卵黄Vitellinに関する研究(第1報) : Vitellinのアミノ酸組成について

卵 黄Vitellinに

関 す る 研 究(第1報)

Vitellinの ア ミ ノ酸 組 成 に つ い て

安

福

英

子

木

戸

詔

子*

Studies

on the Vitellin

of Yolk (Part

1)

On the Amino Acid Camposition of Vitellin

Hideko Yasufuku Syoko Kido

L 緒 言 卵 黄 の リンた ん ば く質 と して は,リ ボ た ん ば く質 よ り脂 質 を 除 い て 得 られ るVitellin, Vitelleninと10% の 高 含 量 に リンを 含 む Phosvitinが5:3:2"の 割 合 で 存 在 して い る。 しか し,こ れ らの 個 個 の た ん ぱ く質, あ るい は 相 互 関 係 に つ い て は ま だ 明 確 で な い 点 が 多 い 。 卵 黄 の 主 た ん ば く質 で あ るVitellinに 関 す る研 究 は の 1867年Hoppe-Soylerに よ り リボ た ん ば く質 で あ る こ とが 明 らか に され,こ の リポ た ん ば く質 か らア ル コー ル で 脂 質 を 除 く と,中 性 塩 が あ って も溶 解 しな くな る とい う性 質 を も っ て い る。 Vitellinは 中 性 で は 溶 け な い た め か,そ の理 化 学 的 性 質 の研 究 は あ ま りされ て い な い 。 ア ミ ノ酸 組 成 に つ 2) い て は1950年Lewisら が,18時 間,加 水 分 解 した も の に つ い て 微 生 物 法 に よ り定 量 し て い る。 リン の結 合 3) 4) 位 置 お よび 構 造 に 関 し ては,Levene, Rapoportら に よ りVitellinの 分 解 生 成 物 よ りセ リン と リ ンの 結 合 が 報 告 され て い る。 そ こで わ れ わ れ は,近 年 ク ロマ トグ ラ フ ィー の著 し い 発 展 に と も ない,ア ミノ酸 の微 量 分 析 が 可 能 とな っ た の で,Vitellinの ア ミノ酸 組 成 を ア ミノ酸 自動 分 析 器 を 用 い て 定 量 し,ま た,酸 分 解 に よ る時 間 的 変 化 の 検 討 を 行 な った 結 果,セ リ ンの リン酸 エ ス テ ル で あ る ホ ス ホ セ リ ンを定 量 す る こ とが で き,他 の ア ミノ酸 に つ い て もか な りの 差 を認 め た の で 報 告 す る。 II.実 験 の 部 II-1.実 験 の方 法 II-1-1.試 料 の 調 整 5) Osborne, CamPbellら の 方 法 に よ り,鶏 卵 シ ェ ー パ ー ス タ ー ク ロ ス288号 の 卵 黄 を,卵 黄 膜 を 破 らな い よ うに し て 蒸 留 水 で 卵 白 を よ く洗 い 去 り,卵 黄 に 等 量 の 10%-NaClを 加 え て よ く 混 合 し た 後,エ ー テ ル を 重 層 し,か くは ん し て 一 夜 放 置 す る 。 エ ー テ ル に 可 溶 な 遊 離 の 脂 質 を,エ ー テ ル 層 が 無 色 に な る ま で エ ー テ ル を 取 替 え て か くは ん す る 。 次 に 卵 黄 膜 や カ ラ ザ な ど の 不 溶 物 を 除 き,3倍 量 の 水 で 希 釈 し,水 で 透 析 を 行 な う と 白 色 の 沈 殿 を 生 じ た 。 こ れ を1N-NaClに 溶 解 し 再 び 透 析 す る こ と を 数 回 繰 り返 す こ と に よ りLipovi-tellinを 得 た 。 こ のLigovitellin Y'-80°oア ル コ ー ル を

加 え50。Cに 加 温 し,解 溶 し て く る 脂 質 を,ア ル コ ー ル を 取 替 え て 完 全 に 除 去 し,さ らに 蒸 留 水,エ ー テ ル で よ く洗 浄 し た 後,真 空 乾 燥 を 行 な い 白 色 粉 末 のVite・ llinを 得 た 。 こ のVitellinを 定 量 測 定 に 使 用 す る 場 *本 学 食 品化学 研究室 合 は,ア プ デ ル ハ ル デ ン に て 乾 燥 し た も の を 試 料 と し た 。 II‐1‐II Vitellinの 純 度 検 定 上 記 の 方 法 で 得 たVitellin の 純 度 検 定 を 次 に 示 す よ う に 電 気 泳 動,カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り行 な っ た 。 1)Disc電 気 泳 動 エ ス エ ム 機 器 製Disc電 気 泳 動 装 置8型 を 使 用 し,永 井 の 氏 の 方 法 に よ り,pH 10.0の グ リ シ ン緩 衝 液 に100∼300μ molに 溶 解 し たVitellinを 図1 試 料の調整

- 28-pH 9. 4ゲルを用い，濃縮用ゲルに達するまでは1本当 り2mA，それ以後は5mAで80分泳動を行なった。同 時に卵黄を 1N-NaClに溶かしたものを比較対照とし て行なった。その泳動は図 2のようなパターンを示し， Vitellinは1つのバンドを認めた。 2)セファデ‘ックスカラムクロマトグラフィー 4-250ユニパーサルスベクトロアナライザーを使用 して， Vitel1inを pH11. 0の炭酸ナトリウム・重炭酸 ナトリウム緩衝液で溶かし，さらに等量の8 Mの尿素 を加えて完全に-溶解し，同緩衝液で透析し，尿素を除 去した後， Sephadex G-100を用いて， 260mμ の吸 収より図3のクロマトグラムを得た。 3) Tiseliusの電気泳動 HTB-2型日立 Tiselius装置を用L，、 Vitellinを pH 10. 0のグリシン緩衝液に1%濃度に溶解し，同緩衝

，

E E E -a ・

n

・ a - - E ， ρ ﹂ + L U V

Y

o

l

k

泳動条件:ポリアクリルアミド， 9.4ゲJ，レ 1本当り5mA， 80min，試料たんぱく濃度300!lmol 図2 Discの電気泳動 0.3 0.2 n d H 町 d 羽 哨 崇 30 60 90 120 150 時向(帆仇.) Sephadex : G-100， カ ラ ム :2.2 x 20佃 流速:18ml/hr. 緩衝液:

o

.

1M-Na2C03-NaHC03(pH11.0) 試料:Vitellin1.5mg(0. 2ml) 図3 セファデックスカラムクロマトグラフィー

-

・

崎

国

，

緩衝液:pH10.0グリシン緩衝液(イオン強度

.

o

1) 透 析 :5'C， 24hr. 泳動:50C， 65V， 60min. 試 料 :1%たんぱく濃度 図4 Tiseliusの電気泳動 食物学会誌・第26号 液で1.5A， 60分泳動を行ない，図 4に示すような泳 動図を得た。 以上のごとく，電気泳動，カラムクロマトグラフィ ーにより，われわれの得た Vitellinは，ほぼ均一で あると考えられたので，これを試料としてアミノ酸組 成を検討した。なお，窒素とリンの定量を， ミクロビ ューレット法と Fiske-Subbarow法で行なった結果， その組成は窒素15.8%， リン1.2%，窒素とリンの比 は13.2となっ

T

こ。 11 -1 -111 Vitellinのアミノ酸組成 1) Vitellinの加水分解 Vitel1in 10mgを 500倍量の6N-HClに溶解し，減 圧脱気後封管し，分解炉で1100_C に加熱し， 8・24・48 ・72時間分解したものを，減圧アルカリデシケーター 中で HClを除去し， pH 2. 2の希釈用クエン酸緩衝液 で 10mlに定容して冷凍保存し，試料とした。 表1 Vitellinの酸分解時間によるアミノ酸の変化 (μmolfg Vitellin) アミノ酸 I 8 hr. I 山

￨

山 I 72 hr Lys. 546 661 申 536 591 His. 172 211 申 174 192 NH3 659 牢 861 874 1003 Arg. 457 567

*

456 482 P-Ser. 67 48 40 36 Cys-Cys 95 62 34 15 Asp. ₇₄₀

*

668 701 753 Thr. ₄₃₇

*

379 397 412 Ser. 865 732 727 700 Glu. ₇₈₁

_*

716 777 826 Pro. 429 326 379 365 Gly. 407 申 341 377 396 Ala. ₆₁₂

*

554 602 637 Val. 435 448 525

*

456 恥1et. 224 159 190 142 I1eu. 440 393 513

*

484 Leu. ₇₄₉

_*

632 743 723 Tyr. ₂₆₉

*

228 238 232 Phe. ₂₉₆

*

237 262 284 この表の数値は窒素に対する各の加水分解時間の アミノ酸の回収率で換算したものをVitellin19に 対する μmol数で表わしたもので， 3回の平均値 を示した。 本個個のアミノ酸の分解時間による変化を検討し， この値をVitel1in中のアミノ酸含量とした。*の ついていないものは外そう法により 0時間の値を とっ7こ。

す。各のデーターは窒素に対するアミノ酸の回収率で 換算したものを Vitellin19に対する μmolで表わし たもので， 3回の平均値をとったものである。 4) Vitellinのアミノ酸組成 各アミノ酸の分解より適当と考えられる最高値の分 解時間の値(表

1

*)をとり，また，ホスホセリシ， シスチン酸，セリン，プロリン，メチオニンについて は分解時間が長くなるにしたがって減少しているので 図5 -④に示すように外そう法により 0時間の値をと り，たんぱく質100g中のアミノ酸の g数に表わした ものを表 2に示し， Lewisらの測定値と比較検討を行 なった。 IIーII 実験結果および考察 1) Vitel1in のアミノ酸組成 Lewisらとわれわれの分析法とは異なっており，ア ミノ酸組成を比較検討を行なうことにはいろいろの問 題があり，また，単一たんぱく質としての Vitellinそ 2) アミノ酸の定量 目立 KLA-3B形アミノ酸自動分析器にて，アミネ ックス A-4を用いて定量を行なった。塩基性アミノ酸 は0.9x 10佃カラムを使用し，中酸性アミノ酸は0.9x 50佃カラムを使用して Vitellin0.5叫に相当する 0.5ml をチャージしカラム温度550

_C

_{，流速は緩衝液60m}

₁

_/

_hr. ニンヒドリン30ml/hr.，10佃カラムは pH5.50クエン酸 緩衝液で 1時間分析， 50佃カラムは pH3. 25クエン酸 緩衝液 (HCl 4mljl

，

アルコール50mljlを加えて使 用)， pH4.25クエン酸緩衝液で 3時間分析を行ない定 量した。なお，シスチンは過ギ酸酸化法によりシスチ ン酸として定量した。また， トリプトファンは， デヒド法により比色定量を行なった。 3) Vitel1inの各アミノ酸の酸分解による時間的変 アル Vitellinのアミノ酸組成 (gj100g Vitel1in) 表 2 一 AV--円 t マ h v ・ 川 一

M

M

一_B 一 1 6 2 数 す 山 山 一 7 2 一 一 g

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5

一に中 一 5 1 1

下

111111lil-111111111111lili--111

﹁

L g g 一 -一 一 一 -A U A U 一 一 一 3 7 3 1 8 9 9 9 5 5 0 1 4 5 2 5 7 8 9 9 一 9 一

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一

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B アミノ酸 化 Vitellin中のアミノ酸組成を定量するのに，各アミ ノ酸の定量に適した分解時間を見つけるのは非常に困 難で不可能に近い。通常，たんぱく質分解時間は

2

4

時 間といわれているが，カゼインやグルテンなどのたん ぱく質は

4

8

時間といわれているので，

8' 2

4

・

4

8

・

7

2

時間分解したものを定量した。 Vite11in 中の各アミノ 酸の酸分解による時間的変化を表1および図 5に示

7

.

5

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8

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4

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時間，①は外そう法に より 0時間の値を Vitellin中のアミノ酸含量とした。 図5 マz Vitellinの酸分解による各アミノ酸の変化 o 8 2.匂 4' 介解時間(hr.)

- 30

一

のものにも問題があるが， たんぱく質100g中のアミ ノ酸残基に対するg数で表わした値(表2(B)算出法〉は， 分析法および全窒素含量の数値が正しければちょうど 100になるはずである。そこで Lewisらの値と比較す る場合， Vitellin中のアミノ酸の相互の比率は変らな いから，表 2以外のアミノ酸は含まれてないものとす れば， Lewisらの分析した回収率は84.4%，われわれ の場合は99.0%となったので，この回収率より各アミ ノ酸の分析値を補正して，両者を100とすると，各ア ミノ酸含量は表3に示すように， Lewisらの分析値に 対しリジン 19.0%，セリン 19.3%，アラニン17.2% と大きな差を示し，次いで10%以上のものが，スレオ ニン，ク、、ルタミン酸，シスチン，バリン，チロシンと なった。 次に，各アミノ酸の分析値(以下に示すアミノ酸含 量は表 2(司算出法による〉を比較してみると， トリプ トファンについては， Lewisらはアルデ、ヒド法で12時 間の値をとり1.O，gと報告しているが，われわれは3 時聞から24時間の実験値より12時間では同じく1.0g となったが， 6時間で最高値を示し1.1gとなった。 リジンは 2.4gの最も大きな差を生じたが，これは 図5一⑧のごとく24時間で急に分解値が大きくなって いるので分解時間の違いによることが大きく原因して いるのではなし、かと考える。 表3 Vitellin中の全アミノ酸量を 100gとした各アミノ酸の比率 く%) アミノ酸1著 者 1

1

.

c

.

Lewis 1両者の差

a

にC対leすwるisの%{直/ Try. 1.21 1.18 0.03 (2.5) Lys. 8.59 7.22 1.37 (19.0) His. 2.93 3. 19 0.26 (8.2) Ary. 8.99 8.88 0.11 (1.2) 'P-Ser. 1.

7

2

Asp. 8.69 8.29 0.40 (4.8) The. 4. 14 4. 73 0.59 (12.5) Ser. 8.89 11.01 2. 12 (19.3) Glu. 10.30 11.49 1.19 (10. 4) Pro. 4.24 4.38

o

.

14 (3.2) Gly. 2.42 2.48 0.06 (2.4) Ala. 4.44 3. 79 0.65 (17.2) Cys. 1.31 1.54 0.23 (14.9) Va1. 5.35 6.27 0.92 (14.7) 加'let. 3.23 2.96 0.27 (9. 1) Ileu. 5.96 5.45 0.51 (9. 4) Leu. 8. 69 8.76 0.07 (0.8) Tyr. 4.44 4.02 0.24 (10. 4) Phe. 4.44 4.26 O.18 (4.2) 食物学会誌・第26号 アルギニンについても同様のことが考えられ，ヒス チジンの差も， リジン，アルギニンほどの差はないが 同じ傾向が見られる。 セリンについては，酸と加熱するだけで徐徐に分解 でナこの分解は約10%とされ，種種のたんぱく質のセ リン含量にはこの補正が施されている。 Lewisらも 10%の補正を加えているが，われわれはセリンについ ては前述のごとく外そう法による値をとったが， 8時 間の測定値をとり10%増の補正を加えた値を算出する と8.4gとなりその差はさらに大きくなる。また，カ ゼイン中のセリンのようにリン酸エステル結合をして いるものではさらに分解が進むといわれているので， 実際にはもう少し多く含まれているものと考えられる。 なお，セリンについては全アミノ酸を通じて低い値を 得たが，これはセリンとは別にセリンとリン酸エステ ル結合したホスホセリンを別に定量することがで、きた からであろうと考える。 スレオニンについては，セリンと同様5 %分解する といわれているが，一般にはセリンのように補正値は とられていない。 アスパラギン酸，スレオニン，グ、ルタミン酸，グリ シン，アラニγ，ロイシン，チロシン，フェニールア ラニンは表2のごとくO.1 g ""'1. 6 g多い値を示したが， これは図5一①のごとく， 24時間にかけて減少の傾向 が見られ，フェニールアラニンも酸加水分解中に約5

M

分解するといわれ，チロシンも分解が認められてい ることから， Lewisらの測定値は18時間酸分解によ る分析値であるので，分解時間に一因があると考えら れる。 プロリン，メチオニンについても同様のことが考え られる。以上の結果より，たんぱく質のアミノ酸組成 を定量する場合は，各アミノ酸の定量に適した分解時 間を見つけることは非常に困難ではあるが，各アミノ 酸について検討し，表1のごとく適当と考えられる分 解時間の値をとることにより， 99.0%の高い回収率を 得ることがで、きた。 III. 要 約 Vitellinのアミノ酸組成をアミノ酸自動分析器を用 い，各アミノ酸の酸分解時間による変化を定量し，次 の結果を得た。 (1)セリンとリン酸エステル結合したホスホセリンと して定量することがで、きた。(ホスホセリンの分離， 同定ならびに定量値については第 2報に述べる〉 (2)各アミノ酸の酸分解時間による変化を検討し，ア スパラギン酸，スレオニン，ク、、ルタミン酸，クマルシン，

アラニン，ロイシン，チロシン，フェニールアラニン については8時間， リジン，ヒスチジン，アルギニン は24時間，パリン，イソロイシンは48時間，ホスホセ リン，シスチン，セリン，プロリン，メチオニンは外 そう法により 0時間の分解値をとり， 99.0%の高い回 収率を得ることがで、きた。さらに，ホスホセリンなど の測定方法を検討することにより，ほぼ100%の回収 率が得られると考えられる。 以上のアミノ酸組成より， Vitellinのプロテンスコ アは，第一制限アミノ酸はトリプトファンで90.1とな り，食品として栄養学上良質のたんぱく質である。 また，卵黄中のリンたんぱく質である Vitellin中の ホスホセリンの存在は，ふ化に際して何らかの重要な 役割りを果していると考えられ，その生化学的意義に ついて検討する必要がある。 本研究結果の大要は第22回，日本栄養食糧学会総会 において発表した。 参 考 文 献 1) G. F.K. Hoppe-Seyler， Med. Chem. Untersuch.， 2， 215(1867) 2) J. C. Lewis， N. S. Snell， D. J. Hirshmann， H. Fraenkel-Cornat， J. Biol.Chem.， 186， 23 (1950) 3) P. A. Levene， A. SchormuIIer， J.Biol.Chem.，

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1

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