ゼアラレノンに対するモノクローナル抗体の作製
川村 理・江本知朗
Production of monoclonal antibodies against zearalenone
AWAMURA MOTO
Osamu K and Akio E Abstract
In order to establish immunological analytical methods for zearalenone ZEN( ), worldwide occurring in cereal grains and feeds contaminated Fusarium graminearum, specific monoclonal antibodies mAbs against ZEN( ) were newly prepared Spleen cells from the mice immunized with ZEN-bovine serum albumin were fused with.
2 . , ( .1
SP /O myeloma After HAT selection and cloning two anti-ZEN antibody producing hybridomas ZEN
2) . . 2, 0.25 .
and were obtained In the indirect competitive ELISA with ZEN the limit of detection was ng/mL The ZEN.2 mAb cross-reacted withα-zearalenol(60 ),β% -zearalenol(5.7 ),α% -zearalanol(7.1 ),% and β-zearalanol(0.9 ).% Our ELISA was sensitive and specific previously reported ELISAs.
Zearalenone Monoclonal antibody ELISA
Key words： , ,
緒 言
Fusa-ゼアラレノン（zearalenone ZEN Fig， ， .1）は， などが産生するマイコトキシンで，高 rium graminearum 頻度に麦類やトウモロコシをはじめとする穀類の汚染が 報告されている（1)． は致死性の急性毒性はそれほど ZEN 強くないが，女性ホルモン作用を有し，ZENの混入した 飼料を摂取した家畜に過エストロゲン症を引き起こし， 外陰部および乳房の腫れ，子宮肥大，卵巣の変化と不妊 ， 症などを引き起こすことが知られている（2 3)- ．そのため 穀物や飼料中の簡便かつ高感度なZENの検出・定量法が 必要とされている．そこで，本研究では，ZENの簡便か ZEN つ高感度な免疫化学的測定法の確立を目的として， に対 するモ ノク ローナ ル抗 体を作製し，競合的間接 で抗 抗体の特異性を検討した． ELISA ZEN 材料および方法 材 料 ，α ゼアラレノール（α ，α ，
ZEN - -zearalenol -ZEL）
β ゼアラレノール（β- -zearalenol，β-ZEL），β ゼアラ --zearalanol -ZAL ZEN-bovine serum
ラノール（β ，β ），
， albumin BSA conjugate( ) ，卵白アルブミン（ovalbumin OVA）Grade III， 1-ethyl-3 , 3
'-diethylamino-propyl-carbo-（ ）は 社製を，α ゼアララ
diimide EDPC Sigma Chemical
-ノール（α-zearalanol，α-ZAL），ヘミ塩酸カルボキシ CMA ' '-tetramethylbenzidine メトキシルアミン( )，3,3 ,5,5 (TMBZ)，フロイント完全アジュバンドおよびフロイン horseradish ト不完全アジュバンドは和光純薬社製を， （ ）標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン peroxidase HRP
抗体およびalkaline phosphtase ALP( ) 標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン抗体はTago社製をそれぞれ用いた． その他の試薬は特級又は同等品を用いた．BALB/cマウ ス（７週令，メス）は日本エスエルシーより購入した． 結合体の作製 ZEN-OVA 6 カルボキシメチルオキシム（ ， .
ZEN- '- ZEN-CMO Fig
1）は，Thouvenot Morfinと の方法（4）を一部変えて作製し た．すなわち，ZEN mg10.1 （31μmol）を１mlのピリ ジンに溶解後，CMA mg20.1 （92μmol）を加え，遮光 して撹拌しながら室温で24時間反応させた．溶媒を留去 したのち残渣を５ml NaOH pHの で ８に調整した水に溶解 したのち，0.1 塩酸でM pH3.0に調整した．酢酸エチル エステル７mlで６回抽出後，酢酸エチルエステル層を 集め，無水硫酸ナトリウムで脱水後，溶媒を留去した． は， （シリカゲル60（ ，展開溶 ZEN-CMO TLC MERCK） 媒：クロロホルム：エタノール（97 3）を用いたとき+ の 値は0.70， オキシムの 値は0.15）で確 ZEN Rf ZEN- Rf 認した． （ 5）
ZEN-CMO OVAと との結合は，Kawamuraらの方法 ZEN-CMO mg
を一部変えて作製した．すなわち， 4.2
Fig.1. The structures of zearalenone analogous 液pH7.0と混合後，EDPC mg4.4 を加えた．この溶液と 10 を溶解した５ の0.1 を混合し，遮光 OVA mg ml M NaCl し，室温でゆっくり撹拌させながら20時間反応させた． 反 応 液 は ， 0 . 0 1Mリ ン 酸 緩 生 理 食 塩 水pH7 . 4 （ 以 下 ）１ に対して４℃で４回透析した．また，同様に PBS L
ZEN- EDPC OVA
EDPC-して オ キシムを加えない 処 理 （ ）も作製した．透析後タンパク濃度は 法で測 OVA BCA 定し，314nmの吸光度からZENの結合数を算出した． 免 疫 マウス（７週令，メス）に等量のフロイント BALB/c 完全アジュバントと乳化したZEN-BSA g10μ を皮下注射 した．１週間後，等量のフロイント不完全アジュバント と乳化したZEN-BSA g10μ を皮下注射し，その１週間後， 等 量 の フ ロ イ ン ト 不 完 全 ア ジ ュ バ ン ト と 乳 化 し た 10μ を腹腔内投与した．その４週間後，等量 ZEN-BSA g ZEN-BSA のフロイント不完全アジュバントと乳化した 10μ を皮下注射し，４回目の免疫１週間後，採血し，g 抗体価を測定した．抗体価の高かったマウスに細胞融合 ３日前にZEN-BSA５μ を静注した．g 細胞融合およびクローニング 最終免疫３日後のマウスより脾細胞を取り出し，マウ スミエローマー細胞SP /O-Ag2 14と50％ポリエチレング リコール4000を用い常法（6）により細胞融合を行った． 選択後， に対する結合性により，ハイブ HAT ZEN-OVA リドーマの選択を行い，限外希釈法（6）により，２回以 上のクローニングを行い，安定な抗ZEN抗体産生ハイブ リドーマを得た．抗体のアイソタイプは，マウスモノク ローナル抗体アイソタイピングキット （II PIERCE）を 用いて決定した． ELISA 間接 マウスの抗体価の測定およびハイブリドーマの選択は， 間接ELISAによって行った．すなわち，ZEN-OVA（５ μg/ml 0.01 炭酸緩衝液M pH9.6）を50μ ずつ96 ウェルl -マイクロプレート（NUNC immunoplate II）の各ウェル に加え，４℃で一晩静置し，コーティングを行った．プ レートを0.05％Tweenn20を含むPBS PBS/Tween（ ）で３ 回洗浄したのち，各ウエルに0.1％OVA PBS（ 溶液）を 150μ ずつ加え，室温で１時間静置し，ブロッキングをl
行った．プレートをPBS/Tweenで３回洗浄したのち，50 μ のマウス抗血清希釈液または培養上清を加え，室温l で１時間反応させた．プレートをPBS/Tweenで４回洗浄 したのち，50μ のl ALP標識ヤギ抗マウスイムノグロブ リン抗体（PBS/Tweenで１ 2,000希釈）加え，室温で１/ 時間反応させた．プレートをPBS/Tweenで６回洗浄した の ち ， 100 μ の 1l mg/mLの 4-nitorophenyl phosphate, （ ）と
disodium salt hexahydrate Fermentasa Life Sciences
mM MgCl M pH 10 ２を含む１ ジエタノールアミン緩衝液（ 9.8）を加え，室温で30分間酵素反応を行い405nmの吸 光度を測定した． ELISA 競合的間接 競合的間接ELISAで抗ZENモノクローナル抗体の特異 ELISA ZEN-性 の 検 討 を 行 っ た ． 上 記 の 間 接 と 同 様 に を100μ ウェルでコーティングを行ったのち，同 OVA l/ 様にブロッキングを行った．10％（v/v）メタノールを ， 含むPBS/Tween溶液で希釈したZEN，α-ZEL，β-ZEL α-ZAL， ま た は β-ZALを 5 0 μ を 加 え ， さ ら に，l で希釈した各抗 モノクローナル抗体を50 PBS/Tween ZEN μ 加え撹拌後，室温で１時間反応させた．プレートをl で４回洗浄したのち，100μ の 標識ヤギ PBS/Tween l HRP 抗マウスイムノグロブリン抗体（PBS/Tweenで１ 10,000/ 希釈 ）加え ，室 温で１ 時間 反応させた．プレートを で６回洗浄したのち，100μ の0.005％過酸 PBS/Tween l mg/ml TMBZ M pH 化水素と0.1 の を含む0.1 酢酸緩衝液（ 5.0）を加え，室温で30分間酵素反応を行った．１ 硫M 酸50μ を加え反応を停止したのち，450l nmの吸光度を 測定した． 結 果 及 び 考 察 モノクローナル抗体の作製 細胞融合後，220ウェルに細胞をまき，HAT選択後， ． 155ウェル（68％）でハイブリドーマの増殖を確認した これらの培養上清を間接ELISA ZEN-OVAで に対しての 結合活性を調べた結果，７ウェル（6.9％）が陽性で あった．この７ウェルのハイブリドーマを限界希釈法で ZEN-クローニングを２回行った結果，６クローンの と反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドー OVA マを得た．これらのクローンの産生する抗体をZEN.１ ～６と名付けた． 抗体の特性 これらの抗体の特性を明らかにするために，競合的間 接ELISA ZENで とα-ZALとの反応性を検討した（Fig.
ZEN g/ml ZEN 2 ．その結果，） .１と２抗体では，１μ の またはα-ZAL共 存下でZEN-OVAと の反応が強く阻害 （90％以上）されたが，ZEN.４と５抗体では，10μ の 存在下でも結合阻害は認められなかった． g/ml ZEN .４抗体では，１と10μ のα 共存下でそれ ZEN g/ml -ZAL ぞれ15％，25％の阻害が認められ，ZEN.５抗体では， 10μg/mlのα-ZAL共存下でのみ16％阻害されたにすぎ なかった．この結果よりZEN.４と５抗体はα-ZALと弱 い反応性を有する抗体であると言える．また，ZEN.３ と６抗体では，10μg/ml ZENの またはα-ZAL共存下で でも 有為なZEN-OVAと の 結合 阻害は確認なかった． とα との反応性の強い .１と２抗体のアイ
ZEN -ZAL ZEN
ソタイプをマウスモノクローナル抗体アイソタイピング
.2. α .1, 2, 3, 4, 5,
Fig Comparison of inhibition presence of zearalenone or -zearalanol with ZEN
6 .
キッ ト を 用い て調べ た結 果，い ずれもII IgG a2 ・ κで あった． .１と２抗体の交差反応性を検討した結果，両抗 ZEN 体はほぼ同じ交差反応性を有していた．そこで，より抗 体価の高かったZEN.２抗体をについて詳細にその特異
性を検討した（Table Fig1および .3 ．その結果，） ZEN. ２抗体は0.25ng/mlまでのZEN存在下で有為に阻害（15 ％以上）が認められた．すなわち，本ELISAでは0.25 までの の検出が可能であった．また，50％結 ng/ml ZEN 合阻害に必要なZENおよびZEN関連化合物の濃度は， で 1.2 ， α で 2.0 ， β で 20.9
ZEN ng/mL -ZEL ng/mL -ZEL
，α で16.8 ，β で131.6 で
ng/mL -ZAL ng/mL -ZAL ng/mL
あり，ZENとの反応性を100％とした場合の交差反応性
は，α-ZELが60.0％，β-ZELが5.7％，α-ZALが7.1％， β-ZALが0.9％であった．これらの結果から，ZEN.２ Table1. Cross-reactivity of zearalenone analogous in the
in-.2 .
direct competitive ELISA with ZEN antibody
Amount of required Cross-reactivity
Analogue for50% inhibition ( )
% (ng/mL) 1.2 100.0 Zearalenone α-Zearalenol 2.0 60.0 β-Zearalenol 20.9 5.7 α-Zearalanol 16.8 7.1 β-Zearalanol 131.6 0.9 抗体は，ZENの全体の構造を認識し，６ 位のＯＨ基が' ' ' α位だとβ位より約10倍強く反応した．また，１ と２ 炭素が２重結合であると単結合より約10倍強く反応した ことから，ベンゼン環と１ と２ 炭素が平面構造である' ' ことがZEN.２抗体との結合に関与している可能性が示 唆された． .２抗体を用いた と既報の とを比較
ZEN ELISA ELISA
す る と ，DIxonら（ 7 ）の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た
では，0.5 までの の検出が可能であり，
ELISA ng/mL ZEN
我々のELISAの方が２倍感度が高い．また，DIxonらの で は と α に ほ ぼ 同 程 度 に 反 応 し ， β ELISA ZEN -ZEL
，α ，β に対しても25～35％と比較的強
-ZEL -ZAL -ZAL
い交差反応性を示したが，我々のELISAでは，α-ZELと 60％の強い交差反応性を示したが，β-ZEL，α-ZAL， β-ZALと はいずれも８％以下であり，より特異的に の検出が可能であった．また， ら のウサ ZEN WARNER （8） ギの抗血清を用いたELISAの検出感度は0.5ng/ml，50％ 阻 害 に 必 要 なZENの 濃 度 は 5 . 8ng/mlで あ り ， 我 々 の の方が，それぞれ約２倍，約５倍小さい値であっ ELISA た． 我々が新たに樹立したハイブリドーマZEN.２の産生 する抗体を用いたELISAは，高感度で特異性の点でも既 報のELISAより優れており，ZENの検出に有用な手法と して期待できる． .3. .2 .
Fig Cross-reactivity of ZEN monoclonal antibody in the indirect competitive ELISA
The detection limits expressed as concentration giving over, 15% --- inhibition observed in the( )
, 0.25 .
要 約 で免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ ZEN-BSA 細胞を融合することにより，２つの抗ZENモノクローナ ル 抗 体 （ い ず れ もIgG２ ・ κ ） 産 生 ハ イ ブ リ ド ー マa （ZEN.１と２）を樹立した．競合的間接ELISAにおい て，ZEN.２抗体を用いた場合0.25ng/mL ZENの の検出 が可能であった．また，ZEN.２抗体は，α-ZEL，β ，α ，β とそれぞれ60％，5.7％，7.1％，
-ZEL -ZAL -ZAL
0.9％の交差反応性を示し，既報のモノクローナル抗体 ELISA より検出感度，交差反応性の点で優れていた．本 はZENの検出に有用な手法として期待できる． 引 用 文 献 P , C. M. , D'M , J. P. F. , and LACINTA ELLO
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