A, B両アミラーゼは各種無機物に対してほとんど同じような 挙動を示す-   とがわかった｡即ち各種無機物の中ではCaCl2, NaCl, Na2SO,, KClなどの無機物

第4表 各 種 無 機 物 の 影 響 無 機 物 相 対 .iu舌■性 度 無 機 物 相 対 活 性 度 蛋 白質 画 分 A 蛋 白質 画 分 B l 蛋 白 質 画 分 A 桓 自 質 画 分 B n o n e ‡ 10 0 1 00 B a C l2 9 5 8 9 L i2S O 4 N a C l N a 2S O 4 ‖ 0 20 70 7 1 01 M n C L 8 7 8 3 1 05 F e S O 4 8 4 9 2 1 01 F e C 13 30 27 N a N O , 10 0 9 8 F e 2(S O 4) , 4 6 4 4 K C l 2 1 0 5 10 7 C 0 C 12 8 5 7 2 M g C l, 1 0 0 1 10 2 C u S O 4 0 0 M g S O 4 】 100 10 2 Z n S O 4 0 0 C a C L 1 11 108 S n C L 8 0 7 8

86 _{佐  藤  雅  子} ほ酵素活性を高めたのに対し, CuSCX, ZuS04は酵素反応を全く狙害してしまった｡ 5)金属の影響 α-アミラーゼは金属と密接な関係を持っており,透析操作あるいはEDTAの反応により酵素活 性は低下すること2' Ca2 を補うと可逆的に酵素活性を回復することが報告されている2'｡ そこで鶏の肺臓の両アミラーゼについて金属の影響を検討してみた0 ②EDTAに対する安定性 A, B両酵素溶液にEDTAを種々の濃度になるように添加し室温(15-18oC)に10分間放置後 α-アミラーゼ活性を測定した｡酵素活性はEDTAを加えない時の活性度を100とし,それに対す る相対活性度であらわした｡ その結果は第5表から明らかなようにA, B両アミラーゼはいずれもEDTAに対してかなり不 安定であり, EDTA濃度蕊では, 10分間の反応で酵素活性を全く失ってしまった｡蛋白質画分 Bは画分Aに比べて一層EDTAに対して不安定であった｡ 第5表  EDTA に 対 す る 安 定 性

≡≡ 喜= Jk三 二 こ い

1000 ト蒜 M

Too" 50

A

再

対 活 性 震

い 307｢4

呂昌

74.3

76

3

1 3

B

再

周 活 性 夏

上 87.8

00

3●

7 日 昌●

5 - 00

"

②各種金属の補足効果 まず酵素溶液にEDTAをM-100になるように添加し室温に10分間放置後,Ca2+を各種濃度にな るように加えα-アミラーゼ活性を測定した｡活性はEDTA及びCa2十を添加しない時の活性度を 100としそれに対する相対活性度であらわした｡ その結果は第6表Ⅰに示すようにA,B両アミラーゼはいずれもEDTA添加により酵素活性を 全く失っていたが,Ca2+を補うことにより可逆的に活性を回復することがわかったW6EDTA 濃度に対してCa2濃度は芸の場合に最も回復効果は大きいことを知った0 第6表金属の補足効果 ICa2の補足効果

＼

Ca 濃 度

酵素

活

性

度 ＼ ＼

0

1%

t

M_

50

_M10

A

語 対 活 性 夏

日

蓋去●

3

l 喜

3●

1

14.2

₁₅

B

語 対 活 性 夏

日

日 2.4

5

≡3.0

6

去7.5

0

1 -∼ -1   1

Ⅱ 各種金属の補足効果

鯨

一

志 妄至竺竺

none

M g2

Ba2+

Sn2+

Co24 t M n2+

Fe2+

A

鮎 鮎 針

3

54.5

56

51.9

52

48.7

50

5.8

6

3

0

₀

ーB

庸 対活性豊 川

24.4

28

17

20'6 I 打

4

3.5

00

毛 呂

そこでCa2以外の各種金属を詔になるように添加し, Ca2の場合と同様に行いその回復効果を 検討してみた｡

その結果第6表Ⅰから明らかなようにA, B両アミラーゼはいずれもCa2 のほか, Mg2+, Ba2 Sn2 などの金属を補うことにより可逆的に酵素活性を回復することを知った｡金属相互の間では回 復効果に幾分相異がみられたが Ca2+, Mg2+, Ba2+, Sn2+の補足により蛋白質画分Aでは50-60#; 画分Bでは20-400/Oの酵素活性を回復した｡これに対しCo2+, Mn2+, Fe2+などの金属の補足効果 はみられなかった｡ 以上の実験から鶏の肺臓α-アミラーゼは金属と密接な関係を持っていることを知った｡次にか アミラーゼは金属の中でもCa2 は重要であり精製過程で酵素を保護すること3',結晶アミラーゼの 失活を防ぐためにCa2 を添加すること4'が行われており Fisher2は金属分析の結果,各種α-ア ミラーゼはカルシウムを含む金属蛋白質であることを報告している｡そこで本実験でもカルシウム について検討を行なった｡ ⑨Ca2 の最適濃度 酵素反応に於るCa2 の最適濃度を知るために,酵素液にCa2 を各種濃度になるように添加し, α-アミラーゼ活性を測定した.活性はCa2 を加えない時の活性度を100としそれに対する相対活 性度であらわした｡ その結果は第7表に示すようにA, B両アミラーゼはいずれもCa2 の濃度に比例して相対活性度 は高まったが,蛋白質画分Aでは芸Ca2で,画分Bでは蒜Ca2で活性は最も高くそれ以上の Ca2 濃度ではかえって活性は低下する傾向がみられた｡ ④熟処理に対するCa2の影響 酵素液にCa2を蓋になるように添加したものと無添加のものを種々の温度で10分間熟処理し, 直ちに氷水中で冷却後α-アミラーゼ活性を測定した｡活性は熱処理をせずCa2←を加えないものの 第7表  Ca2+ の 最 適 濃 度

88       佐  藤  雅  子 第8表  Ca2+の熱処理に対する保護効果 ^---.us. &M"---C203040 W/g'feg''---.Caサ+mmJn999186 Ca*+mM10710095 RCa2+&｣jsJp999089 ca*+^Jp1059895廿日 活性度を100としそれに対する相対活性度であらわした｡ その結果は第8表に示すようにA, B両アミラーゼはいずれもCa2 無添加の場合は40-C以下の 熱処理に対してほかなり安定しているが温度の上昇に伴って不安定になり,蛋白質画分Bは55℃, A画分では60oCの熱処理で完全に酵素活性を失ってしまった｡これに対しCa2 添加したものは 50oCの熱処理でも相対活性はかなり高く, 55oCでやや低下するが, 60oCの熱処理でも20-40^の 相対活性を保っていた｡蛋白質画分Bは画分Aに比べて熱処理に対して幾分不安定であった｡ この実験からCa+ ほ熱処理に対して酵素を保護することがかわった｡ ⑤pHに対するCa2の保護効果 酵素液にCa2を卦こなるように添加したものと無添加のものに各種pHのVeronal緩衝液を 加え,室温(15-18oC)にlhr放置後, α-アミラ-ゼ活性を測定した Ca2 無添加のものでpH 6.75のVeronal緩衝液を加k,たものの活性度を100としそれに対する相対活性度であらわした. その結果は第9表に示すようにA, B南アミラ-ゼはいずれもCa2 無添加の場合にはアルカ1)の pHに対してほ,不安定であり, pH9.34で酵素活性を失ってしまったが Ca2 を添加したものは, アルカリのpHに対して活性の低下は緩慢でありpH9.34でも30-50 の活性を保っていた｡ この実験から豚の障臓α-アミラーゼ6'に見られる程,顕著ではなかったけれども, Ca2+ほアル カリのpHに対して酵素を保護することがわかった｡ 第9表  Ca2+のpHに対する保護効果

酵素 一

志

3.20

4.10

5.20

6.45

巨 25 巨 55 巨 64

A

0

₀

日 2

6 日 日

133

三 + 圭

三 1 2宇

B

呂

55

60

呂

103

99

壬

2

56

95

0

55

考       察 鶏の牌臓からアセトン分別,硫安分別及びSephadexG-75によるゲルロ過により2種のα-アミ ラーゼを分離した.これら2種のα-アミラ-ゼはその諸性質を調べた結果,最適pH,最適温度い ずれも同じであり,各種無機物や金属に対する挙動もほとんど同じであったことなどから,同じ作 用機作をもつα-アミラーゼであると思われる｡蛋白質画分Bは画分Aに比べて酵素活性は非常に高

く,比活性では画分Aの約30倍に相当し,蛋白部分がかなりはずれたほとんど活性基からなる α-アミラーゼであると思われる｡鶏の肺臓中に2種のα-アミラーゼが存在していたが, Millionら7)8) は人の唾液からSephadex, j)ン酸カルシウム, DEAEセルロースを使ったカラムクロマトグラフ ィにより3種のα-アミラーゼを分離しており,この3種の中で最も量的に多く安定性の強いものが Meyerら9)がアセトン分別,硫安分別によって結晶化したα-アミラーゼであろうと述べている｡ 大賀ら10'もAsp. Oryzaeから硫安分別, DEAE-Sephadexにより4種のアミラーゼを分離して いる｡ これら牌臓のα-アミラーゼの性質を唾液や障臓など他の組織のα-アミラーゼと比較してみると, 澱粉を分解してマルトースを生成すること,最適pHは大体中性付近にあること11)金属と関連性 を持っているなど,同じような傾向がみられたが,牌臓のα-アミラーゼが生体内でいかなる生理機 能を営んでおり,又他の組織のα-アミラーゼといかなる関係にあるか今後更に検討を加えたい｡ 要        約 1)鶏の牌臓からアセトン分別,硫安分別及びSephadex G-75によるゲルp過により, 2種の α-アミラーゼを分離した. 2) 2種のα-アミラーゼの性質はほとんど同じであった｡ ① 澱粉を分解してマルトースを生成する｡ ② 最適pH6.75,最適温度55oCである｡

⑧ 各種無機物の中ではCaCL, Na,S04,KCl, NaClなどが酵素活性を促進し, CuS04, ZnS04 などほ狙害する｡ ④ EDTAにより酵素活性を失う｡ ⑤ EDTAにより失活した酵素はCa2+, Mg2+, Ba2+, Sn2 トなどを補うと可逆的に酵素活性を 回復する｡ ⑥ カルシウムは熟及びアルカリのpHに対して酵素を保護する0 本研究に当り御指導いただいた奈良女子大学栄養学教室浜口陽一教授に厚く感謝致します｡ 文 献

1) H. Fuwa: J. Biochem (Japan) 41, 5 (1954),末掘四郎:酵素研究法2, 108.

2) Bert. L. Valle, Erie A. Stein, William N. Sumerwell & Edmond H. Fisher : J. Biol. Chem.,

234, 2901 (1959)

3) Erie A. Stein & Edmond H. Fisher: J. Biol. Chem. 232, 867 (1958) 4) S. Akabori: J. Biochem. (Tokyo), 43, 741 (1956)

5) M.L. Calwell & Jo-fen Tung Kung: J. Am. Chem. Soc, 75, 3132 (1953) 6) Edmond H. Fisher & Erie A. Stem: The Enzyme 4, 234 (1962)

7) D.J. Millin & M.H. Smith: Biochem. Biophys. Acta., 62, 450 (1962)

蝣*

銀

90      佐  藤  雅  子

9) K.H. Meyer, E.H. Fisher, A. Staub & P. Bern丘eld: Helu. Chem. Acta., 31, 2158 (1948)

10) Yuhei Morita, Katuzo Shimizu, Miyoko Ohga & Toshiko Korenaga: Agr. Biol. Chem. 30, 114 (1966)