ROCK 阻害剤が胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の分化に及ぼす影響 利用統計を見る

ROCK 阻害剤が胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の分

化に及ぼす影響

著者

上芝原 佑

学位授与大学

東洋大学

取得学位

博士

学位の分野

生命科学

報告番号

32663甲第396号

学位授与年月日

2016-03-25

URL

http://id.nii.ac.jp/1060/00008449/

2015 年 度

東 洋 大 学 審 査 学 位 論 文

ROCK 阻 害 剤 が 胚 性 幹 細 胞 と 人 工 多 能 性 幹 細 胞 の

分 化 に 及 ぼ す 影 響

東 洋 大 学 大 学 院 生 命 科 学 研 究 科 生 命 科 学 専 攻 博 士 後 期 課 程 学 籍 番 号 4 910 13 0 001 氏 名 上 芝 原 佑

ROCK 阻 害 剤 が 胚 性 幹 細 胞 と 人 工 多 能 性 幹 細 胞 の

分 化 に 及 ぼ す 影 響

ROCK 阻害剤が胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の

分化に及ぼす影響

目 次

頁 序 論 1 第1章 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細 胞 増 殖 に 及 ぼ す 影 響 8 第 1 節 緒 言 8 第 2 節 実 験 方 法 9 1.2.1 培 地 等 の 調 製 9 1.2.2 培 養 プ レ ー ト の 調 製 11 1.2.3 フ ィ ー ダ ー 細 胞 の 培 養 12 1.2.4 マ ウ ス ES 細 胞 の 増 殖 培 養 12 1.2.5 マ ウ ス ES 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存 13 1.2.6 マ ウ ス iPS 細 胞 の 増 殖 培 養 14 1.2.7 マ ウ ス iPS 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存 15 1.2.8 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 未 分 化 状 態 の 確 認 16 1.2.9 ROCK 阻 害 剤 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細 胞 増 殖 へ の 影 響 16 第 3 節 実 験 結 果 17 1.3.1 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 17 1.3.2 ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 へ の 影 響 17 第 4 節 考 察 18 第 5 節 結 言 19

第 6 節 参 考 文 献 19 第2章 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 29 第 1 節 緒 言 29 第 2 節 実 験 方 法 30 2.2.1 培 地 等 の 調 製 30 2.2.2 培 養 プ レ ー ト の 調 製 30 2.2.3 マ ウ ス ES 細 胞 の 浮 遊 培 養 30 2.2.4 マ ウ ス iPS 細 胞 の 浮 遊 培 養 31 2.2.5 浮 遊 培 養 で 形 成 さ れ た 細 胞 コ ロ ニ ー の 未 分 化 状 態 の 確 認 31 2.2.6 細 胞 コ ロ ニ ー の 分 化 培 養 31 2.2.7 免 疫 蛍 光 染 色 32 2.2.8 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ る 陽 性 細 胞 数 の 計 数 33 2.2.9 統 計 分 析 33 第 3 節 実 験 結 果 34 2.3.1 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の 未 分 化 状 態 の 確 認 34 2.3.2 ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 34 2.3.3 分 化 し た 神 経 細 胞 の 種 類 の 同 定 36 2.3.4 ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 37 2.3.5 分 化 し た 筋 肉 細 胞 の 種 類 の 同 定 38

第 4 節 考 察 39 第 5 節 結 言

40 第 6 節 参 考 文 献

40 第3章 ROCK 阻 害 剤 に よ る ES 細 胞 の 神 経 細 胞 へ の 分 化 促 進 メ カ ニ ズ ム 56 第 1 節 緒 言

56 第 2 節 実 験 方 法

57 3.2.1 培 地 等 の 調 製

57 3.2.2 培 養 プ レ ー ト の 調 製

57 3.2.3 マ ウ ス ES 細 胞 の 浮 遊 培 養 57 3.2.4 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ る ERK 及 び Akt の 検 出 57 （ 1） 細 胞 サ ン プ ル の 調 製 57

（ 2） SDS-PAGE 電 気 泳 動 に よ る ERK ま た は Akt の 分 離 及 び ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ る 検 出 58 3.2.5 各 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 阻 害 60 3.2.6 免 疫 蛍 光 染 色 61 3.2.7 細 胞 内 Ca2 +_{レ ベ ル の 測 定 61} 3.2.8 統 計 分 析 62 第 3 節 実 験 結 果 62 3.3.1 ROCK 阻 害 剤 が ERK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 及 ぼ す 影 響 62 3.3.2 ROCK 阻 害 剤 が PI3K/Akt シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 及 ぼ す 影 響 64 3.3.3 ROCK 阻 害 剤 が PLC シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 及 ぼ す 影 響 65

3.3.4 ROCK 阻 害 剤 が Cdc42/Rac に 及 ぼ す 影 響 66 第 4 節 考 察 66 第 5 節 結 言 68 第 6 節 参 考 文 献 69 終 章 総 括 と 今 後 の 課 題 87 本 研 究 に 関 す る 原 著 論 文 と 学 会 発 表 91 そ の 他 の 関 係 論 文 及 び 学 会 発 表 94 謝 辞 95

序 論

（ 1） 胚 性 幹 細 胞 及 び 人 工 多 能 性 幹 細 胞 に つ い て

マ ウ ス 胚 性 幹 細 胞 （ embryonic stem cell： ES 細 胞 ） は 、 1981 年 に マ ウ ス 胚 の 発 生 3.5 日 目 の 胚 盤 胞 の 内 部 細 胞 塊 （ inner cell mass） か ら 樹 立 さ れ [1]、 続 い て ヒ ト ES 細 胞 が 1998 年 に 樹 立 さ れ た [2]。 樹 立 さ れ た ES 細 胞 は 、白 血 病 抑 制 因 子（ leukemia inhibitory factor：LIF） を 培 地 に 添 加 し て 培 養 す る こ と で 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し た ま ま 半 永 久 的 に 増 殖 さ せ る こ と が で き る 。さ ら に 、 ES 細 胞 は 外 胚 葉 、 中 胚 葉 、 内 胚 葉 の 3 胚 葉 全 て に 分 化 す る 多 分 化 能 を 有 し て い る 。 こ れ ら の 特 徴 か ら 、 創 薬 の た め の 細 胞 源 や 移 植 を 目 的 と し た 再 生 医 療 分 野 へ の 応 用 が 期 待 さ れ て い る 。し か し 、ES 細 胞 は 作 製 の 際 に 受 精 卵 を 用 い て い る た め 、倫 理 的 な 問 題 や 拒 絶 反 応 と い っ た 課 題 が あ る [3]。一 方 、こ れ ら の 問 題 を ほ ぼ 解 決 し た の が 人 工 多 能 性 幹 細 胞（ induced pluripotent stem cell： iPS 細 胞 ） で あ る 。 マ ウ ス iPS 細 胞 は 、 2006 年 に 4 つ の 遺 伝 子 （Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）を マ ウ ス の 繊 維 芽 細 胞 に ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て 組 み 込 む こ と で 作 製 さ れ た [4]。続 い て 2007 年 に ヒ ト iPS 細 胞 が 樹 立 さ れ た [5]。 iPS 細 胞 は ES 細 胞 と 同 様 の 増 殖 能 及 び 多 分 化 能 を 有 し て い る だ け で な く 、 体 細 胞 か ら 樹 立 す る こ と が 可 能 な た め 、 患 者 由 来 の iPS 細 胞 を 用 い る こ と に よ り 疾 患 の 発 症 メ カ ニ ズ ム の 解 明 に も 有 効 で あ る [6]。 ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 創 薬 や 再 生 医 療 分 野 に 応 用 す る に は 、分 化 を 制 御 す る 基 礎 研 究 が 重 要 で あ る 。 そ の た め 、 多 く の 研 究 機 関 で 特 定 の 細 胞 に 効 率 良 く 分 化 さ せ る 物 質 の 探 索 や 、 遺 伝 子 レ ベ ル で 分 化 を 制 御 す る 方 法 な ど が 試 み ら れ て い る 。我 々 は 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細

胞 へ の 効 率 的 な 分 化 方 法 に つ い て 検 討 し た 。 （ 2） ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 神 経 変 性 疾 患 に は 多 く の 場 合 、効 果 的 な 治 療 薬 が 少 な い こ と が あ り 、 ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 用 い た 創 薬 研 究 に 期 待 が 寄 せ ら れ て い る [7]。 ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 誘 導 法 と し て 、 LIF を 除 い た 培 養 に よ り 、 3 胚 葉 に 分 化 す る 能 力 を 有 す る 胚 様 体 （ embryonic body： EB ） を 形 成 さ せ 、 レ チ ノ イ ン 酸 、 繊 維 芽 細 胞 増 殖 因 子 （ fibroblast growth factor-2： FGF） や 上 皮 増 殖 因 子 （ epidermal growth factor： EGF） な ど を 添 加 す る 方 法 が 用 い ら れ て い る [8]。 ま た 、 BMP シ グ ナ ル と Nodal/Activin/TGF-β シ グ ナ ル を 同 時 に 阻 害 剤 で 阻 害 す る こ と で 、 神 経 系 へ の 分 化 効 率 が 上 が る と い う 報 告 が あ る [9]。 こ れ ら の 報 告 は 、 操 作 が 難 し く 分 化 ま で に 時 間 が か か る と い っ た 欠 点 が あ る 。 よ り 簡 便 な 操 作 で ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 神 経 細 胞 に 分 化 さ せ る 方 法 と し て 、我 々 の 研 究 室 で は 、 ニ ワ ト リ 8 日 胚 脊 髄 後 根 神 経 節 の 培 養 上 清 液 （ dorsal root ganglia-conditioned medium： DRG-CM） を ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 培 養 時 に 添 加 す る こ と で 、 効 率 良 く 神 経 細 胞 に 分 化 さ せ る こ と が 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た [10]。し か し 、DRG-CM の 添 加 に よ る 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 は 50%程 度 で あ り 、 よ り 簡 便 で 効 率 的 な 分 化 促 進 剤 の 探 索 を 行 っ た 。

（ 3） Rho キ ナ ー ゼ （ ROCK） 阻 害 剤 に つ い て

Rho キ ナ ー ゼ （ ROCK） は 、 低 分 子 量 G タ ン パ ク 質 Rho の 下 流 に 位 置 す る セ リ ン /ス レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ と し て 見 出 さ れ た [11]。 Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 は 、 ア ク チ ン 細 胞 骨 格 や 細 胞 接 着 な ど 様 々 な 細 胞 機 能

に 関 わ っ て い る こ と が 知 ら れ て い る [12、 13]。 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 研 究 に お い て 、継 代 培 養 な ど の 操 作 で は 細 胞 を 分 散 さ せ る 必 要 が あ る が 、 こ れ ら の 幹 細 胞 は 分 散 さ せ た 状 態 で 培 養 す る と ア ポ ト ー シ ス に よ り 細 胞 死 を 起 こ す こ と が 知 ら れ て い る 。 Watanabe ら は 分 散 に よ り 起 こ る ア ポ ト ー シ ス は 、Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 関 わ っ て お り 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ り ア ポ ト ー シ ス が 抑 制 さ れ る こ と を 見 出 し た [14]。 さ ら に 、 細 胞 を 凍 結 保 存 す る 際 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る と 、解 凍 後 の 細 胞 生 存 率 が 上 が る こ と が 報 告 さ れ た [15]。ROCK 阻 害 剤 は 、蒸 留 水 に 溶 解 で き 、最 低 で も 4 週 間 は 室 温 で 安 定 し て お り 、 時 間 や 濃 度 依 存 的 に 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る [16]。 こ れ ら の 報 告 よ り 、 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 増 殖 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と が 行 わ れ る よ う に な っ た 。

Hirose ら 及 び Bito ら は 、 Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 神 経 細 胞 の 軸 索 の 退 縮 に 関 わ っ て お り 、 ROCK の 選 択 的 な 阻 害 剤 で あ る ROCK 阻 害 剤 Y-27632 を 添 加 す る こ と に よ り 、 軸 索 の 退 縮 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た [17、18]。 ま た 、 Rho や ROCK は 、 神 経 変 性 疾 患 の ア ル ツ ハ イ マ ー 病 や パ ー キ ン ソ ン 病 な ど に も 関 与 し て お り 、 創 薬 の タ ー ゲ ッ ト に な る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る [19-22]。 以 上 の こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 神 経 細 胞 に 分 化 さ せ る 新 規 分 化 促 進 剤 と し て 有 効 で あ る と 推 測 さ れ た 。 （ 4） 本 研 究 内 容 Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 様 々 な 細 胞 機 能 に 関 わ っ て い る こ と 、 ROCK 阻 害 剤 が ア ポ ト ー シ ス や 神 経 細 胞 の 軸 索 の 退 縮 を 抑 制 す る こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ

せ る 効 果 が あ る の で は な い か と 考 え た 。ROCK 阻 害 剤 は ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と か ら 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 培 養 時 の 細 胞 死 を 抑 制 で き る 可 能 性 が あ る こ と 、 ま た 神 経 細 胞 の 軸 索 の 退 縮 を 抑 制 す る こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 が 分 化 促 進 剤 と し て 利 用 で き る 可 能 性 が あ る 。そ こ で 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 研 究 し た 。 以 下 に 、 各 章 で 述 べ る 内 容 を 示 す 。 第 １ 章 で は 、 ROCK 阻 害 剤 を マ ウ ス ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 培 養 液 に 添 加 す る こ と で 、増 殖 や 未 分 化 状 態 維 持 に 対 す る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て 述 べ る 。第 2 章 で は 、浮 遊 培 養 に よ り 得 ら れ た 細 胞 コ ロ ニ ー に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る 効 果 が あ る か ど う か に つ い て 検 討 し た 結 果 を 述 べ る 。 第 3 章 で は 、 神 経 細 胞 の 分 化 、 生 存 や 増 殖 に 関 わ る シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に つ い て 、 タ ン パ ク 質 の リ ン 酸 化 量 の 測 定 及 び 各 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 阻 害 剤 に よ る 標 的 タ ン パ ク 質 の 働 き を 阻 害 す る 方 法 を 用 い て 、ES 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 対 す る ROCK 阻 害 剤 の 作 用 機 作 に つ い て 検 討 し た 結 果 を 述 べ る 。 参 考 文 献

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[5] K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T. Ichisaka, K. Tomoda, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell 131 (2007) 861-872.

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第 １ 章 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細 胞 増 殖 に 及 ぼ す 影 響 第 1 節 緒 言

マ ウ ス 胚 性 幹 （ ES） 細 胞 は 受 精 後 3.5 日 目 の 胚 盤 胞 の 内 部 細 胞 塊 由 来 の 細 胞 で あ り 、 自 己 複 製 能 、 多 分 化 能 、 キ メ ラ 形 成 能 と い っ た 特 徴 が あ る [1、2]。さ ら に 、マ ウ ス 人 工 多 能 性 幹（ iPS）細 胞 は マ ウ ス 胚 繊 維 芽 細 胞 に 4 つ の 遺 伝 子 （Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc） を 導 入 す る こ と で 樹 立 さ れ 、ES 細 胞 に 類 似 し た 特 徴 を 保 持 し て い る 細 胞 で あ る [3]。 こ れ ら ES 細 胞 と iPS 細 胞 を 用 い て 、創 薬 や 再 生 医 療 分 野 に お い て 広 く 応 用 研 究 が 行 わ れ て い る 。

Watanabe ら は Rho キ ナ ー ゼ (ROCK)阻 害 剤 の １ つ で あ る Y-27632 が 、 ヒ ト ES 細 胞 の 分 散 に よ り 誘 導 さ れ る ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と を 報 告 し た [4]。Ohgushi ら は 分 散 に よ り 起 こ る ア ポ ト ー シ ス の 分 子 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に し た [5、6]。 こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と に よ っ て 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 を 促 進 で き る の で は な い か と 推 測 し た 。さ ら に ROCK 阻 害 剤 に は 、 リ プ ロ グ ラ ミ ン グ 効 率 の 向 上 [7、 8]、 セ ル ソ ー テ ィ ン グ 後 の 細 胞 生 存 率 の 改 善 [9]や 凍 結 保 存 し た 際 の 細 胞 生 存 率 の 改 善 [10-12]な ど が 報 告 さ れ た 。 こ れ ら の 報 告 よ り ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 培 養 に ROCK 阻 害 剤 の 添 加 が 有 効 で あ る こ と が 示 唆 さ れ る 。ま た ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に は 、 ア ク チ ン 細 胞 骨 格 の 制 御 や 、 様 々 な 神 経 機 能 に 寄 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る [13、 14]。 そ こ で ROCK 活 性 を 抑 制 す る こ と に よ り 、in vitro に お い て ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 で き る 可 能 性 が あ り 、新 規 の 分 化 促 進 剤 と し て 役 立 つ の で は な い か と 考 え た 。

未 分 化 状 態 で 増 殖 で き る か ど う か に つ い て 検 討 し 、ROCK 阻 害 剤 を 一 定 の 濃 度 で 添 加 す る こ と で 細 胞 増 殖 を 促 進 で き る こ と を 見 出 し た 結 果 に つ い て 述 べ る 。 第 2 節 実 験 方 法 1.2.1 培 地 等 の 調 製 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 ゼ ラ チ ン 粉 末（ 214340；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 0.1 mg を 99.9 mL の 蒸 留 水 に 溶 解 し た 後 、 オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 （ 121℃ 、5 分 間 ） し た も の を 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 と し た 。 10×リ ン 酸 緩 衝 液 （ PBS） 蒸 留 水 に 塩 化 ナ ト リ ウ ム（ NaCl；191-01665；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 80 g 、 リ ン 酸 水 素 二 ナ ト リ ウ ム ・ 12 水 和 物 （ Na2HPO4・ 12H2O ； 196-02835； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 27.5 g、 塩 化 カ リ ウ ム （ KCl； 163-03545 ； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 2 g 、 リ ン 酸 二 水 素 カ リ ウ ム （ KH2PO4；32379-00；関 東 化 学 株 式 会 社 ）を 2 g 溶 解 し た 後 、pH を 1N 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム （ NaOH ； 197-02125 ； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） 溶 液 で 7.01 に 合 わ せ 、 蒸 留 水 で 1000 mL に メ ス ア ッ プ し た 。 こ れ を オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 （ 121℃ 、 15 分 間 ） し た も の を 10×PBS と し た 。 さ ら に 、 10×PBS を 蒸 留 水 で 10 倍 希 釈 し 、オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌（ 121℃ 、5 分 間 ） し た も の を プ レ ー ト の 洗 浄 に 用 い た 。

フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地

Dulbecco’ s modified Eagle medium（ DMEM；SLM-220-B；Millipore） に 15% fetal bovine serum（ FBS；16140-063；GIBCO BRL）、1％ nucleosides （ ES-008-D ； Millipore ）、 1 ％ non-essential amino acid （ NEAA ； TMS-001-C ； Millipore ）、 0.1 mM 2-mercaptoethanol （ ES-007-E ； Millipore ）、 1 ％ L-glutamine （ TMS-0020C ； Millipore ）、 1 ％ penicillin-streptomycin（ 15140； GIBCO BRL）を 添 加 し て フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 と し た 。

LIF 入 り の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 ： 以 下 ES 細 胞 用 増 殖 培 地 と 記 述

Dulbecco’ s modified Eagle medium に 15% knockout serum replacement （ KSR ； 10828-028 ； GIBCO BRL ）、 1 ％ L-glutamine 、 1 ％ nucleosides、0.1 mM 2-mercaptoethanol、1％ non-essential amino acid、 1％ penicillin-streptomycin、 1000 U/mL leukemia inhibitory factor （ LIF；125-05603；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 添 加 し て ES 細 胞 用 増 殖 培 地 と し た 。 KSR に は フ ィ ー ダ ー 細 胞 が 培 養 プ レ ー ト に 接 着 す る の を 阻 害 す る 働 き が あ る た め 、フ ィ ー ダ ー 細 胞 の 培 養 時 に は 用 い な か っ た 。 LIF 入 り の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 ： 以 下 iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 と 記 述

Dulbecco’ s modified Eagle medium に 15% fetal bovine serum、 1％ L-glutamine、0.1 mM 2-mercaptoethanol、1％ non-essential amino acid、 1％ penicillin-streptomycin、 1000 U/mL leukemia inhibitory factor を 添 加 し て iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 と し た 。

ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ （ AP） 染 色 用 試 薬

Alkaline Phosphatase Detection kit （ SCR0004； Millipore ） に 含 ま れ る Fast Red Violet solution と Naphthol Phosphate solution 及 び 滅 菌 水 を 直 前 に 2:1:1 の 割 合 で 混 合 し て 使 用 し た 。 AP 染 色 の 際 の 洗 浄 に は 1×rinse buffer を 使 用 し た 。 調 製 方 法 を 以 下 に 示 す 。 1×rince buffer 蒸 留 水 に 2- ア ミ ノ -2- ヒ ド ロ キ シ メ チ ル -1,3- プ ロ パ ン ジ オ ー ル （ Tris, 013-16385； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 242.28 mg、 塩 化 ナ ト リ ウ ム （ NaCl； 191-01665； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 876.6 mg 溶 解 し た 後 、 塩 酸 （ HCl； 080-01066； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） で pH を 7.4 に 合 わ せ 、 Tween20（ 103168； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 0.05 mL は か り と り 溶 解 し た 。そ の 後 、蒸 留 水 で 100 mL に メ ス ア ッ プ し 、オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 （ 121℃ 、 15 分 間 ） し た も の を 1×rinse buffer と し た 。 1.2.2 培 養 プ レ ー ト の 調 製 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 を 100 mmφ 組 織 培 養 デ ィ ッ シ ュ（ 430167；Corning, NY, USA） に は 5 mL ま た は 60 mmφ 組 織 培 養 デ ィ ッ シ ュ （ 353002； BD Falcon） に は 2 mL、 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト （ 3860-096； Iwaki） に は 各 ウ ェ ル 50 µL 添 加 し て 、 室 温 で 1 時 間 以 上 静 置 し た 。 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 を 除 去 し た 後 、 等 量 の PBS で 1 回 洗 浄 し 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ と し た 。

1.2.3 フ ィ ー ダ ー 細 胞 の 培 養 液 体 窒 素 中 に 保 存 し た フ ィ ー ダ ー 細 胞 （ R-PMEF-H； 初 代 マ ウ ス 胚 繊 維 芽 細 胞 、ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 、マ イ ト マ イ シ ン 処 理 済 み；Millipore） を 取 り 出 し 、 37℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス で 急 速 に 融 解 さ せ た 。 融 解 し た フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 5×106 _{cells 取 り 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 を 9 mL 入} れ た 15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ （ 1332-015S； Watoson） に 入 れ て 、 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 懸 濁 し た 。 1000 rpm で 5 分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 液 を 除 去 し た 後 、フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 を 1 mL 加 え 、軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 分 散 さ せ た 。 9 mL の フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 を 入 れ た ゼ ラ チ ン コ ー ト 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し 、 37℃ 、 5％ CO２条 件 で 24 時 間 培 養 し た 。培 養 後 、フ ィ ー ダ ー 細 胞 の デ ィ ッ シ ュ 底 へ の 接 着 を 確 認 し 、全 量 培 地 を 交 換 し た 。以 後 、3 日 間 毎 に 培 地 交 換 す る こ と で 1 週 間 程 度 フ ィ ー ダ ー 細 胞 の 活 性 を 維 持 で き た 。 1.2.4 マ ウ ス ES 細 胞 の 増 殖 培 養 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ の 培 地 を 、 9 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 に 交 換 し た 。 液 体 窒 素 に 保 存 し た 未 分 化 マ ウ ス ES 細 胞（ R-CMTI-1A；129SV；継 代 数 11-12、Millipore）を 取 り 出 し 、37℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス 中 で 急 速 に 融 解 さ せ た 。融 解 し た ES 細 胞 を 2.0×106 cells 取 り 、 2 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 入 れ た 15 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し 、 1 分 間 静 置 し た 。そ の 後 、 2 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 添 加 し て 1 分 間 静 置 し 、 さ ら に 、 4 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 添 加 し て 1 分 間 静 置 し た 。 ES 細 胞 懸 濁 液 を 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 接 着 培 養 プ レ ー ト に

播 種 し 、 37℃ 、 5% CO２条 件 で 培 養 し た 。 毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、 細 胞 の 継 代 培 養 を 3-4 日 間 毎 に 行 っ た 。 1.2.5 マ ウ ス ES 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存 培 養 3-4 日 目 の 対 数 増 殖 期 に あ る ES 細 胞 培 養 中 の 培 地 を 除 去 し 、PBS を 5 mL 添 加 し て ES 細 胞 を 洗 浄 し た 。 ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 （ SM-2003-C； Millipore） を 2 mL 添 加 し て 室 温 で 30 秒 間 反 応 さ せ た 後 、 ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 を 除 去 し た 。 2 分 間 静 置 し て ES 細 胞 の 剥 離 を 確 認 し 、ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 5 mL 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、 ES 細 胞 を 脱 離 さ せ た 。 15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 懸 濁 液 を 回 収 し 、 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 添 加 し 、 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 ト リ パ ン ブ ル ー 溶 液 （ 使 用 前 に 0.2%ト リ パ ン ブ ル ー ： 4.25% NaCl＝ 4： 1 と な る よ う に 調 製 し た ）で ES 細 胞 を 染 色 し 、 血 球 計 数 盤 （ B0746; サ ン リ ー ド 硝 子 有 限 会 社 、 埼 玉 ）を 用 い て 1 µL 中 に 含 ま れ る 細 胞 数 に 希 釈 倍 率 を か け 、そ こ に 全 液 量 を か け て 計 数 し た 。 そ の と き の 計 算 式 を 以 下 に 示 す 。 生 細 胞 数 ＝ （ 4 区 画 の 生 細 胞 数 の 合 計 ÷4×10×2） ×全 液 量 （ µL） 継 代 培 養 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 計 数 し た 後 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 接 着 さ せ た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 0.5×106 _{cells/10 mL に な る よ う に 播 種 し 37℃ 、 5％ CO} 2 条 件 で 培 養 し た 。毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、継 代 培 養 を 3－ 4 日 毎 に 行 っ

た 。 凍 結 保 存 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 、 ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 2×106 _{cells に 調 整 し た 細 胞} 懸 濁 液 と 凍 結 保 存 培 地（ ES-0002-D；Millipore）を 1：1 と な る よ う に 混 合 し 、セ ラ ム チ ュ ー ブ（ 2732-002；Iwaki）に 加 え た 。4℃ で 5 分 間 、 － 20℃ で 30 分 間 、 － 80℃ で 24 時 間 そ れ ぞ れ 静 置 し た 後 、 液 体 窒 素 容 器 内 に 保 存 し た 。 1.2.6 マ ウ ス iPS 細 胞 の 増 殖 培 養 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ の 培 地 を 、 9 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 に 交 換 し た 。液 体 窒 素 に 保 存 し た 未 分 化 マ ウ ス iPS 細 胞 （ iPS-MEF-Ng-20D-17； APS0001； 継 代 数 14、 RIKEN Cell Bank） を 取 り 出 し 、 37℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス 中 で 急 速 に 融 解 さ せ た 。 融 解 し た iPS 細 胞 を 1.0×106 _{cells 取 り 、 5 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 入 れ た}

15 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 入 れ た 。そ の 後 、iPS 細 胞 懸 濁 液 を 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 1000 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 5 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 再 度 1000 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 接 着 さ せ た 培 養 プ レ ー ト に 播 種 し 、 37℃ 、 5% CO２条 件 で 培 養 し た 。 毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、 細 胞 の 継 代 培 養 を 3-4 日 間 毎 に 行 っ た 。

1.2.7 マ ウ ス iPS 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存 培 養 3-4 日 目 の 対 数 増 殖 期 に あ る iPS 細 胞 の 培 地 を 除 去 し 、PBS を 5 mL 添 加 し て iPS 細 胞 を 洗 浄 し た 。ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 を 2 mL 添 加 し て 37℃ で 10 分 間 反 応 さ せ た 後 、 iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 4 mL 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 懸 濁 液 を 回 収 し た 。 培 養 に 使 用 し た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 再 度 4 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 、 15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 懸 濁 液 を 回 収 し た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 2 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し 、 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 ト リ パ ン ブ ル ー 溶 液 で iPS 細 胞 を 染 色 し 、血 球 計 数 盤 を 用 い て 細 胞 数 を 計 数 し た 。 継 代 培 養 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 2 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 、 ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 計 数 し た 後 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 接 着 さ せ た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 1×106 _{cells/10 mL に な る よ う に} 播 種 し 37℃ 、5％ CO2条 件 で 培 養 し た 。毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 継 代 培 養 を 3－ 4 日 毎 に 行 っ た 。 凍 結 保 存 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 2 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 1×106 _{cells に 調 整 し た 細 胞 懸 濁 液 と 、 凍 結 保 存 培 地} （ DMSO（ 041-29351；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）：iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 ＝ 1： 4）を 1：1 と な る よ う に 混 合 し 、セ ラ ム チ ュ ー ブ に 加 え た 。4℃ で 5 分 間 、 － 20℃ で 30 分 間 、 － 80℃ で 24 時 間 そ れ ぞ れ 静 置 し た 後 、 液 体 窒 素 容 器 内 に 保 存 し た 。

1.2.8 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 未 分 化 状 態 の 確 認 ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 未 分 化 状 態 で は 細 胞 膜 ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ を 高 レ ベ ル で 発 現 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 未 分 化 状 態 を 維 持 す る た め に LIF を 含 む 培 地 で 培 養 す る が 、 未 分 化 の 状 態 を 維 持 し て い る か 、ま た ROCK 阻 害 剤 の 添 加 に よ り 未 分 化 状 態 の 維 持 に 影 響 が な い か を 調 べ る た め 、 AP 染 色 を 次 の よ う に 行 っ た 。 3-4 日 間 培 養 し た 各 細 胞 の 培 地 を 全 て 除 去 し 、 PBS で 洗 浄 後 、 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液（ 163-20145；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 添 加 し て 1-2 分 間 静 置 す る こ と で 細 胞 を 固 定 し た 。 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液 を 除 去 し 、 1×rince buffer で 洗 浄 し た 。 遮 光 下 で AP 染 色 用 試 薬 を 細 胞 が 浸 漬 さ れ る ま で 添 加 し 、 室 温 で 15 分 間 静 置 し た 。 AP 染 色 用 試 薬 を 除 去 し 、 乾 燥 を 避 け る た め に PBS に 細 胞 を 浸 漬 し 、 倒 立 顕 微 鏡 下 で AP 染 色 に よ り 赤 く 染 色 さ れ て い る か ど う か を 観 察 し た 。 1.2.9 ROCK 阻 害 剤 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細 胞 増 殖 へ の 影 響 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 特 徴 の 1 つ と し て 、半 永 久 的 に 増 殖 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が あ る 。ROCK 阻 害 剤 の 添 加 に よ り 細 胞 増 殖 に 影 響 が な い か を 調 べ る た め に 、ト リ パ ン ブ ル ー 染 色 を し て 生 細 胞 数 を 計 数 し た 。 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト に 500 cells/well と な る よ う に ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 播 種 し 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 37℃ 、 5% CO2 条 件 で 培 養 し た 。 毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、 培 養 2、 4、 6 日 間 毎 に ト リ パ ン ブ ル ー 染 色 を 行 い 、 生 細 胞 数 を 計 数 し た 。

第 3 節 実 験 結 果 1.3.1 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 未 分 化 状 態 を 維 持 し な が ら 、半 永 久 的 に 増 殖 す る こ と が 可 能 で あ る 。 し か し 、 継 代 培 養 を 繰 り 返 す う ち に 性 質 が 変 化 し た 細 胞 が 現 れ る 可 能 性 が あ る た め 、 性 状 が 変 化 し て い な い こ と が 確 認 さ れ て い る 細 胞 を 使 用 す る 必 要 が あ る 。そ こ で ES 細 胞 の 場 合 に は 継 代 数 16-20、iPS 細 胞 の 場 合 に は 継 代 数 15-17 の 細 胞 を 実 験 に 使 用 し た 。 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 接 着 さ せ た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 、ES 細 胞 ま た は iPS 細 胞 を 播 種 し て 3 日 間 培 養 し た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た 結 果 を Fig.1-1（ A）（ B）及 び Fig.1-2（ A）（ B）に 示 す 。ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 上 に コ ロ ニ ー を 形 成 し な が ら 増 殖 し て い た 。 ま た 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し た 細 胞 は 写 真 の よ う に 輪 郭 が は っ き り と し て お り 、コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 明 確 に 区 別 で き ず 、AP 染 色 で 赤 く 染 ま っ た 。し か し 、Fig.1-1（ C）及 び Fig.1-2（ C）に 示 す よ う に 、 分 化 を 始 め た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 は 赤 く 染 ま ら ず 、か つ コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 区 別 で き る よ う に な っ た 。 そ の た め 、 顕 微 鏡 で 観 察 し 、 コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 区 別 で き る デ ィ ッ シ ュ は 実 験 に 用 い な か っ た 。 1.3.2 ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 へ の 影 響 未 分 化 状 態 を 維 持 し た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 に お け る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 ROCK 阻 害 剤 を 0-100 µM の 濃 度 で 培 地 に 添 加 し 、 37℃ 、 5% CO₂条 件 で 3 日 間 培 養 後 、 AP 染 色 に よ り 未 分 化 状 態 が 維 持 さ れ て い る か ど う か を 検 討 し た 結 果 を Fig.1-3 及 び Fig.1-4 に 示 す 。0-20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 、AP 染 色 に よ り 赤 く 染 ま り 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し て い た 。 一 方 、 50-100 µM の ROCK 阻 害 剤 を

添 加 し た 場 合 、コ ロ ニ ー の 形 状 が 崩 れ 、 AP 染 色 に よ り 赤 く 染 ま ら な か っ た 。

ROCK 阻 害 剤 を 0-40 µM の 濃 度 で 培 地 に 添 加 し 、 2-6 日 間 培 養 し た 。 培 養 後 ト リ パ ン ブ ル ー 染 色 を 行 い 、 血 球 計 算 盤 を 用 い て 生 細 胞 数 を 計 数 し た 結 果 を Fig.1-5 及 び Fig.1-6 に 示 す 。 ES 細 胞 、 iPS 細 胞 と も に 培 養 2 日 か ら 6 日 と 培 養 す る と 細 胞 数 が 増 加 し た 。ま た 、ROCK 阻 害 剤 を 10 µM の 濃 度 で 添 加 し た 場 合 に ES 細 胞 と iPS 細 胞 と も に 増 殖 し た 細 胞 数 が 最 も 多 く な っ た 。 第 4 節 考 察 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 に 対 す る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 を 検 討 し た 。 5-20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し て い た （ Fig.1-3 及 び Fig.1-4 ）。 細 胞 数 を 計 数 し た 結 果 （ Fig.1-5 及 び Fig.1-6）、 10 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に お い て 生 細 胞 数 を 大 き く 増 加 さ せ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 は ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 増 殖 を 促 進 さ せ た 。Watanabe ら は 、ROCK 阻 害 剤 が 接 着 培 養 に お い て 、 分 散 し た ヒ ト ES 細 胞 の 生 存 を 可 能 に す る こ と を 報 告 し た [4] 。 Koyanagi ら は 、 Rho/ROCK 経 路 の 抑 制 が マ ウ ス ES 細 胞 由 来 の 神 経 前 駆 細 胞 の 生 存 を 増 強 す る こ と を 報 告 し た [15]。こ れ ら の 報 告 は ROCK 阻 害 剤 が 様 々 な 細 胞 種 の ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と で 生 存 を 可 能 に す る こ と を 示 し て い る 。 ま た 、 Kitajima ら 及 び Pakzad ら は 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト や フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン と い っ た 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス に お け る ヒ ト 多 能 性 幹 細 胞 の 接 着 の 増 強 を 報 告 し た [16、 17]。 こ れ ら の 報 告 及 び 我 々 の 研 究 結 果 か ら 、ROCK 阻 害 剤 は ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し 、細 胞 接 着 を 増 強 す る こ と に よ り 増 殖 を 促 進 し て い る と 考 え ら れ る 。

第 5 節 結 言 本 研 究 に お い て 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 培 養 し た 結 果 、培 地 に ROCK 阻 害 剤 を 0-20 µM の 濃 度 で 添 加 し た 場 合 、未 分 化 を 維 持 し た ま ま 培 養 す る こ と が で き る が 、 そ れ 以 上 の 濃 度 で 添 加 す る と コ ロ ニ ー の 形 状 が 崩 れ 、 未 分 化 の 状 態 を 維 持 で き な い こ と が 分 か っ た 。 さ ら に 、 10 µM の ROCK 阻 害 剤 を 培 地 に 添 加 し て 培 養 す る こ と で 、 細 胞 の 増 殖 が 促 進 さ れ る こ と を 明 ら か に し た 。 以 上 の 結 果 、ROCK 阻 害 剤 に は 細 胞 増 殖 を 促 進 さ せ る 効 果 が あ る こ と が 示 さ れ た 。次 章 で は 、分 化 促 進 剤 と し て ROCK 阻 害 剤 を 用 い て 分 化 培 養 を 行 い 、ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 や 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 結 果 に つ い て 述 べ る 。 第 6 節 参 考 文 献

[1] M.J. Evans, M.H. Kaufman, Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos, Nature 292 (1981) 154 – 156.

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Y. Sasai, A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells, Nature Biotechnology 25 (2007) 681–686. [5] M. Ohgushi, M. Matsumura, M. Eiraku, K. Murakami, T.Aramaki, A. Nishiyama, K. Muguruma, T. Nakano, H. Suga, M. Ueno, T. Ishizaki, H. Suemori, S. Narumiya, H. Niwa, Y. Sasai , Molecular pathway and Cell State Responsible for dissociation -induced apoptosis in human pluripotent stem cells, Cell Stem Cell 7 (2010) 225 -239. [6] M. Ohgushi, Y. Sasai, Lonely death dance of human pluripotent stem cells: ROCKing between metastable cell states, Trends in Cell Biology 21 (2011) 274-282.

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Fig.1-1 Optical micrographs of ES cells

Scale bar: 100 µm

(A) Control

(B) AP staining

(A) Control

(B) AP staining

(C) AP staining

Fig.1-2 Optical micrographs of iPS cells

Scale bar: 100 µm

0 μM

5 μM

10 μM

50 μM

100 μM

20 μM

Fig.1-3 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation of

undifferentiated ES cell colonies

Scale bar: 100 µm

0 μM

5 μM

10 μM

50 μM

100 μM

20 μM

Fig.1-4 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation of

undifferentiated iPS cell colonies

Scale bar: 100 µm

0

5

10

15

20

25

0

5

10 15 20 25 30 35 40

Nu

m

ber

of

cell

s

(×

10

4

)

ROCK inhibitor concentration (µM)

2 d of culture

4 d of culture

6 d of culture

Fig.1-5 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation

of ES cells

0

10

20

40

60

80

30

50

70

Nu

m

ber

of

cell

s

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10

4

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0

5

10

15

20

25

30

ROCK inhibitor concentration (µM)

2 d of culture

4 d of culture

6 d of culture

Fig.1-6 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation

of iPS cells

第 2 章 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 第 1 節 緒 言 第 1 章 で は 、増 殖 培 養 時 に 低 濃 度 の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ り 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し た ま ま 効 率 良 く 増 殖 さ せ る こ と が で き る こ と を 明 ら か に し た 。本 研 究 で 用 い た ROCK 阻 害 剤 Y-27632 は 、最 初 に 血 管 平 滑 筋 弛 緩 薬 と し て 合 成 さ れ た 化 合 物 で あ る [1]。そ の 後 の 研 究 に よ り 、 細 胞 遊 走 、 ア ク チ ン 細 胞 骨 格 や ア ポ ト ー シ ス な ど 様 々 な 細 胞 機 能 に 関 わ っ て い る こ と が 報 告 さ れ た [2、 3]。 ま た 、 高 血 圧 の モ デ ル ラ ッ ト に お い て 血 圧 を 下 げ る 効 果 が あ る こ と や 、 血 管 攣 縮 に 関 連 す る く も 膜 下 出 血 に 対 す る 有 効 性 な ど も 報 告 さ れ て い る [4、 5]。 さ ら に Fasudil と い う ROCK 阻 害 剤 は 、眼 圧 を 下 げ る こ と で 緑 内 障 の 治 療 薬 と し て 使 わ れ て い る 。こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 は 人 体 に 適 用 し や す い と 考 え ら れ 、分 化 促 進 剤 と し て ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 を 促 進 さ せ る 効 果 が あ っ た 場 合 、 再 生 医 療 分 野 、 と く に 神 経 再 生 や 移 植 治 療 な ど に 用 い る 細 胞 を 作 成 す る 際 に 利 用 で き る 可 能 性 が 期 待 で き る 。

Hirose ら 及 び Bito ら は 、 神 経 芽 細 胞 種 N1E-115 細 胞 や 中 枢 神 経 系 の 神 経 細 胞 に お い て Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 軸 索 の 退 縮 に 関 わ っ て お り 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で そ の 作 用 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た [6、7]。こ れ ら の 報 告 か ら 、 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る 。 本 章 に お い て 、分 化 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ る 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し 、ROCK 阻 害 剤 が 神 経 細 胞 と 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る 効 果 を 有 す る こ と を 見 出 し た

結 果 に つ い て 述 べ る 。 第 2 節 実 験 方 法 2.2.1 培 地 等 の 調 製 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 第 1 章 1.2.1 に 記 述 し た よ う に 調 製 し た 。 分 化 用 培 地

49% Dulbecco’ s modified Eagle medium に 49% F-12K nutrient mixture（ 21127-022；GIBCO BRL）、1% N-2 supplement（ 17502-048; GIBCO BRL）、 1% penicillin-streptomycin を 添 加 し て 分 化 用 培 地 と し た 。 2.2.2 培 養 プ レ ー ト の 調 製 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 を 用 い て 、 第 1 章 1.2.2 項 に 記 述 し た よ う に ゼ ラ チ ン コ ー ト 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト を 調 製 し た 。 2.2.3 マ ウ ス ES 細 胞 の 浮 遊 培 養 第 1 章 に 記 述 し た よ う に 、ES 細 胞 を フ ィ ー ダ ー 細 胞 上 で 3-4 日 間 培 養 し 、 継 代 培 養 を 行 っ た 。 細 胞 数 を 計 数 後 、 ES 細 胞 （ 5×105 _cells） を 非 接 着 性 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ （ AU3100； 栄 研 化 学 株 式 会 社 ） に 播 種 し 、ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 加 え て 全 量 を 10 mL に し た も の を 37℃ 、5% CO2 条 件 で 8-9 日 間 培 養 し た 。3 日 毎 に 半 分 量 の 培 地 を 交 換 し 、直 径 200 µm の ES 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 。 浮 遊 培 養 の 際 に 、 播 種 す る 細 胞 数 が 多 す ぎ る と コ ロ ニ ー 同 士 が 接 着 し て 直 径 が 大 き な コ ロ ニ ー が 多 数 形 成 さ れ 、 細 胞 数 が 少 な す ぎ る と 長

期 培 養 し て も コ ロ ニ ー が 殆 ど 形 成 さ れ な い 。 2.2.4 マ ウ ス iPS 細 胞 の 浮 遊 培 養 2.2.3 項 に 記 述 し た ES 細 胞 の 場 合 と 同 様 に 、浮 遊 培 養 に よ り 直 径 200 µm の iPS 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 。な お 、培 養 期 間 を 6-7 日 間 と し 、 3 日 毎 に 半 分 量 の 培 地 を 交 換 し た 。 2.2.5 浮 遊 培 養 で 形 成 さ れ た 細 胞 コ ロ ニ ー の 未 分 化 状 態 の 確 認 直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 し な が ら ピ ペ ッ ト マ ン を 用 い て 採 取 し 、2 mL の PBS を 入 れ た 35 mmφ デ ィ ッ シ ュ（ 430165； CORNING） に 入 れ て 洗 浄 し た 。 PBS を 除 去 し 、 1.2.8 項 で 記 述 し た よ う に AP 染 色 を 行 い 、浮 遊 培 養 に よ り 形 成 さ れ た 細 胞 コ ロ ニ ー が 未 分 化 状 態 を 維 持 し て い る か ど う か を 調 べ た 。 2.2.6 細 胞 コ ロ ニ ー の 分 化 培 養 ES 細 胞 、iPS 細 胞 と も に 浮 遊 培 養 す る こ と で 得 ら れ た 直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 、 実 体 顕 微 鏡 下 で ピ ペ ッ ト マ ン を 用 い て 採 取 し 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト の 1 ウ ェ ル あ た り 1 個 の コ ロ ニ ー を 播 種 し た 。 培 養 開 始 時 に 、 分 化 用 培 地 に ROCK 阻 害 剤 ま た は ROCK 阻 害 剤 と 10 ng/mL の 神 経 成 長 因 子 （ Recombinant Human β -NGF ： 256-GF-100/CF； R&D Systems, Inc.） を 添 加 し て 、 37℃ 、 5% CO2 条 件

で 12 日 間 培 養 し た 。3 日 毎 に 半 分 量 の 培 地 を 交 換 し た 。ROCK 阻 害 剤 の 添 加 濃 度 の 検 討 に は 、分 化 用 培 地 に ROCK 阻 害 剤 を 0、5、10、20、50 µM に な る よ う に 添 加 し て 培 養 し た 。

2.2.7 免 疫 蛍 光 染 色 法 細 胞 を 分 化 培 養 し た 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト の 各 ウ ェ ル か ら 培 地 を 少 し 残 し て 除 去 し 、 細 胞 を 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド・リ ン 酸 緩 衝 液 を 用 い て 、室 温 で 30 分 間 反 応 さ せ て 固 定 し た 。 冷 PBS で 3 回 洗 浄 後 、細 胞 を 99.8%の 冷 メ タ ノ ー ル （ 131-01826； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 用 い て － 80℃ で 15 分 間 処 理 し た 。冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 5% bovine serum albumin（ BSA； 019-21272； Wako） を 含 む 0.5% Ttiton X-100 溶 液 で ブ ロ ッ キ ン グ し た 。 1 次 抗 体 を サ ン プ ル に 加 え 、 4℃ で 一 晩 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 1 次 抗 体 に は 、 250 倍 希 釈 し た 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 β Ⅲ -tubulin 抗 体 （ MAB1637 ； Millipore）、 500 倍 希 釈 し た 運 動 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 Lim-3 抗 体 （ AB3202； Millipore）、 500 倍 希 釈 し た 感 覚 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 Brn-3 抗 体（ sc-6026；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）、 500 倍 希 釈 し た 筋 肉 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 α -actinin 抗 体 （ sc-7453； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ）、 250 倍 希 釈 し た 平 滑 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る 抗 α -smooth muscle 抗 体 （ A5228； Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ）、 250 倍 希 釈 し た 心 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る 抗 cardiac troponin I 抗 体 （ ab47003 ； Abcam, Cambridge, UK）、 250 倍 希 釈 し た 骨 格 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る 抗 actin-α -1 抗 体 （ C0121； Assay Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA ） を 使 用 し た 。 1 次 抗 体 を 除 去 し 、 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 Alexa Fluor 488-labeled 2 次 抗 体（ A-11005 or A-11008；Molecular Probes, Eugene, OR, USA） を 用 い て 、 振 盪 し な が ら 室 温 で 30 分 間 蛍 光 標 識 し た 。 2 次 抗 体 を 除 去 し 、 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー （ FLA-3000GF; 富 士 フ ィ ル ム 株 式 会 社 、 東 京 ） を 用 い て パ ソ コ

ン に 蛍 光 イ メ ー ジ を 取 り 込 み 、 画 像 解 析 ソ フ ト に よ り 蛍 光 強 度 を 解 析 し 、 各 細 胞 へ の 分 化 率 を 求 め た 。 2.2.8 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ る 陽 性 細 胞 数 の 計 数 分 化 培 養 し た 細 胞 を 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 を 添 加 し て 室 温 で 2 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 血 清 入 り の 培 地 を 添 加 し て ト リ プ シ ン /EDTA の 働 き を 止 め た 。15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 を 移 し 、 800 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 。 冷 PBS で 細 胞 を 洗 浄 し 、 1.5 mL エ ッ ペ ン チ ュ ー ブ に 細 胞 を 移 し た 。 ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 細 胞 コ ロ ニ ー を 分 散 さ せ 、 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液 を 用 い て 、 室 温 で 30 分 間 反 応 さ せ て 固 定 し た 。 1200 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、 冷 PBS で 洗 浄 し た 。 1200 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、 細 胞 を 99.8% の 冷 メ タ ノ ー ル を 用 い て － 80℃ で 15 分 間 処 理 し た 。 1200 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、冷 PBS で 洗 浄 し た 。1 次 抗 体 を 加 え 4℃ で 一 晩 反 応 さ せ た 。冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、2 次 抗 体 を 加 え 室 温 で 30 分 間 蛍 光 標 識 し た 。 冷 PBS で 4 回 洗 浄 後 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー （ JSAN ； Bay Bio-science, Kobe, Japan） を 用 い て 陽 性 細 胞 数 を 計 数 し た 。

2.2.9 統 計 分 析

測 定 値 を 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。 各 デ ー タ を 多 重 比 較 法 の 一 次 元 配 置 分 散 分 析 （ one-way ANOVA） に お け る Tukey-Kramer test を 用 い て 検 定 し 、 p<0.05 の と き 統 計 学 的 に 有 意 で あ る と 判 断 し た 。

第 3 節 実 験 結 果 2.3.1 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の 未 分 化 状 態 の 確 認 5×105 cells の 未 分 化 マ ウ ス ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 、非 接 着 性 100 mm φ デ ィ ッ シ ュ に 増 殖 用 培 地 を 用 い て 浮 遊 培 養 し 、直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 。浮 遊 培 養 中 の デ ィ ッ シ ュ に は 、直 径 400 µm 以 上 の も の 、 コ ロ ニ ー 同 士 が 接 着 し て い る も の や コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 詰 ま っ て い な い も の が 混 在 し て い た 。 以 前 の 研 究 で 、 コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 詰 ま っ て い な い も の は 分 化 能 が 悪 く 、直 径 が 400 µm 以 上 の も の は 分 化 を 始 め て い る コ ロ ニ ー で あ る 可 能 性 が あ る こ と が 明 ら か に な っ て い る [8]。 そ こ で 本 研 究 に は 直 径 200 µm で 、 か つ コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 詰 ま っ て い る コ ロ ニ ー を 用 い た 。Fig.2-1（ 1）及 び（ 2）に 示 す 直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー は AP 染 色 に よ り 赤 く 染 ま っ て い た こ と か ら 、未 分 化 状 態 を 維 持 で き て い た 。 分 化 培 養 す る 際 に 一 部 の 細 胞 コ ロ ニ ー を AP 染 色 し 、未 分 化 状 態 を 維 持 し て い る か ど う か を 確 認 し て か ら 使 用 し た 。 2.3.2 ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。浮 遊 培 養 を 行 い 、直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 後 、96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト に 播 種 し た 。ROCK 阻 害 剤 ま た は ROCK 阻 害 剤 と NGF（ 10 ng/mL） を 同 時 に 添 加 し て 12 日 間 分 化 培 養 し 、 フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー を 用 い て 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る β Ⅲ -tubulin の 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。ES 細 胞 の 結 果 を Fig.2-2（ A） に 、 iPS 細 胞 の 結 果 を Fig.2-3 に 示 す 。 ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た ES 細 胞 と iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の 蛍 光 強 度 を 100％ と し た 。ROCK

阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 は 、 無 添 加 の 場 合 の 蛍 光 強 度 よ り 高 い と い う 結 果 が 得 ら れ た 。さ ら に 、ROCK 阻 害 剤 と 同 時 に NGF を 添 加 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 は 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 よ り 高 く 、 神 経 細 胞 へ の 分 化 促 進 効 果 が 増 大 し た 。ES 細 胞 、iPS 細 胞 と も に 20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に 最 も 神 経 細 胞 へ の 分 化 が 促 進 さ れ た こ と か ら 、こ れ 以 降 の 分 化 培 養 に は 20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 用 い た 。蛍 光 顕 微 鏡 を 用 い て ES 細 胞 由 来 の 神 経 細 胞 を 観 察 し た 結 果 を Fig.2-2（ B） に 示 す 。コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 神 経 突 起 の 数 が 増 加 し て お り 、 NGF を 同 時 に 添 加 す る こ と で さ ら に 増 加 し た 。 ROCK 阻 害 剤 の 分 化 促 進 効 果 が 、ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し た こ と で 、生 細 胞 数 が 増 加 し た 結 果 に よ る も の か ど う か に つ い て 検 討 し た 。ROCK 阻 害 剤 ま た は ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し て 12 日 間 分 化 培 養 を 行 い 、生 細 胞 数 を 計 数 し た 結 果 を Fig.2-4 に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 と も に 、コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し て 細 胞 数 に 大 き な 差 は 見 ら れ な か っ た 。 こ れ よ り 、ROCK 阻 害 剤 は 生 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し て 、 分 化 し た 細 胞 数 を 増 加 さ せ る の で は な く 、 ROCK 阻 害 剤 に は ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る 効 果 が あ る と 考 え ら れ る 。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、ど の 程 度 の 割 合 で 神 経 細 胞 に 分 化 し て い る か に つ い て 検 討 し た 。12 日 間 分 化 培 養 を 行 っ た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 コ ロ ニ ー を 免 疫 蛍 光 染 色 し 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー を 用 い て 陽 性 細 胞 数 を 計 数 し た 。 ES 細 胞 の 結 果 を Fig.2-5 に 、 iPS 細 胞 の 結 果 を Fig.2-6 に 示 す 。 ES 細 胞 の 場 合 、 分 化 用 培 地 で 培 養 す る と 44%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。 さ ら に 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に は 61%、 ROCK

阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 に は 71%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。 こ の と き 、ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た コ ン ト ロ ー ル に 対 し て 統 計 処 理 し た と こ ろ 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に p<0.05、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 添 加 し た 場 合 に p<0.01 で 統 計 的 に 有 意 差 が あ る こ と が 示 さ れ た 。iPS 細 胞 の 場 合 、分 化 用 培 地 で 培 養 す る と 25%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に は 34%、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 に は 38%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。 こ の と き 、 ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た コ ン ト ロ ー ル に 対 し て 統 計 処 理 し た と こ ろ 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 及 び ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 と も に p<0.05 で 統 計 的 に 有 意 差 が あ る こ と が 示 さ れ た 。ま た 、フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー に よ る 蛍 光 強 度 の 結 果 と 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー に よ る 分 化 し た 神 経 細 胞 の 割 合 の 結 果 が 一 致 し た 。 2.3.3 分 化 し た 神 経 細 胞 の 種 類 の 同 定 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 が 促 進 さ れ る と い う 結 果 が 得 ら れ た こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 分 化 し た 神 経 細 胞 の 種 類 に つ い て 検 討 し た 。 以 前 の 研 究 で は 、 ES 細 胞 は 主 に 運 動 神 経 細 胞 及 び 感 覚 神 経 細 胞 に 分 化 し て い た [9]。 12 日 間 分 化 培 養 し た ES 細 胞 を 、運 動 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る Lim-3 と 感 覚 神 経 細 胞 マ ー カ ー で あ る Brn-3 で 標 識 し 、 フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー を 用 い て 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 結 果 を Fig.2-7 に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た ES 細 胞 コ ロ ニ ー の 蛍 光 強 度 を 100％ と し た 。運 動 神 経 細 胞 及 び 感 覚 神 経 細 胞 と も に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 蛍 光 強 度 が 高 く な っ た 。し か し 、 ROCK 阻 害 剤 と 同 時 に NGF を 添 加 し た 場 合 、 蛍 光 強 度 の 増 加 は 見 ら れ な か っ た 。

ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、ど の 程 度 の 割 合 で 各 神 経 細 胞 に 分 化 し て い る か に つ い て 検 討 し た 。 12 日 間 分 化 培 養 を 行 っ た ES 細 胞 コ ロ ニ ー を 免 疫 蛍 光 染 色 し 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー を 用 い て 各 種 陽 性 細 胞 数 を 計 数 し た 結 果 を Fig.2-8（ A）に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 運 動 神 経 細 胞 （ 抗 Lim-3 抗 体 に よ り 染 色 さ れ た 細 胞 ） が 28%、 感 覚 神 経 細 胞 （ 抗 Brn-3 抗 体 に よ り 染 色 さ れ た 細 胞 ） が 24%と い う 結 果 が 得 ら れ た 。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 61%が 神 経 細 胞 に 分 化 し て い た こ と か ら 、分 化 し た 神 経 細 胞 の 内 約 50%が 運 動 神 経 細 胞 、約 40%が 感 覚 神 経 細 胞 に 分 化 し て い る こ と が 明 ら か に な り 、 こ の 結 果 は フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー で 測 定 し た 蛍 光 強 度 の 結 果 と 一 致 し た 。 ま た 、 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の 結 果 を Fig.2-8（ B） に 示 す 。 蛍 光 写 真 か ら も 、 感 覚 神 経 細 胞 よ り 運 動 神 経 細 胞 に 多 く 分 化 し て い る 様 子 が 観 察 で き た 。 2.3.4 ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 こ れ ま で の 研 究 で 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 神 経 細 胞 以 外 に 筋 肉 細 胞 に も 分 化 す る こ と が 明 ら か に な っ て い る [10]。ま た 、ROCK は Rho フ ァ ミ リ ー に よ る ア ク チ ン 細 胞 骨 格 の コ ン ト ロ ー ル な ど 、 様 々 な 細 胞 応 答 に 関 わ っ て い る こ と が 明 ら か に な っ て い る [3]。こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 の 添 加 は 神 経 細 胞 以 外 に 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 も 促 進 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る 。 そ こ で 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。12 日 間 分 化 培 養 を 行 い 、 筋 肉 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 α -actinin 抗 体 で 標 識 し 、フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー を 用 い て 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。 ES 細 胞 の 結 果 を Fig.2-9（ A）に 、iPS 細 胞 の 結 果 を Fig.2-10 に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 及 び NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 を 100%と し た 。ES 細 胞 と iPS