間質 性 肺 疾 患 にお け る抗HTLV-I抗
体 に関 す る研 究
第1編
DPB,IIPに お け る 抗HTLV-I抗 体 並 び にHTLV-I関 連 反 応 の
Western blot法 に よ る 検 討
岡 山 大 学 医 学 部 第 二 内 科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎 教 授)
植 野 克 巳
(平成4年11月20日 受 稿)
Key words:び ま ん 性 汎 細 気 管 支 炎,特 発 性 間 質 性 肺 炎,抗HTLV-I抗 体, HTLV-I関 連 反 応, Western blot法
緒 言
び ま ん 性 汎 細 気 管 支 炎diffuse panbron chiolitis (DPB)1)及 び 特 発 性 間 質 性 肺 炎 idiopathic interstitial pneumonia (IIP)は, 難 治 性 で 慢 性 進 行 性 の 経 過 を と る 原 因 不 明 の 間 質 性 肺 疾 患 で あ る.木 村2)3)4)5)ら は こ れ ら 疾 患 の 病 因 と し て の ウ イ ル ス 感 染 関 与 を 検 索 し,DPB の 経 過 中 に 成 人T細 胞 白 血 病adult T cell leu kemia (ATL)6)の 併 存 す る 症 例 を 見 出 し た こ と か ら,成 人T細 胞 白 血 病 ウ イ ル ス Ⅰ型human T lymphotropic virus type I (HTLV-I)感 染
に 着 目 し た.そ の 後 木 村7)8)9)は,HTLV-I感 染 がDPB,IIPの 病 因 の1つ で あ る 可 能 性 を 示 し, HTLV-I感 染 を 背 景 と し て 発 症 した と 考 え ら れ
る こ れ ら の 呼 吸 器 疾 患 群 に 対 し て,HTLV-I関 連 細 気 管 支 ・肺 胞 異 常 症HTLV-I associated bronchiolo-alveolar disorder (HABA)の 概 念
を 提 唱 し た. 木 村2)3)4)5)ら は,Hinuma10)ら の 方 法 に 準 じ た 間 接 蛍 光 抗 体 法indirect immunofluorescent assay(IF法)に よ りDPB,IIP症 例 の 抗HTLV I抗 体 を 検 索 し た.こ の 時ATL細 胞 株 で あ る MT-1細 胞11)と 共 に,ス ク リー ニ ン グ と し て HTLV-Iを 多 数 産 生 し て い るMT-2細 胞12)も 用 い た 所,抗HTLV-I抗 体 の 他 に60∼80%の MT-1細 胞 あ る い はMT-2細 胞 が び ま ん 性 に 蛍 光 を呈 す るHTLV-I関 連 反 応 を認 め た.こ れ ま で の 他 疾 患 を含 め た 検 討2)3)4)5)から,HTLV I関 連 反 応 はDPB及 びIIPに 特 異 的 な 反 応 と考 え られ て い る. そ こ で今 回,MT-2細 胞 可 溶 化 蛋 白 を 用 い て Western blot法13)に よ りIF法 で の 抗HTLV
I抗 体 とHTLV-I関 連 反 応 の各 陽 性 血 清 につ い て,MT-2細 胞 に 含 まれ るHTLV-I構 成 蛋 白 との 反 応 性 を検 索 し,DPB及 びIIPに お け る抗HTLV-I抗 体 並 び に 関 連 反 応 の 意 義 に つ い て検 討 し た. 対 象 岡 山 大 学 第2内 科 の 外 来 及 び 入 院 患 者 の う ち 厚 生 省 研 究 班 のDPB診 断 の 手 引 き14)及 びIIP 診 断 基 準15)に 合 致 したDPB 19例, IIP 15例 を 対 象 と した.IF法 に よ る検 討 で はDPB 19例 中 抗HTLV-I抗 体 陽 性6例,HTLV-I関 連 反 応 陽 性9例,抗 体,関 連 反 応 と も陰 性4例 で あ っ た(表1).ま たIIP 15例 中抗HTLV-I抗 体 陽 性1例,HTLV-I関 連 反 応 陽 性8例,抗 体,関 連 反 応 と も 陰 性6例 で あ っ た(表2).疾 患 対 照 と して 抗HTLV-I抗 体 陽 性ATL患 者 7例,健 康 人 対 照12例(年 齢24-36歳,中 央 値 29歳)に つ い て も検 討 し た.健 康 人対 照 は,い ず れ もHTLV-I抗 体,関 連 反 応 は 共 に 陰 性 で あ つ た. 119
表1 DPB症 例 のIF法 に よ る抗HTLV-I抗 体, HTLV-I関 連 反 応 とWestern blot法 に よ
る 抗HTLV-I抗 体 と の 比 較 方 法 1. Western blot法 に 用 い る 抗 原 の 作 成 HTLV-I産 生 細 胞 株MT-212)を,10%ウ シ 胎 児 血 清 を 含 む 培 養 液RPMI-1640を 用 い て, 5 % CO2, 37℃ で 培 養 維 持 し た.こ れ を100×gに て5分 間 遠 心 して 細 胞 を 集 め, phosphate buffer ed saline (PBS) pH 7.2で3回 洗 浄 し た 後, Yamamoto16)ら の 方 法 に 準 じ, 0.5% Nonidet P40を 含 むlow-salt extraction buffer (0.14M NaCl; 3mM MgCl2; 1mM dithiothreitol; 2mM phenylmethylsulfonyl fluoride; 10mM Tris-HCl pH 8.0)で5×107cell/mlに 調 整 し, 1分 間 のvortex mixingで 細 胞 膜 を 破 砕 し た 後, 4℃ で20分 間incubateし,12,000×gに て2分 間 遠 心 し上 清 を 採 取 し た.こ れ に1/3量 のsam ple buffer (1M sucrose; 8% sodium dodecyl
sulfate; 0.25M Tris-HCl pH 6.8; 0.01% bromophenol blue), 1/20量 の2-mercaptoeth
anolを 加 え,100℃3分 間 煮 沸 し,使 用 時 ま で -80℃ で 保 存 し た.
表2 IIP症 例 のIF法 に よ る抗HTLV-I抗 体, HTLV-I関 連 反 応 とWestern blot法 に よ
る 抗HTLV-I抗 体 との 比 較
2. Western blot法
上 記 の ご と く作 成 し たMT-2細 胞 可 溶 化 蛋 白 溶 液 を,Laemmli17)の 方 法 に 準 じ,3%濃 縮 ゲ ル を 重 層 し た12.5%ゲ ル に てsodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS PAGE)で 分 子 量 差 に よ り 展 開 し た.ま た 同 時 に,分 子 量 マ ー カ ー と し て ウ サ ギ 筋phos pholylase(分 子 量94,000),ウ シ 血 清albumin (分 子 量67,000),卵 白ovalbumin(分 子 量 43,000),ウ シ 赤 血 球carbonic anhydrase(分 子 量30,000),大 豆trypsin inhibitor(分 子 量 20,100),ウ シ 乳 α-lactalbumin(分 子 量14,400)
(Farmacia社, low mollecular weight cali bration kit)も 泳 動 し た.次 い で ゲ ル 内 に 展 開
し た 蛋 白 を,バ ッ フ ァ ー タ ン ク 型 転 写 装 置(東 洋 科 学 産 業 社,ETB-15)を 用 い,Towbin13)ら
の 方 法 で64V (13V/cm)4時 間 の 電 気 泳 動 で ニ ト ロ セ ル ロ-ス 膜(ADVANTEC東 洋 社, pore size 0.2μm)に 転 写 し た.転 写 後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 は,蒸 留 水 で 洗 浄 後,分 子 量 マ ー カ ー をAmido-Black 10Bで 染 色 し,次 い で3%ウ シ 血 清albuminで37℃,12時 間incubateし て 非 特 異 反 応 をblockし,PBSに て 洗 浄 後,PBS で25倍 に 希 釈 し た 被 検 血 清 を37℃,3時 間 反 応 さ せ,Vectastain ABC抗 ヒ トIgG kit (Vector 社)を 用 い てavidin biotin peroxidase complex 法 に て,MT-2細 胞 蛋 白 抗 原 に 反 応 し た 被 検 血 清 中 の ヒ トIgG抗 体 を 検 出 し た.
3. 抗HTLV-I抗 体 の 特 異 性 の 判 定 HTLV-Iのcore proteinと し てp15, p19, p24,そ のprecursorと し てpr53, envelope proteinと し てp20E, gp46,ま た そ のprecursor
と し てgp6218), gag-pX fusedproteinで あ る p2819), envelope-pX proteinで あ るgp6820)の う ち い ず れ か のbandを 認 め る も の を,HTLV I特 異 蛋 白 抗 原 に 対 す る 抗 体(抗HTLV-I抗 体)陽 性 と し た. 結 果 IF法 に よ り抗HTLV-I抗 体 陽 性 と判 定 さ れ たATL 7例 す べ て で,HTLV-I特 異 蛋 白 で あ るp19, p24, p28, pr53のbandが 検 出 さ れ, う ち6例 で,同 時 にgp46, gp68の い ず れ か 又 は 両 方 のbandも 検 出 され た.一 方,陰 性 対 照 と し た健 康 人12例 で は,こ れ らに 対 す る 抗 体 は検 出 さ れ ず,そ の 他 のbandも 認 め られ な か っ た. DPBで は,IF法 で の 抗HTLV-I抗 体 陽 性 の6例 す べ て で, p19, p24, p28, pr53, gp68の bandが 検 出 さ れ,う ち4例 で は,gp46のband
も検 出 され,Western blot法 で も抗HTLV-I 抗 体 陽 性 と判 定 され た.し か し な が ら,IF法 に お け るHTLV-I関 連 反 応 陽 性9例 に お い て は, 抗 体 及 び 関 連 反 応 陰 性 の4例 と共 に,Western blot法 で はHTLV-I特 異 蛋 白 を 含 む い ず れ の
bandも 検 出 さ れ なか っ た(図1,表1).
IIPで は,IF法 に よ り 抗HTLV-I抗 体 陽 性 で あ っ た1例 で は, p19, p24, p28, pr53, gp68 の 各bandが 検 出 さ れ, Western blot法 で も 抗 HTLV-I抗 体 陽 性 と 判 定 さ れ た.し か し な が ら, IF法 に お け るHTLV-I関 連 反 応 陽 性8例,抗 体 及 び 関 連 反 応 陰 性6例 の 計14例 全 例 で, West ern blot法 に お い てHTLV-I特 異 蛋 白 を 含 む い ず れ のbandも 検 出 さ れ な か っ た(図2,表
2).
図1 Western blot法 に よ るDPB患 者 血 清IgG抗 体 とMT-2細 胞 可 溶 化 蛋 白 抗 原 との 反 応 A:ATL患 者,N:健 康 人 対 照,1-6:IF法 で 抗HTLV-I抗 体 陽 性 のDPB, 7-15: HTLV-I 関 連 反 応 陽 性 のDPB, 16-19:抗HTLV-I抗 体 並 び にHTLV-I関 連 反 応 陰 性 のDPB.
1-6の みATL患 者 と 同 様,HTLV-I特 異 蛋 白 に 対 す るbandを 認 め る.健 康 人 対 照 及 び7-19で は,bandを 認 め な い.
図2 Western blot法 に よ るIIP患 者 血 清IgG抗 体 とMT-2細 胞 可 溶 化 蛋 白抗 原 と の 反 応
A:ATL患 者,N:健 康 人 対 照,1:IF法 で 抗HTLV-I抗 体 陽 性 のIIP, 2-9: HTLV-I関 連 反 応 陽 性 のIIP, 10-15:抗HTLV-I抗 体 並 び にHTLV-I関 連 反 応 陰 性 のIIP.
1の みATL患 者 と 同 様,HTLV-I特 異 蛋 白 に 対 す るbandを 認 め る.健 康 人 対 照 及 び2-15で は, bandを 認 め な い. 考 察 抗HTLV-I抗 体 は,そ の 陽 性 者 がHTLV-I持 続 感 染 者 で あ る こ とが 証 明 さ れ て い る21)22). 方,HTLV-I関 連 反 応 は,DPBとIIPに 特 異 的 な 反 応2)3)4)5)とさ れ て い る も の の,そ の 本 態 は 現 在 の と こ ろ 不 明 で あ る. IF法 に よ る抗HTLV-I抗 体 の 検 索 に おい て, 抗 体 陽 性 血 清 は,1∼5%のMT-1細 胞 が 顆 粒 状 に 蛍 光 を 呈 し,か つ60∼80%のMT-2細 胞 が び ま ん 性 に 蛍 光 を 呈 す る.一 方,HTLV-I関 連 反 応 陽 性 血 清 は,60∼80%のMT-1細 胞 あ るい はMT-2細 胞 が び まん 性 に 蛍 光 を呈 す る2)3)4)5). 即 ち こ の 両 反 応 は,MT-1細 胞 に つ い て は 明 ら か に 異 な る 反 応 で あ る が,MT-2細 胞 に つ い て は 類 似 の 反 応 を 呈 す る.吸 収 試 験 で は,HTLV I関 連 反 応 は,HTLV-Iを 産 生 し て い る ヒ ト T細 胞 株 で あ るMT-1細 胞,MT-2細 胞 の ど ち らで も吸 収 さ れ る が,HTLV-I非 感 染 ヒ トT 細 胞 株 で あ るMolt-423)細 胞 で は 吸 収 さ れ な い7)8).従 っ て,こ の 関 連 反 応 はHTLV-Iに 関 連 した 何 ら か の 反 応 あ る い は,HTLV-I構 成 蛋 白以 外 のHTLV-I感 染 に 伴 っ て 産 生 され た 蛋 白 部 分 に 対 す る 反 応 を検 出 し て い る可 能 性 が あ る.
方, Western blot法 はTowbin13)ら に よ っ て 考 え ら れ た 方 法 で,ゲ ル 中 の 蛋 白 を電 気 泳 動 に よ りニ トロ セ ル ロー ス 膜 に 転 写 し,抗 原 抗 体 反 応 を 可 能 に す る もの で あ る.SDS PAGEに よ り蛋 白 抗 原 を分 子 量 差 で 展 開 した 後 にWest ern blot法 を 行 え ば,抗 原 抗 体 反 応 を 抗 原 分 子 量 に よ り同 定 す る こ とが で き る. そ こ で今 回,MT-2細 胞 可 溶 化 蛋 白 のSDS PAGEを 行 い,Western blot法 を 用 い て,IF
法 に よ るDPBとIIPに お け る抗HTLV-I抗 体 とHTLV-I関 連 反 応 の 各 陽 性 血 清 を比 較 検 討 し,MT-2細 胞 の 持 つ 分 子 量 既 知 のHTLV I構 成 蛋 白 に 対 す る 抗 体 を検 討 す る と 共 に, HTLV-I関 連 反 応 に 対 応 す る抗 原 の 性 状 につい て の 解 析 を 試 み この 反 応 の 本 態 を追 求 し た. DPB, IIPでIF法 に よ り抗HTLV-I抗 体 陽 性 と さ れ て い た7例 は,全 例Western blot法 でHTLV-I特 異 蛋 白 に 対 す るIgG抗 体 が 陽 性 で あ っ た.一 方,HTLV-I関 連 反 応 陽 性 の17例 は,全 例HTLV-I特 異 蛋 白 に対 す るIgG抗 体 は 陰 性 で あ り,か つ そ れ 以 外 のbandに つ い て も検 出 さ れ な か っ た.従 っ て,Western blot法 で は,HTLV-I関 連 反 応 がHTLV-I構 成 蛋 白 に 対 す る反 応 で は な い こ とは 示 さ れ た が,そ の 本 態 は 依 然 不 明 で あ る.
HTLV-I関 連 反 応 は,吸 収 試 験 か ら は HTLV-I感 染 細 胞 に 共 通 し た反 応 と考 え られ る の で,こ れ らの 細 胞 が 共 通 し て 持 つ 何 らか の 抗 原 性 物 質 に 対 す る抗HTLV-I抗 体 陰 性 血 清 の 反 応 で あ る可 能 性 は 考 え られ る.IF法 で 蛍 光 を 呈 し な が らWestern blot法 で 抗 原 抗 体 反 応 を 検 出 で き な か っ た 原 因 と して,次 の よ う な 可 能 性 が 考 え られ た.① 抗 原 の 作 成 に あ た り,細 胞 成 分 の 可 溶 化 が 十 分 で な か っ た.② 加 熱,ま た は2-mercaptoethanolに よ る還 元 の た め,抗 原 性 が 変 化 した.③ 転 写 に あ た り,抗 原分 子 量 が 不 明 の た め,適 切 な 転 写 時 間 が 設 定 で き な か っ た. 抗HTLV-I抗 体 陰 性 のHTLV-I持 続 感 染 者 の 存 在 がSarin24)ら,Nakano25)ら に よ っ て 示 さ れ て い る.ま た,輸 血 歴 も麻 薬 常 習 歴 も な い38歳 の 女 性ATL患 者 で,抗HTLV-I抗 体 の 陽 性 転 化 が 報 告 さ れ て い る26).さ ら に,HTLV Iの 主 な 感 染 経 路 が 母 子 感 染27),特 に 母 乳 感 染28)と さ れ て い る に も か か わ ら ず,抗HTLV I抗 体 保 有 率 は 年 齢 と共 に 増 加 し,中 年 以 後 に 最 も 高 い29)こ と も知 ら れ て い る.こ れ ら の こ と か ら,HTLV-I感 染 者 は,年 齢 と と も に 抗 HTLV-I抗 体 が 陽 性 と な り,こ の 移 行 が 中 年 期 以 後 に 起 こ る 者 も少 な く な い と推 察 さ れ る.従 っ て,HTLV-I関 連 反 応 が この よ うな抗HTLV I抗 体 陰 性 期 のHTLV-I持 続 感 染 者 血 清 の HTLV-I感 染 細 胞 に 対 す る反 応 で あ る可 能 性 も あ り,HTLV-I感 染 とDPB,IIP発 症 との 関 連 に つ き,さ ら に 研 究 を 続 け る 必 要 が あ る と思 わ れ た. 結 語 DPB,IIPで 高 率 に 認 め ら れ る抗HTLV-I 抗 体 及 びHTLV-I関 連 反 応 の 本 態 を 調 べ る 目 的 で,Western blot法 を用 い,MT-2細 胞 可 溶 化 蛋 白 を抗 原 と し て,IF法 に よ る 抗HTLV I抗 体 陽 性 血 清 及 びHTLV-I関 連 反 応 陽 性 血 清 中 のIgG抗 体 の 反 応 性 を調 べ た. IF法 に よ る抗HTLV-I抗 体 陽 性 血 清 は す べ て,Western blot法 に よ っ てHTLV-I特 異 蛋 白 に 対 す るIgG抗 体 が 陽 性 で あ っ た.一 方, HTLV-I関 連 反 応 陽 性 血 清 は す べ
てHTLV-I特 異 蛋 白 に 対 す るIgG抗 体 は 陰 性 で,ま た そ の 他 のbandも 検 出 さ れ な か っ た.従 っ て, Western blot法 に よ りHTLV-I関 連 反 応 の 本 態 を つ き とめ る こ と は で き な か っ た. 稿 を終 え るに あ た り,終 始 御 指 導 御校 閲 を賜 っ た 恩 師木 村 郁 郎教 授 に 深甚 の謝 意 を表す る と共 に 直接 御 指 導 頂 い た坪 田輝 彦 講 師,多 田慎 也講 師 に 深 謝致 します. 文 献 1) 本 間 日 臣:び ま ん 性 汎 細 気 管 支 炎(び ま ん 性 呼 吸 細 気 管 支 炎).日 内 会 誌(1976) 65, 645-659.
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3) 木 村郁 郎,坪 田輝 彦,中 田安 成,高 橋 清,平 木 俊 吉,多 田慎 也,十 川 重 次郎,白 石 高 昌,藤 田豊 明:慢 性 進 行性 間質 性 肺 疾 患(DPB,IIP)に お け るATLA抗 体 並 び に その 関連 反 応 に 関す る研 究-DPBと 成 人 T細 胞 白血 病 の 併 発 例 を含 め て-.厚 生 省 特 定 疾 患 間 質 性 肺 疾 患 調 査 研 究 班,昭 和61年 度 研 究 報 告 書 (1987) pp 47-50. 4) 木 村郁 郎,大 熨 泰 亮,坪 田輝 彦,高 橋 功,中 田安 成,高 橋 清,上 田暢 男,平 木 俊 吉,多 田慎 也,十 川 重 次 郎,白 石 高 昌,米 井 敏 郎:び まん性 汎 細 気 管支 炎 にお け る成 人T細 胞 白血 病 の発 症 並 び にATLA関 連 反 応 の 出現 に つ い て.日 胸 疾 患 会 誌 (1987) 25, 240-244. 5) 木 村郁 郎,大 熨 泰 亮,坪 田輝彦,高 橋 功,中 田安 成,高 橋 清,平 木 俊 吉,多 田慎 也,十 川重 次 郎,名 部 誠,米 井 敏 郎,真 田 浩:特 発 性 間質 性 肺 炎 に おけ るATLA関 連 反応 並 びに 成 人T細 胞 白血 病 様 細 胞 の 出 現 につ いて.日 胸 疾 患 会 誌 (1987) 25, 245-250. 6) 高 月 清,内 山 卓,佐 川 公矯,淀 井 淳 司:リ ンパ 系腫 瘍 細 胞 の 表 面 マー カー-新 しい疾 患概 念 と して の
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