抗リン脂質抗体症候群における動脈血栓の発症機序：β2-グリコプロテインIに特異的なリガンドと自己抗体の関与

抗 リン脂 質 抗 体 症 候 群 に お け る動脈 血 栓 の 発 症 機 序:

β2-グ

リコプ ロ テ イ ン Ⅰに特 異 的 な リガ ン ドと自 己抗 体 の 関 与

劉

慶

平

キ ー ワ ー ド:antiphospho1ipid syndrome(APS), atherosclerosis, autoantibody, β2-glycoprotein I (β2-GPI), oxidized LDL (oxLDL)

緒

言

抗 リ ン 脂 質 抗 体 症 候 群(antiphospholipid

syn

drome, APS)と

は,動

・

静 脈 血 栓 や 習 慣 流 産 な どの

臨 床 症 状 を 有 す る 難 治 性 の 自 己免 疫 疾 患 で,抗

カ ル

ジ オ リ ピ ン 抗 体(aCL)や

ル ー プ ス ア ン チ コ ア グ ラ ン

トな どの い わ ゆ る “抗 リ ン脂 質 抗 体 ” に よ る 易 血 栓

性 が 基 本 病 態 で あ る1)2).1990年 に3つ

の 研 究 グ ル ー

プ,す

な わ ち,Matsuuraら3),

McNeilら4),

Galli

ら5)に よ っ て,aCLが

カ ル ジ オ リ ピ ン(CL)そ

の も

の を認 識 して い る の で は な く,CLな

ど の 陰 性 荷 電 リ

ン脂 質 と β2-グ

リ コ プ ロ テ イ ン Ⅰ(β2-GPI)と

の

複 合 体 に 結 合 す る こ と が 明 ら か に さ れ,さ

ら に,

Matsuuraら6)は,β2-GPIそ

の もの が 真 の 対 応 抗

原 で あ る こ と を 明 ら か に し た.

β2-GPIは,5個

の ス シ ドメ イ ン と呼 ば れ る繰 り

返 し構 造 か ら な る分 子 量 約5万

の 塩 基 性 糖 タ ン パ ク

質 で,リ

ン 脂 質7,ヘ

パ リ ン8),あ る い は 活 性 化 血 小

板 や ア ポ トー シ ス 細 胞9)10)と結 合 す る.第5ド

メ イ ン

の リン 脂 質 結 合 部 位 を 介 して β2-GPIが

リン 脂 質

な ど に 結 合 す る と,crypticな

エ ピ トー プ が 現 れ る こ

と が 示 さ れ て い る11-14)一 方,aCLの β2-GPIに 対 す る 親 和 性 が 低 い こ と も 示 さ れ て い る15-18). β2-GPIは,肝 臓 で 合 成 さ れ,単 独 も し く はVLDL やHDLな ど の 血 漿 リ ポ タ ン パ ク 質 と の 複 合 体 と し て 正 常 人 血 漿 中 を 約200μg/mlの 濃 度 で 循 環 す る19). β2-GPIは,リ ン 脂 質 依 存 的 な 血 液 凝 固 反 応 の 抑 制 活 性,す な わ ち,内 因 性 凝 固 反 応 の 抑 制20),ADP依 存 的 な 血 小 板 凝 集 の 抑 制21),お よ び ト ロ ン ビ ン やXa の 生 成 阻 害22)23)な ど の 活 性 を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る ほ か,リ ポ タ ン パ ク 質 リ パ ー ゼ を 活 性 化 す る こ と よ り ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質Hと も 呼 ば れ て い る24). と こ ろ で,LDLの 酸 化 に は,動 脈 硬 化 の 発 症 ・進 展 に 重 要 な 意 義 が あ る.す な わ ち,動 脈 硬 化 病 変 の 初 期 段 階 で,単 球 由 来 の マ ク ロ フ ァ ー ジ が ス カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 を 介 し て 酸 化LDLを 取 り 込 む こ と で 泡 沫 化 し,動 脈 硬 化 巣 を 形 成 す る25-30). 方,APSに お い て,動 脈 血 栓 形 成 へ のaCLの 関 与 に つ い て も 議 論 さ れ て い る31-33).1997年 に Hasunumaら は,β2-GPIお よ び 抗 β2-GPI自

己 抗 体 の 結 合 に よ っ て,Cu2+に よ る 酸 化LDLの マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ る 取 り 込 み が 著 明 に 増 加 す る こ と を 報 告 し た34).さ ら に,筆 者 ら は,β2-GPIの 特 異 的 な リ ガ ン ド(oxLig-1)が コ レ ス テ リ ル リ ノ レ ー トの 酸 化 体 の1種,9-(7-ketocholest-5-en-3β ylOxy)9-oxononanoic acd,で あ る こ と を 明 ら か に し た35).今 回 は,oxg-1を は じ め と す る オ キ シ ス テ ロ ー ル(7-ケ ト コ レ ス テ ロ ー ル7KC)と (平 成13年12月3日 受 理) 岡 山 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 細 胞 化 学 分 野 指 導:保 田 立 二 教 授 論 文 請 求 先:岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 細 胞 化 学 分 野 TEL: 086-235-7402 FAX: 086-235-7404 E-mall:[email protected]

ω 位-カ

ル ボ キ シ ル 化 短 鎖 脂 肪 酸 との コ レ ス テ リル

エ ス テ ル が,β2-GPIお

よ び 抗 β2-GPI自

己抗 体

の 関 与 す る マ ク ロ フ ァ ー ジ に よ る 酸 化LDLの

取 り

込 み お よ びAPSで

の 動 脈 血 栓(動

脈 硬 化)の

形 成

に 関 与 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た の で 報 告 す る.

材 料 と 方 法 1)  試 薬 L-α-Dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS), 7-ketocholesterol (5-cholesten-3β-ol-7-one, 7KC)お よ びcholesteryl linoleate(5-cholesten

3β-3-lino1eate)は, Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)よ り購 入 し た. Dioleoylphosphatidyl choline (DOPC)は, Avanti Polar Lipids Inc.

(Alabaster, AL)よ り 購 入 し た. L-3-Phos phatidyl-[n-methyl-3H] choline, 1, 2-dipal mitoyl ([3H]-DPPC) (80Ci/mmol)は, Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)よ り購 入

し た.そ の 他 の 試 薬 に つ い て は,試 薬 特 級 の も の を 用 い た. 2)  ヒ ト β2-GPIの 精 製 β2-GPIは,健 常 人 血 漿 を ヘ パ リ ン ー セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム,DEAEセ ル ロ ー ス カ ラ ム,お よ び 抗 β2 GPI抗 体 ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を 用 い て 精 製 し た36). さ ら に,プ ロ テ イ ンA-セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム に か け て 爽 雑 す るIgGを 除 去 し た.な お,結 合 脂 質 を 除 去 す る た めn-プ タ ノ 用 ル に よ る 洗 浄 を 行 っ た. 3)  モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体

WB-CAL-1抗 体(IgG 2a)は,APSの 動 物 疾 患 モ デ ル(NZW×BXSB) F1 (WBF 1)マ ウ ス か ら 樹 立 し た β2-GPIのcrypticな 構 造 を 認 識 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 β2-GPI自 己 抗 体 で あ る37). Cof

23(IgG 1)お よ びCof-22 (IgG 1)は,ヒ ト β2 GPIを マ ウ ス に 免 疫 し て 得 た ヒ ト β2-GPI の native な 構 造 を 認 識 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で あ る12). 4)  酸 化LDLの 調 製 LDL(比 重: 1.019-1.063g/ml)は,健 常 人 血 漿 か ら 超 遠 心 法 に よ り調 製 し た38).タ ン パ ク 質 濃 度 と し

て100μg/mlのLDLを,5μMCuSO4と

共 に37℃,

8時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後,EDTA(最

終 濃 度1

mM)を

加 え て 反 応 を止 め,1mMEDTAを

含 むPBS

で24時 間 透 析 し た.マ

ロ ン ジ ア ル デ ヒ ドを 標 準 物 質

と し て,チ

オ バ ル ビ ツ ー ル 酸 反 応 性 物 質 量 を 測 定 し

た ほ か39),ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 に よ る移 動 度 を指 標 に

LDLの

酸 化 度 を 確 認 し た.調

製 し た 未 処 理LDLお

よ び 酸 化LDLか

らFolchら40)の

方 法 に よ り脂 質 抽

出 を行 っ た.

5)  LDL脂

質 画 分 へ の β2-GPIお

よ び 抗 β2-GPI

自 己 抗 体 の 結 合 試 験

β2-GPI結

合 量 の 測 定 の た め に,脂

質 画 分(40

μg/ml, 100μ1/we11)をELISAプ

レー ト(lmmulon

lB, Dynex

Technologies

Inc, Chantilly)に

固相

化 し,β2-GPI

(30μg/ml, 50μ1/well)お

よ び 抗 β

2-GPI抗

体(Cof-23)を

順 次 室 温 で1時

間 イ ン キ ュ

ベ ー ト し た .抗

β2-GPI自

己 抗 体 の 結 合 量 の 測 定

の 場 合 に は,同 じ脂 質 固相 化 プ レー トで β2-GPI

(15

μg/ml)お

よ びWB-CAL-1自

己 抗 体 を 同 時 に1時

間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.さ

ら に,西

洋 ワ サ ビペ ル オ

キ シ ダ ー ゼ(HRP)標

識 抗 マ ウ スIgG抗

体 を こ れ

らの プ レ ー トに 入 れ1時

間 イ ン キ ュベ ー ト した 後,

o-フ ェ ニ レ ン ジ ア ミ ンで 発 色 させ490nmの

吸 光 度 を

測 定 し た.各

処 理 間 に,0.05%

Tween

20含 有PBS

で ウ エ ル を 充 分 に 洗 浄 した.

6)  薄 層 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー(TLC)と

リガ ン ドプ

ロ ッ ト

シ リ カ ゲ ル 薄 層 プ レ ー ト(Polygram,

Machery

Nagel, Duren, Germany(リ

ガ ン ドブ ロ ッ ト用)あ

る い は PLC

silica gel-60, Merck,

Darmstadt,

Germany(分

取 用))に 脂 質 検 体 を ス ポ ッ トし,ク

ロ

ロ ホ ル ム/メ タ ノー ル/30%ア

ン モ ニ ア水/水(120/80/

10/5,溶

液A)ま

た は ク ロ ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル(8/

1,溶

液B)で

展 開 し た.展

開 後,脂

質 を ヨ ウ素 あ

る い は モ リブ デ ン 試 薬 に よ り染 色 し た.

リガ ン ドプ ロ ッ トは,展

開 後 のTLCプ

レ ー ト を

1%BSA含

有PBSで

ブ ロ ッ キ ン グの 後,β2-GPI

(20μg/ml),適

宜 希 釈 し たCof-22あ

る い はWB.

CAL-1抗

体,お

よ びHRP標

識 抗 マ ウ スIgG抗

体

を 順 次 イ ン キ ュ ベ ー ト し て 行 っ た35).な お,発 色 に は, H2O2と4-methoxy-1-naphtholを 用 い た.

7)  高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー(HPLC)

TLC分 画 に よ り得 ら れ た β2-GPIリ ガ ン ド粗 画 分 を 逆 相HPLCに よ り さ ら に 精 製 し た.精 製 に は,

C18カ ラ ム(250×4.6mm Sephasyl peptide, Phar macia)を 用 い,溶 媒C(ア セ ト ニ ト リ ル/イ ソ プ ロ パ ノ ー ル,3/7)と 溶 媒D(0.2%酢 酸)の 濃 度 勾 配 移 動 相{(50%溶 媒C-50%溶 媒D混 液(0分) 100%溶 媒C(l5分-40分)}お よ び 流 速0.5m1/min で 溶 出 し た.234nmの 吸 光 度 を モ ニ タ ー し た. 8)  質 量 分 析 HPLCに よ り 精 製 し た β2-GPIリ ガ ン ド(oxLig 2)の 質 量 分 析 をShim-pack VP-ODSカ ラ ム (150×4.6mm)を 接 続 し たLC/MS-QP8000α

(Shimadzu Corp., Kyoto, Japan)に よ るAPCI法 で 行 っ た.HPLCは,溶 媒C(ア セ トニ ト リ ル/イ ソ プ ロ パ ノ ー ル,3/7)と 溶 媒D(0.2%酢 酸)の 濃 度 勾 配 移 動 相{(50%溶 媒C-50%溶 媒D混 液(0分) 100%溶 媒C(15分-30分)}お よ び 流 速0.5ml/min で 行 っ た. 9)  β2-GPIリ ガ ン ド の 合 成 (1)

9-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-9-oxononanoic acid (oxLig-1)の 合 成7KC(50.1 mg, 0.125mmol)と azelaic acid (70.6mg,0.375 mmol)を 含 む ア セ ト

ン4mlに1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlor ide (WSC: 95.8mg, 0.50mmol)と4-dimeth

ylaminopyridine (DMAP: 30.5mg, 0.25mmol)を 添 加 し,室 温 で2日 間 撹 拝 し た 後 遠 心 し,ク ロ ロ ホ ル ム で 抽 出 し36.0mgの 合 成 品 を 得 た.1H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ=5.71(s, H, H-6), 4.78-4.69 (m,H, H-3); C-NMR (75.5MHz, CDCI 3): δ=202.5, 179.7, 164.5, 127.1, 72.4, 55.2, 50.4, 50.2, 45.8, 43.5, 39.9, 38.7, 36.6, 36.1, 29.2, 28.9, 28.4, 25.3, 25.0, 24.2, 23.2, 23.0, 19.3, 17.7, 12.4; m/z (FD-MS): 571 [(M+H)+, C36H59O5 requires 571]で あ っ た. (2) 13-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-13

oxotridecanoic acid (13-COOH-7KC)の 合 成

7KC (50.1mg, 0.125mmo1)と tridecanedioic acid (brassylic acid: 61.8mg, 0.25mmol)を 含 む ア セ ト ン4mlにWSC (95.8mg, 0.50mmol)とDMAP (30.5mg, 0.25mmol)を 添 加 し,室 温 で2日 間 撹 拝 し た 後 遠 心 し,ク ロ ロ ホ ル ム で 抽 出 し44mgの 合 成 品 を 得 た.1H-NMR (300MHz, CDCI3): δ=5.69 (s, 1H , H-6), 4.80-4.67 (m,1H, H-3); 13C-NMR (75.5MHz, CDCI3): δ=202.2, 179.6, 173.1, 164.7, 126.9, 72.3, 55.3, 50.5, 50.1, 45.3, 43.5, 40.6, 39.2, 38.6, 36.5, 36.0, 29.1, 28.8, 28.3, 25.2, 24.9, 24.1, 23.1, 22.9, 19.2, 17.6, 12.3; m/z(FD-MS): 627 [(M+H)+, C40H67O5 requires 627]で あ っ た. 10)  リ ボ ソ ー ム の 調 製 β2-GPIリ ガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム は,西 川 ら の 方 法 に 準 じ,次 の よ う な モ ル 比 で 調 製 し た41)(DOPC/ ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン(DOPS),コ レ ス テ リ ル リ ノ

レ ー ト, oxLig-1, oxLig-2, 13-COOH-7KC/3H

DPPC (80Ci/mmol) (100/0/0.00225; 90/10/ 0.00225; 75/25/0.00225; 70/30/0.00225; 50/50/ 0.00225)). 11)  マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の リ ボ ソ ー ム の 結 合 試 験 マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 細 胞(J774A.1細 胞) を12ウ エ ル プ レ ー ト で8×105cells/well, 37℃ で24 時 間 培 養 し た 後,無 血 清 培 地(Celgrosser-P,住 友 製 薬,大 阪)に 置 換 し て さ ら に2時 間 培 養 し た.PS ま た は リ ガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム を 加 え(100nmol脂 質/well),4℃ で2時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.さ ら に, J774A.1細 胞 に,β2-GPI (200μg/ml)お よ びWB CAL-1 (100μg/ml)存 在 下 で,コ レ ス テ リ ル リ ノ レ ー ト ま た は 各 種 リ ガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム(50nmol 脂 質/well)を 加 え,細 胞 に 結 合 し た 放 射 能 と 細 胞 の タ ン パ ク 質 量 を 測 定 し た.

結

果

1)  LDL脂

質 画 分 へ の β2-GPIお

よ び 抗 β2-GPI

自 己 抗 体 の 反 応 性

未 処 理LDLお

よ び 酸 化LDL由

来 の 脂 質 画 分 へ

の β2-GPIお

よび抗 β2-GPI抗

体 の 結 合 をELISA

に て 調 べ た と こ ろ,β2-GPIは

酸 化LDL由

来 の 脂

質 画 分 に 特 異 的 に 結 合 し た が,未

処 理LDL由

来 の

脂 質 画 分 に は 結 合 し な か っ た(表1).同

様 に,抗 β2

GPI抗

体(WB-CAL-1)は,β2-GPI依

存 的 に

酸 化LDL由

来 の 脂 質 画 分 に 強 い 結 合 性 を 示 し た.

2)β2-GPIリ

ガ ン ドのTLCに

よ る解 析

未 処 理LDLま

た は 酸 化LDLか

ら 抽 出 し た 脂 質

をTLCプ

レー トに ス ポ ッ ト し,溶 液Aで

展 開 した.

図1Aに

は,ヨ

ウ 素 染 色 お よ び モ リブ デ ン 試 薬 に よ

る リ ン の 検 出 を 行 っ た 結 果 を 示 し て い る.Cu2+処

理

し た 酸 化LDLか

ら の 抽 出 脂 質 画 分 に リ ゾ ホ ス フ ァ

チ ジ ル コ リ ン(lysoPC)の

増 加 が 見 られ た.図1B

に は,TLCプ

レー ト上 で β2-GPIお

よ び 抗

β2-GPI自

己 抗 体 を 用 い て行 っ た リガ ン ドブ ロ ッ トの 結

果 を 示 し た.β2-GPIお

よ び β2-GPIに

依 存 的 な

WB-CAL-1抗

体 の 結 合 を示 す 複 数 の バ ン ドが 酸 化

LDL由

来 の 脂 質 画 分 に 見 ら れ た.

3)  β2-GPIリ

ガ ン ド(酸 化 脂 質)の

精 製 と 同 定

図1に

示 し たTLCと

同 じ展 開 溶 媒Aと

分 取 用 シ

リカ ゲ ルTLCプ

レー トを用 い,Band-1お

よ びBand

2(分

取 用 プ レ ー トに よ るTLCで

は3本

の バ ン ド

の 中,下

側 の2本

に つ い て は 分 離 で き な か っ た)部

分 の シ リカ ゲ ル を プ レー トよ り削 り取 り,ク

ロ ロ ホ

ル ム/メ タ ノ ー ル 混 液 で 抽 出 の 後HPLCを 施 行 し た. C18カ ラ ム に よ る 逆 相HPLCで,各 々Band-1お よ びBand-2の 画 分 よ りoxLig-1お よ

びoxLig-2が27.2分 お よ び26.7分 に 溶 出 さ れ た(図2A,B). ま た,図2Cに は,合 成13-000H-7KCの 精 製 時 のHPLCク ロ マ ト グ ラ ム を 示 し た(28.9分 に 溶 出 さ れ た).こ の 様 に し て,精 製 さ れ た3種 類 の β2-GPI リ ガ ン ド のTLC-リ ガ ン ドブ ロ ッ トの 結 果 を 図3に 示 し た. ま た,質 量 分 析 の 結 果 を 表2に 示 し た.oxLig-1 に つ い て は,9-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy) 9-oxononanoic acidで あ る こ と を 既 に 報 告 し た35). 今 回,oxLig-2の ピ ー ク をMSで 解 析 す る と,正 イ オ ン モ ー ド で,プ ロ ト ン 化 分 子 イ オ ン(M+H)+と し てm/z627,お よ び フ ラ グ メ ン ト イ オ ンm/z383を, ま た,負 イ オ ン モ ー ド で は 脱 プ ロ ト ン 化 フ ラ グ メ ン ト イ オ ン(m/z243)お よ びm/z625お よ びm/z627 が 検 出 さ れ た.m/z383は,7KCの プ ロ ト ン 化 フ ラ 表1  LDL脂 質 画 分 へ の β2-GPIお よ び 抗 β2-GPI自 己 抗 体 へ の 結 合 未 処 理LDLま た は 酸 化LDLの 脂 質 画 分 を 固相 化 したELISAプ レー トで,β2-GPIとCof-23抗 体 あ る い はWB-CAL-1抗 体 を イ ン キ ュベ トし た. 数 字 は 結 合 を490nmの 吸光 度(n=2)を 示 す. 図1  LDL脂 質 画 分 のTLCお よ び リガ ン ドブ ロ ッ ト. 未 処 理LDLお よ び 酸 化LDLよ り調 製 し た 脂 質 画 分 のTLCを,溶 媒Aを 用 い て行 っ た.パ ネ ルA:ヨ ウ 素 お よ び モ リブ デ ン 試 薬 に よ る 染 色,パ ネ ルB:リ ガ ン ドブ ロ ッ トに よ る β2-GPIお よ び β2-GPI依 存 的 抗 β2-GPI自 己抗 体 の 結 合 性 の 解 析 結 果Chol: コ レ ス テ ロ ー ル,Glu-Cer;グ ル コ シ ル セ ラ ミ ド,Gal Cer:ガ ラ ク トシ ル セ ラ ミ ド,CL:カ ル ジ オ リ ピ ン, PE:ホ ス ア チ ジ ル エ タ ノー ル ア ミン,PC:ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リン,PS:ボ ス フ ァチ ジ ル セ リ ン,PA:ホ ス フ ァ チ ジ ン酸,lysoPC:リ ゾ ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン

グ メ ン ト と 一 致 し た. 表3に は,β2-GPIリ ガ ン ド,す な わ ち,合 成oxLig 1,精 製oxLig-2(以 下 に 解 析 結 果 を 示 す),お よ び 合 成13-COOH-7KCに 対 す る β2-GPIお よ び 抗 β2-GPI自 己 抗 体(WB-CAL-1)のELISAに お け る 反 応 性 を 示 し た.対 照 で あ り,β2-GPIリ ガ 図2  β2-GPIリ ガ ン ドの 逆 相 カ ラ ム に よ るHPLC. パ ネ ルA:合 成oxLig-1,パ ネ ルB:精 製oxLig-2, パ ネ ルC:合 成13-COOH-7KCのC18カ ラ ム に よ る HPLCク ロ マ ト グ ラ ム. 溶 媒C(ア セ ト ニ ト リ ル/イ ソ プ ロ パ ノ ー ル,3/7) と 溶 媒D(0.2%酢 酸)の 濃 度 勾 配 移 動 相(50%溶 媒-50%溶 媒D(0分)∼100%溶 媒C(15分-40分),流 速0.5m1/minで 溶 出 し た.234nmの 吸 光 度 を モ ニ タ ー し た. 図3  精 製 β2-GPIリ ガ ン ド のTLCと リ ガ ン ド ブ ロ ッ ト. パ ネ ルA:ヨ ウ 素 染 色,パ ネ ルB:リ ガ ン ドブ ロ ッ ト. 表2  β2-GPIリ ガ ン ドの 質 量 分 析 (M+H)+:プ ロ ト ン 化 分 子 イ オ ン,(M-H)-:脱 プ ロ トン 化 分 子 イ オ ン, LC/MS(APCI)に よ る. 表3  リガ ン ドへ の β2-GPIお よ び 抗 β2-GPI自 己 抗 体 へ の 結 合 β2-GPIリ ガ ン ド を 固 相 化 し たELISAプ レ ー トで,β2-GPIと,Cof-22抗 体 あ る い はWB-CAL-1抗 体 を イ ン キ ュ ベ ー ト し た .数 字 は 結 合 を490nmの 吸 光 度(平 均+/-SD, n=3)を 示 す. Chol-linoleate:コ レ ス テ リ ル リ ノ レ ー ト.

ン ドに な り得 る被 酸 化 物 質 で あ る コ レ ス テ リル リ ノ

レー トに 対 し て は,β2-GPIお

よ びWB-CAL-1

抗 体 の 反 応 が 全 く見 ら れ な か っ た の に 対 し,3種

類

の リガ ン ド(oxLig-1,

oxLig.2,お

よ び13-COOH

7KC)の

全 て に 対 し て 強 い 結 合 が 見 ら れ た.

4)  リ ボ ソ ー ム の マ ク ロ フ ァー ジへ の 結 合

PS, oxLig-1,

oxLig-2,あ

る い

は13-COOH-7KC含

有 リボ ソー ム を調 製 し,マ

ウ ス マ ク ロ フ ァ

ジ 系 の 細 胞 で あ るJ774A.1と

共 に,4℃,2時

間 イ ン キ ュ ベ ー トし て,結 合 を 調 べ た.PS含

有 リポ

ソー ム で は,PS含

量 に 依 存 し た リ ボ ソー ム の マ ク ロ

フ ァ ー ジ へ の 結 合 が 見 ら れ た(表4).oxLig-1,

oxLig-2あ

る い は13-COOH-7Kc含

有 リ ボ ソー ム

で も 同 様 の 傾 向 は 認 め られ る もの の,PS含

有 リボ ソ

ム ほ ど顕 著 で は な か っ た.次

に,同

様 の 実 験 を,

抗 β2-GPI自

己 抗 体(す

な わ ち,WB-CAL-1)

共 存 下 で 行 っ た(表5).β2-GPIとWB-CAL-1

抗 体 の 共 存 下 で は,コ

レ ス テ リル リ ノ レ ー ト含 有 リ

ポ ソ ー ム の 結 合 に 比 し て,oxLig-1で

最 も高 い 結 合

促 進(50倍

以 上)が

見 ら れ,oxLig-2あ

る い

は13-COOHで

も10倍 以 上 の 増 加 が 見 ら れ た.こ れ らの 結

合 は,ス

カベ ン ジ ャ ー 受 容 体 を介 す る 結 合 量(表4)

と比 べ て 有 意 に 大 き か っ た.さ

ら に,デ

ー タ は 示 し

て い な い が,カ

ル ボ キ シ ル 基 を メ チ ル 化 し たoxLig

2あ る い は13-COOH-7KC含

有 リボ ソー ム で は,

β2-GPIとWB-CAL-1抗

体 の 共 存 下 で も結 合 の

増 加 は 全 く見 ら れ な か っ た.

考

察

酸 化 変 性 を 受 け た 血 漿LDLは,動

脈 硬 化 発 症 の

初 期 段 階 に 深 く関 与 す る病 因 因 子 で あ る26).Brown

お よ びGoldsteinは42),マ

ク ロ フ ァ ー ジ が 変 性LDL

を取 り込 む 機 序 と して ス カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 の 存 在

を提 唱 し,そ の 後,Steinbergら

は43),生 体 内 に 存 在

す る主 な 変 性LDLが

酸 化LDLで

あ る こ と を 示 し

た.ス

カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 は,down-regulationを

表4  β2-GPIリ ガ ン ド含 有 リボ ソー ム の マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 結 合

無 血 清 培 地Celgrosser-Pで2時 間 培 養 し たJ774A.1細 胞 に,リ ガ ン ドを上 記 の 濃 度(mol %)含 有 した リ ボ ソー ム を加 え,4℃ で2時 間 イ ン キ ュ ベ ー トし,細 胞 に 結 合 し た放 射 能 と

タ ンパ ク質 量 を 測 定 し た(pmol3H-DPPC/mgタ ン パ ク質,平 均+/-SD, n=3).

表5  β2-GPIリ ガ ン ド含 有 り ポ ソー ム の マ ク ロ フ ァー ジへ の β2-GPIお よ び 抗 β2-GPI抗 体 依 存 的 な 結 合

無 血 清 培 地Celgrosser-Pで2時 間 培 養 し たJ774A.1細 胞 に,β2-GPIお よ びWB-CAL-1存 在 下 で,30mol%リ ガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム を 加 え,4℃ で2時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し,細 胞 に 結 合 し た 放 射 能 と細 胞 の タ ン パ ク質 量 を 測 定 し た(pmol3H-DPPC/ mgタ ン パ ク 質,平 均+/-SD, n=3).

受 け な い た め 際 限 な く変 性LDLを

取 込 み 細 胞 内 に

コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ル を 蓄 積 し泡 沫 化 す る.ス

カ

ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 フ ァ ミ リー と して,タ

イ プA受

容

体(SR-A)44)お

よ びCD3645)な

どの タ イ プB受

容 体,

ま た,内

皮 細 胞 に 発 現 す る 酸 化LDLの

受 容 体 と し

てLOX-146)お

よ びFcγ47)受 容 体 の 存 在 が 明 ら か に

な っ て い る.こ

れ らの ス カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 フ ァ ミ

リー が 関 わ り合 っ て 酸 化LDLが

取 り込 ま れ る と考

え ら れ る.

方,in

vitroで

の 変 性LDLモ

デ ル と し て,2

価 の 金 属(銅 イ オ ン,Cu2+,あ

る い は 鉄 イ オ ン,Fe2+)

に よ る 酸 化LDLお

よ び 種 々 の 変 性LDL(マ

ロ ン ジ

ア ル デ ヒ ド(MDA)修

飾LDL,ア

セ チ ル 化LDL,

糖 化LDL,な

ど)が

用 い られ て い る が, in vivoで

のLDLの

酸 化 機 序 に つ い て は い ま だ 不 明 な 点 が 多

い27,48-54).動

脈 硬 化 の 発 症 と泡 沫 細 胞 の 形 成 機 序 に 関

す る研 究 で,Cu2+に

よ る 酸 化LDLが

ヒ トの 動 脈 硬

化 巣 か ら精 製 し た 酸 化LDLと

類 似 の 物 理 化 学 的 お

よ び 免 疫 化 学 的 性 質 を 有 す る こ とが 示 さ れ て い る28).

LDL粒

子 中 で,こ

の 様 な 酸 化 を受 け る物 質 は,二

重 結 合 を2個

以 上 も つ 不 飽 和 脂 肪 酸 で あ る.ヒ

ト

LDL中

に 含 ま れ る不 飽 和 脂 肪 酸 は 主 に リ ノー ル 酸 で

あ り,コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ル と して 存 在 し て い る.

Cu2+に

よ る 酸 化LDL中

に は, cholesteryl hydroper

oxyoctadecadienoate

(Chol-HPODE)お

よ び

cholesteryl

hydroxyoctadecadienoate

(Chol-HODE)が

酸 化 体 と し て 検 出 さ れ る が55),こ のChol

HPODEは,血

小 板 か ら の 成 長 因 子 を 不 活 性 化 す る

こ とが 報 告 さ れ て い る56).ま た,ス テ ロ ー ル 環 に 関 し

て は,7-hydroxycholesterolがLDL酸

化 の 初 期

に 現 れ る主 な オ キ シ ス テ ロー ル(oxysterol)で

あ り,

7KCは

酸 化 反 応 の 後 期 に 検 出 さ れ る57).ま た,側 鎖

脂 肪 酸 に 関 し て は,9,

10位 あ る い は12, 13位 の エ

ポ キ シ体,あ

る い は こ れ らの 位 置 に,ヒ

ドロ キ シ ル

体,ケ

トン や ア ル デ ヒ ドな どの カ ル ボ ニ ル 基 が 導 入

され た誘 導 体 が 存 在 す るこ とが 報 告 され て い る55,

58-60).

筆 者 ら に よ る一 連 の 検 討 で,β2-GPIリ

ガ ン ドに

関 し て 以 下 の 点 が 明 らか に な っ た.1)酸

化LDL脂

質 画 分 よ り精 製 し た β2-GPI

特 異 的 な リガ ン ド

(oxLig-1お よ びoxLig-2)は,い ず れ も コ レ ス テ リ ル リ ノ レ ー トの 酸 化 分 解 物 で,ス テ ロ ー ル 環 が 7KCで,エ ス テ ル 化 さ れ た 脂 肪 酸 の 末 端(ω 位)に カ ル ボ キ シ ル 基 を 持 つ 化 合 物 と 推 定 さ れ た.2) oxLig-2に つ い て は,正 イ オ ン モ ー ドで,プ ロ ト ン 化 分 子 イ オ ン(M+H)+と し てm/z627,お よ び フ ラ グ メ ン ト イ オ ンm/z383を,ま た,負 イ オ ン モ ー ドで は 脱 プ ロ ト ン 化 フ ラ グ メ ン ト イ オ ン(m/z243), お よ びm/z625お よ び627が 検 出 さ れ て い る.m/z383 は,7KCの プ ロ ト ン 化 分 子 イ オ ン と 同 じ 質 量 数 で, oxLig-1に も 見 ら れ る.ま た 陰 イ オ ン モ ー ド で 脱 プ ロ ト ン 化 フ ラ グ メ ン トイ オ ン と 考 え ら れ るm/z243 の ピ ー ク が 観 察 さ れ る.従 っ て,oxLig-2は 分 子 量 626の7KCの 脂 肪 酸 エ ス テ ル で あ る と 考 え ら れ る. さ ら に,陰 イ オ ン モ ー ドで,m/z625の 脱 プ ロ ト ン 化 分 子 イ オ ン お よ びoxLig-2の ジ ヒ ド ロ 体 の ピ ー ク (m/z627)が 検 出 さ れ て お り,こ れ ま で のCu2+に よ る 酸 化LDLに 関 す る 報 告 を 勘 案 す る と,oxLig-2の 側 鎖 部 分 は12位 の 炭 素 が カ ル ボ キ シ ル 化,9位 に ケ ト ン 基 が 存 在 す る 脂 肪 酸 で あ る4, 12-dioxo-12 (7-ketocholest-5-en-3β-yloxy) dodecanoic acidと 考 え ら れ る. 本 研 究 で は,精 製oxLig-2の 他 に, oxLig-1

(9-(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-9-oxononanoic acid)お よ び13-COOH-7KC (13-

(7-ketocholest-5-en-3β-yloxy)-13-oxotridecanoic acid)を 化 学 合 成 し,β2-GPIお よ び β2-GPI依 存 的 な 抗 β2-GPI抗 体(aCL)の 反 応 性,お よ び こ れ ら が 関 与 す る マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 酸 化LDLの _{取 り 込 み に つ い て 検 討 し た .こ れ ら} 3種 類 の β2-GPIリ ガ ン ド の い ず れ に も,ω 位(脂 肪 酸 末 端)に カ ル ボ キ シ ル 基 が 存 在 す る.さ ら に, デ ー タ は 示 し て い な い が,こ れ ら の 遊 離 カ ル ボ キ シ ル 基 を メ チ ル 化 す る こ と で β2-GPIお よ び β2-GPI 依 存 的 な 抗 β2-GPI 抗 体 の リ ガ ン ドへ の 結 合 性 (ELISAお よ び リ ガ ン ド ブ ロ ッ ト)お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 結 合･取 り 込 み が 完 全 に 消 失 し た.以 上 の こ と よ り,コ レ ス テ リ ル リ ノ レ ー トの 酸 化 反 応 に よ り付 加 さ れ る ω 位(脂 肪 酸 末 端)の カ ル ボ キ シ ル

基 が β2-GPIの

結 合 に 必 須 で あ る こ とが 考 え ら れ

る.

今 回,Cu2+に

よ る 酸 化LDLの

脂 質 画 分 よ り精 製

し たoxLig-1(あ

る い は 合 成oxLig-1),精

製

oxLig-2,お

よ び 合 成13-COOH-7KCを

含 有 す る

リ ボ ソ ー ム の マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 結 合 は,対 照 のPS

含 有 リ ボ ソ ー ム の 結 合 に 比 べ,著

明 で は な か っ た.

PSが

マ ク ロ フ ァー ジ の ス カベ ン ジ ャ ー 受 容 体 に 認 識

さ れ る た め,酸

化LDLの

モ デ ル と し てPSリ

ポ ソ

ム が し ば し ば 用 い ら れ る.し

か し な が ら,こ

れ ら

β2-GPIリ

ガ ン ドは,ス

カベ ン ジ ャー 受 容 体 の リガ

ン ド と の 結 合 は そ れ 程 度 強 くな い.一

方,β2-GPI

お よ び 抗 β2-GPI自

己 抗 体 の 共 存 下 で は β2-GPI

リガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム の 顕 著 な マ ク ロ フ ァ ー ジ へ

の 結 合･取

り込 み の 増 加 が 観 察 さ れ た.こ

の 取 り込

み は,ス

カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 で は な く,Fcγ

受 容 体

を介 す る も の と考 え ら れ る(図4)61-64).

と こ ろ で,ご

く最 近 の 我 々 の 検 討 で,SLEを

合 併

す る2次

性APS患

者 に お け る 動 脈 血 栓 症 の 既 往 例

と,oxLig-1・

β2-GPI複

合 体 に 対 す る 自 己 抗 体 の

陽 性 例 との 問 に 高 い 関 連 性 が 示 さ れ た(投 稿 中).さ

ら に,同

疾 患 に お い て,血

中 酸 化LDLの

高 値 例 と

動 脈 血 栓 症 の 既 往 例 の 間 に 有 意 な 相 関 も 認 め ら れ て

い る.Georgeら

は,LDLレ

セ プ タ ー 欠 損 マ ウ ス を

β2-GPIで

免 疫 す る と動 脈 壁 の 脂 肪 斑 形 成 が 促 進 さ

れ る こ とや,ヒ

ト動 脈 硬 化 病 巣 で β2-GPIが

存 在

す る こ と65)を報 告 して い る.こ れ ら の 結 果 は,マ ク ロ

フ ァ ー ジ を 用 い るin vitroの 実 験 で 示 さ れ た 抗 β2

-GPI抗

体 の動 脈 硬 化 発 症 へ の 関 与 の 可 能 性 を支 持 す

る もの で あ る.

こ の よ うに,我

々 の 一 連 の 研 究 で,APSに

お け る

動 脈 血 栓(動

脈 硬 化)発

症 に,酸

化LDL・

β2-GPI

複 合 体 に 対 す る 抗 β2-GPI抗

体 の 免 疫 応 答 が 関 与

し て い る こ と を 示 す 新 た な 知 見 が 得 られ た こ と に な

る.さ

ら に こ れ ら の 事 実 よ り,APSの

診 断 に は,抗

β2-GPI自

己 抗 体 の 測 定 に 加 え て,血

中 酸 化LDL

の 測 定 が 必 須 で あ る こ と も明 らか と な っ た.

図4  β2-GPIお よ び抗 β2-GPI自 己 抗 体 の 関 与 す る酸 化 LDLの マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 取 り込 み.泡 沫 化 の 機 序.

結

論

1)  抗 リ ン 脂 質 抗 体 症 候 群 に お い て 自 己 抗 体 の 関 与

す る 動 脈 硬 化 発 症 機 序 を 解 明 す る 目的 で,Cu2+で

酸 化 し た 酸 化LDLの

脂 質 画 分 よ り β2-グ

リ コプ

ロ テ イ ンI

(β2-GPI)に

対 す る リ ガ ン ドを 精 製

し構 造 を解 析 し た.

2)  β2-GPIに

特 異 的 な リガ ン ドは,コ

レ ス テ リル

リ ノ レ ー トの 酸 化 体 で,ス テ ロ ー ル 環 が7-ケ

トコ

レ ス テ ロ ー ル(7KC,オ

キ シ ス テ ロ ー ル の1つ)

で あ り,エ ス テ ル 結 合 し た 側 鎖 脂 肪 酸 が ω-カ ル ボ

キ シ ル 体 で あ っ た.

3)  β2-GPIと

の 結 合,お

よ び,こ

の 結 合 を 介 す る

抗 β2-GPI抗

体 依 存 的 な マ ク ロ フ ァ ー ジ へ の 結

合･取

り込 み が,β2-GPIリ

ガ ン ドの 側 鎖 脂 肪 酸

の 遊 離 カ ル ボ ン 酸 を メ チ ル 化 す る こ と で 消 失 す る

こ と は,こ

れ ら β2-GPIリ

ガ ン ドの 生 理 活 性(結

合 活 性)中 心 が ω 位-カ

ル ボ キ シ ル 基 で あ る こ と

を示 し て い る.

4)  β2-GPIリ

ガ ン ド含 有 リ ボ ソ ー ム の マ ウ ス マ ク

ロ フ ァ ー ジへ の 結 合 は,β2-GPIお

よ び 抗

β2-GPI抗

体 に 依 存 的 で あ る こ と,お

よ び,動

脈 血 栓

の 既 往 の あ る抗 リン 脂 質 抗 体 症 候 群(APS)患

者

で,高 率 に 血 中 酸 化LDL高

値 例 お よ び β2-GPI.

リ ガ ン ド複 合 体 に 対 す る 自 己 抗 体 陽 性 例 が 存 在 す

る こ と よ り,APSに

お い て,動 脈 血 栓(動 脈 硬 化)

形 成 に,酸 化LDL,β2-GPI,お

よ び 抗 β2-GPI

抗 体 が 関 与 す る機 序 が 存 在 す る 可 能 性 が 示 め さ れ

た.

文

献

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A mechanism of development of arterial thrombosis: ƒÀ 2-glycoprotein I-specific ligand and autoantibody

Qingping Liu Department of Cell Chemistry,

Okayama University Graduate School of Medicine and Dentistry, Okayama 700-8558, Japan

(Director: Prof. T. Yasuda)

ƒÀ 2-Glycoprotein I (ƒÀ2-GPI) is a major antigen for anticardiolipin antibodies (aCL) appeared in patients with antiphospholipid syndrome (APS). We recently reported that ƒÀ2-GPI specifically binds to oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) and that on of the ƒÀ2-GPI's major ligands derived from oxLDL, oxLig-1, is 9-(7-ketocholest-5-en-3ƒÀ-yloxy)-9-oxononanoic acid (J. Lipid Res. 42, 697, 2001). In the present study, it was demonstrated that carboxylated variants of cholesteryl linoleate have a critical role for ƒÀ2-GPI binding. In vitro experiments indicate that oxLDL was uptaken by macrophages via an interaction among the ligand such as oxLig-1, ƒÀ2-GPI, and anti-p2-GPI autoantibodies. The uptake was not occurred by cholesterol or its ester without a free carboxyl residue, i.e., cholesteryl lenoleate, by cholesterol, or by 7

-ketocholesterol alone, even in the presence of ƒÀ2-GPI and anti-ƒÀ2-GPI antibodies. Thus, carboxyl variants of cholesteryl ester specific for ƒÀ2-GPI may mediate anti-ƒÀ2-GPI Ab-dependent uptake of oxLDL by macrophages and autoimmune atherogenesis developed in APS.