マウス精子凍結保存の実用化に関する生殖工学的研究 - 凍結融解精子を用いた体外受精に対する透明帯部分切開術の効果 -

Title

マウス精子凍結保存の実用化に関する生殖工学的研究 - 凍

結融解精子を用いた体外受精に対する透明帯部分切開術の

効果 -( 内容の要旨 )

Author(s)

川瀬, 洋介

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 乙第065号

Issue Date

2004-09-17

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/2049

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氏名(本籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月日 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 川 瀬 洋 介(千葉県) 博士(獣医) 獣医博乙第65号 平成16年9月17日 学位規則第4条第2項該当 マウス精子凍結保存の実用化に関する生殖工学的研究 一凍結融解精子を用いた体外受精に対する透明帯部分 切開術の効果-主査 帯広畜産大学 副査 帯広畜産大学 副査 岩 手 大 学 副査 東京農工大学 副査 岐阜大学 志一善俊男 宏 陽一尚敏 木宅爪 田 田 鈴 三 橋神坪 授授授授授 教教教教教 論 文 の _内 容 の _{要 旨} 発生工学の進展に伴い､マウスの系統維持･保存に有効な技術としてマウス精子の凍結 保存が期待されている｡しかしながら､マウス精子の凍結融解後の体外受精成績には大き な系統差が観察され､とりわけ遺伝子改変マウスの作製に汎用されているC57BU6系マ ウス精子の融解後の受精率が極めて低いことが実用上大きな問題となっていた｡この間題 の解決には｢透明帯部分切開術(PZD)｣を用いた体外受精(ⅠVF)が有効であると報告 されたが､PZDを施した胚の受容雌への移植時期と移植部位には､技術的な制限が存在 していた｡また､凍結融解後の精子運動性の低下あるいは喪失を克服する方策として､｢卵 細胞質内精子注入法(ICSI)｣の応用が期待されたが､同一の近交系由来の配偶子間にお ける産子べの発生能に関する報告はなく､遺伝子改変マウスの樹立に汎用されている近交 系､特に､C57BL佑系マウスにおける技術確立が求められていた｡ 本研究では､マウス精子の凍結保存の実用化を果たし､遺伝子資源の保存や発生工学的 研究に寄与することを目的とし､凍結融解精子を用いた体外受精の受精率､ならびに胚移 植後の着床率の改善方法について検討を加えた｡その結果､卵子の透明帯を任意の長さに､ 短時間で､かつ高い生存性を維持しながら切開可能で､換作卵子の正常な発生を支持する 新規の生殖工学技術である｢ビュゾマイクロマニピュレーターによる透明帯切開術(刀P:' 2bna-pe1lucidaImiiionbyPiezo-micromamipulator)Jを開発することに成功した｡C57BU6J アクス凍結融解精子を用いた体外受精にZIPを併用すること(ZIP/IVF)■により､受精率 を大きく向上させると_ともに､ZIPを施した卵子の卵管内移植を可能とし､PZDで問題と なっていた透明帯切開胚の移植に際しての技術的適用制限を払拭することに成功した｡ a打IVF･は､不妊を呈する遺伝子改変雄マウスに対しても有効であったことから､aPは

新規の体外受精系を提供する極めて優れた生殖補助技術であると考えられた｡さらに､ C57BU6Jマウスを用いたICSIを検討した結果､世界で初めてICSI由来の近交系マウス を得ることに成功するとともに､ICSIにより得られた胚の移植後の産子への発生能は精 子側よりもむしろ卵子側の要因に依存することを明らかにした｡この成功によって､遺伝 子改変マケスの遺伝子資源保存へのICSlの応用が可能になった｡最後に､ZI打ⅠVFおよび ICSIについて､実験動物における生殖補助技術としての生産性を考慮し､凍結融解精子 からマウスを生産する際の生産効率を比較した結果､ZIP/IVFは､ICSIよりも有意に高い 生産効率を示し､換作性もより優れた技術であることが示された｡ 以上､本研究で開発されたZIPは､低運動能を呈する凍結融解精子の体外受精系におい て極めて有効な生殖補助技術であり､体外受精での生産性を向上させるばかりでなく､こ の技術の開発によりマウス精子の凍結保存が遺伝子資源の維持･保存技術として達成され たものと考える｡今後､本技術基盤を背景にして､マウス遺伝子資源の保存のためた精子 の凍結保存が広く普及し､積極的に利用されていくものと期待される｡ 審 査 結 果 の 要 旨 本研究では､マウス精子の凍結保存の実用化を果たし､遺伝子資源の保存や発生工 学的研究に寄与することを目的とし､凍結融解精子を用いた体外受精の受精率､なら びに胚移植後の着床率の改善方法について検討した｡ その結果､卵子の透明帯を任意の長さに､短時間で､かつ高レ†生存性を維持しなが ら切開可能で､操作卵子の正常な発生を支持する新規の生殖工学技術である｢ビュゾ

マイクロマニピュレーターに皐る透明帯切開術(ZIP:Zona-pe11ucidaIncisionby､piezo-mictomanipulator)｣を開発することに成功した｡C57B山6Jマウス凍結融解精子を用い

た体外受精にZIPを併用すること(ZI打ⅣF)により､受精率を大きく向上させるとと もに､刀Pを施した卵子の卵管内移植を可能としたことから､ZIPは新規の体外受精 系を提供する極めて優れた生殖補助技術であると考えられた｡さらに､C57BIノ尉マウ スを用いたICSIを検討した結果､世界で初めてICSI由来の近交系マウスを得ること に成功するとともに､ICSIにより得られた胚の移植後の産子への発生能は精子側より もむしろ卵子側の要因に依存することを明らかにした｡この成功によって､遺伝子改 変マウスの遺伝子資源保存へのICSIの応用が可能になった｡最後に､刀P/IVFおよび ICSIについて､実験動物における生殖補助技術としての生産性を考慮し､凍結融解精 子からマウスを生産する際の生産効率を比較した結果､ZIP/ⅠVFは､ICSIよりも有意 tに高い生産効率を示し､換作性もより優れた技術であることが示された｡ 以上､本研究で開発されたZ肝は､低運動能を呈する凍結融解精子の体外受精系におい て極めて有効な生殖補助技術であり､体外受精での生産性を向上させるばかりでなく､こ の技術の開発によりマウス精子の凍結保存が遺伝子資源の維持･保存技術として達成され たものと考える｡今後､本技術基盤を背景にして､マウス遺伝子資源の保存のために精子 の凍結保存が広く普及し､積極的に利用されていくものと期待される｡

以上について,審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論 文として十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目:CompansonofintracytopIasmicsperm叫ectionfbrinbredandhybrid 著 者 名:Kawase,Y,･tWata,T,Toyoda,Y,Wakayama.T,Yanagimachi,R･and Suzuki,H. 学術雑誌名:Mo)ecularReproductionandDeveIopment 巻･号･貢･発行年:60(1):74-78,2001 2)題 目:Effectofpa鵬alincisionofthezonapeIlucidabypiezo-micromanipuIator

fbrin _{vitro fertiLization usIng} frozen⊥thawed mouse spermatozoa on the

deve-opmentalrateofembryostransferredatthe2-Cetlstage 著 者 名:Kawase,Y,lwata,T.Ueda,0.,Kamada,N･,lbchibe,T,Aoki,Y, Jishage,K.andSuzuki,H･ 学術雑誌名:Bio10gyOfReproduction 巻･号･頁･発行年:66(2):381-385,2002 3)題 目:Compa再sonoffe止iIitybetweenintracytopIasmicsperm叫ectionandinv如

fertiIization _with a _partialzona pelLucidaincision by usIng a

PIeZO-micromanIPuIatorincryopreservedinbredmousespermatozoa

著 者 名:Kawase,Y,Aoki,Y,Kamada,N･,Jishage,K･andSuzuki,H･

学術雑誌名:ContemporarylbpicsLaboratoryAnimalScienc 巻･号･眉･発行年:43(1):21-25,2004

既発表学術論文 1)題 目:ThepatemaImethy[ationimprintofthemouseH191∝uSisacquiredinthe gonocytestag占duringfbeta)testisdeveIopment 著 者 名:Ueda,T,Abe,K･,Miura,A･,Yuzuriha,M.,ZubaれM･,Noguchi,M.,Niwa,K., Kawase,Y,Kono,T,Matsuda,Y,Fqjimoto,H.,Shibata,H.,Hayashizaki, YandSasaki,H. 学術雑誌名:GenestoCelIs 巻･号･頁･発行年:5(8):糾9-659,2000 2)題 目:Ana吋SisofIgf2and)gf2rgenesexprssionbyRTPCRinbovinefbtuses 著 者 名:Kawase,Y,Moriki,A.,Minato,Y,Hamano.S.,Matsukawa.K.andKono, T 学術雑誌名:Jouma10fMammalianOvaResearch 巻･号･貢･発行年:17(3):124-127,2000 3)題 目:Applicationofthepiezo-micromanipuIatorfbrirtjectionofembryonicstem Ce"sintomousebIastocysts 著 者 名:Kawase,Y,Iwata,T,Ⅵ血tanabe,M..Kamada,N.,リeda,0..andSuzuki,H. 学術雑誌名:ContemporarylbpicsLaboratoryAnimalScience 巻･号･貢･発行年:40(2):31-34.2001 4)題 目:Di$ruPtionofimprintedexpressibnofU2afbp-rS/U2afl-rSlgeneinmouse Parthenogeneticfetuses 著 者 名:Sotomaru,Y,Kawase,Y,Ueda,T,Obata,Y,Suzuki,H.,Domeki,l., Hatada,l.andKono,T 学術雑誌名:TheJourna10fBio10gicaIChemistry 巻･号･頁･発行年:276(28):26694-26698,2001

5)題 目:HydrocephaIus,S?u$inversus,Chronicsinusitis,andmaleinferti町inDNA

p叫merase入JeRcientmice:POSSibJeimpIicationfbrthepathogenesis

Ofimmotileciliasyndrome 著 者 名:Kobayashi,Yl,VVbtanabe,M.,Okada,Yl,Sawa,H.,lbkai,H.,Nakani$hi, M･,Kawase,Y,Suzuki,H･,Nagashima,K･,(keda,K.andMotoyama,N. 学術雑誌名:Mo暮ecularandCeIlu]arBio暮ogy 巻･号･貢･発行年:22(8):2769-2776.2002

6)題 目‥･Partialincision _of the zona _{pelIucida using piezo-micromanipuIator}

improves･in _{v托ro fertiJization u$ing)ow-mOtil吋SPermatOZOa OfinfertiIe} transgenicmice

著 者 名:Kawase,Y,Kamada,N.andSuzuki,H. 学術雑誌名:JoumaIofMarTlmaIianOvaResearch

巻･号･頁･発行年:19(1):26-31,2002

7)題 目:Role of Lkbl,the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome,in

embryogenesisandpo吋POSis 著 者 名:Jishage,K.,Nezu,J.,Kawase,Yl,lwata,T,Watanabe,M.,M吋OShi,A., Ose,A.,Habu,K.,Kake,T,Kamada,N.,Ueda,0.,Kinoshita,M.,Jenne, D.E.,Shimane,M.andSuzuki,H. 学術雑誌名‥ProceedingsoftheNationaJAcaderTlyOfSciences?ftheUnitedStatesof America 巻･号･貢･発行年:99(13):8903-8908,2002

8)題 目:Cardiac _{p300isinvoIvedinmyocytegrowthwithde00mPenSated} hean 向i山re 著 者 名:Y5nazume,T,Hasegawa,K.,Monmdo,T,Kawamura,T,VVbda,H., Matsumori,A.,Kawase,Y.Hirai,MandK托a,T 学術雑誌名:Mo[ecularandCeJ[ularBio[ogy 巻･号･貢･発行年:23(10):3593-3606,2003 9)題 目‥Possib[eexpansionofWndowoftmpIantation..inpseudopregnantnice:

time _{ofimplanta60n Of embryos at} d肺色rent _{stages of} deveIopm即t

transferredintothesamerecipient 著 者 名:Ueda,0.,Ybrozu,K.,Kamada,N.,Jishage,K.,Kawase,Y,.1byoda,Yand Suzukj,H. 学術雑誌名:Bio)ogyofReproduction 巻･号･貢･発行年:69(3):108シ1090,2003 10)題 目:Expressionofp300protectscardiacmyocytesfromapoptosisinVivo 著 者 名:Kawamura,T,Hasegawa,K.,Morindo,T,Iwai-Kanai,E.,M吋amoto.S., Kawase,Y,Ono,K.,∨＼由da,H.,Akao,M.andK托a,T 学術雑誌名:BiochemicaIandBiophysicalResearchCommunications 巻･号･貢･発行年:315(3):73㌻738,●2004