YAKUGAKU ZASSHI 132(7) (2012) 2012 The Pharmaceutical Society of Japan 849 Note 芽胞形成性酪酸菌製剤の抗菌剤感受性について 金子尚文, 中山智洋, 一川暢宏 Susceptibility of Spore

立命館大学薬学部

e-mail: novichi＠ph.ritsumei.ac.jp

―Note―

芽胞形成性酪酸菌製剤の抗菌剤感受性について

Susceptibility of Spore-forming Butyric Acid Bacteria to Antimicrobial Agents

College of Pharmaceutical Science, Ritsumeikan University; 111 Noji-higashi, Kusatsu, Shiga 5258577, Japan.

(Received November 11, 2011; Accepted April 11, 2012; Published online April 13, 2012)

Antimicrobial agents occasionally cause certain adverse eŠects, such as diarrhea and loose stool, by altering the composition of the intestinal ‰ora. Antibiotic-resistant lactic acid bacteria are used to prevent these adverse eŠects. Although these bacteria are not resistant to several recently introduced antimicrobial agents, bacterial preparations are still sometimes prescribed concomitantly with these antimicrobial agents. In this study, we investigated whether the ad-ministration of the spore-forming butyric acid bacteriaClostridium butyricum improves the adverse clinical eŠects by preventing diarrhea. Inhibition of C. butyricum growth was observed with 17 of the 20 antimicrobial agents used. However, dilution of 11 of these 17 agents resulted in the regrowth ofC. butyricum. These results suggest that C. butyri-cum may survive exposure to several antibiotic agents by forming spores. Further, a decrease in the antimicrobial agent concentration in the gastrointestinal tract permits the vegetative growth ofC. butyricum, which functions as a probiotic. Key words―Clostridium butyricum; probiotics; antibiotic-resistant lactic acid bacteria; antimicrobial agent; spore

緒 言 抗菌剤投与に起因する下痢予防を目的として，臨 床では耐性生菌整腸剤が使用されている．ところ が，現在汎用されている耐性乳酸菌製剤整腸剤は， フルオロキノロン系，グリコペプチド系抗菌剤な ど，それらが上市された以降に開発された新規抗菌 剤に対する感受性は明らかではない場合がある．1) 本 研 究 で 注 目 し た の は ， 芽 胞 を 形 成 す る 酪 酸 菌 （Clostridium butyricum）を有効成分とした生菌整 腸剤である．2)_{本製剤中の酪酸菌は人為的に耐性を} 付与されてはいないものの，芽胞を形成するため抗 菌剤の影響を受け難く，下痢発症の予防・治療に有 用性が認められている．1) ところが，耐性乳酸菌製剤の適応がないフルオロ キノロン系抗菌剤（FQs）の酪酸菌に対する最小発 育 阻 止 濃 度 （ Minimum Inhibitory Concentration; MIC）については，発芽状態である酪酸菌は FQs に対して感受性であったとの報告がされている．3) さらに本研究室では酪酸菌に対する抗菌剤の MIC を測定したが，多くの抗菌剤に対して高い感受性を 示し，臨床的有用性を示唆する動物実験での報告2) と一致しなかった． 酪酸菌は，抗菌剤存在下において発育が抑えられ ても，芽胞形成により死滅せずに生存している可能 性がある．そこで本研究では，酪酸菌を各種抗菌剤 存在下で培養した後，抗菌剤濃度を酪酸菌に対する MIC 以下に低下させた場合，酪酸菌が再度増殖す るかを検討した． 方 法 1. 試験薬剤 酪酸菌製剤はミヤ BM細粒（ミ ヤリサン製薬）を，耐性乳酸菌製剤はビオフェルミ ン R散（ビオフェルミン製薬）を用いた．酪酸菌 の培養には GAM ブイヨン（日水製薬），寒天末 （ナカライテスク）を用いた．薬剤感受性試験には 薬 剤 感 受 性 キ ッ ト 「 ド ラ イ プ レ ー ト ‘ 栄 研 ’」 （DP34，栄研化学）を用いた．ドライプレートには 感受性試験用抗菌薬として，ベンジルペニシリンカ リウム PCG，アンピシリン ABPC，セファゾリン CEZ，スルバクタム/アンピシリン S/A，セフォチ アム CTM，セフトリアキソン CTRX，セフェピム

Table 1. Concentrations of Antimicrobial Agents Used in This Study Antimicrobial Agents Concentration ranges (mg/mL) Antimicrobial Agents Concentration ranges (mg/mL) PCG 0.064 S/A 0.12/0.252/4 ABPC 0.124 VCM 0.251 CEZ 0.52 MINO 0.124 CTM 0.062 CLDM 0.120.5 CTRX 0.062 CAM 0.1216 CFPM 0.062 AZM 0.124 CCL 0.516 LVFX 14 CFPN 0.251 MFLX 0.52 IPM 0.064 GFLX 0.122 MEPM 0.064 ST 9.5/0.538/2 CFPM，セファクロル CCL，セフカペン CFPN， サルファ剤（スルファメトキサゾール/トリメトプ リム）ST，イミペネム IPM，メロペネム MEPM， ミノサイクリン MINO，クリンダマイシン CLDM， バンコマイシン VCM，クラリスロマイシン CAM， アジスロマイシン AZM，レボフロキサシン LVFX， モ キ シ フ ロ キ サ シ ン MFLX ， ガ チ フ ロ キ サ シ ン GFLX があらかじめ塗布されている． 2. 酪 酸 菌 の 培 養 ミ ヤ BM 細 粒 0.1 g を 10 mL の GAM 培地において，37°C の嫌気環境で 24 時間培養後，この培養液の上清 10 mL を再度 10 mL GAM 液体培地において 37°C の嫌気環境で 24 時間 培養した．培養液を攪拌してから 10 mL を採取し， GAM 寒天培地上に撒いて 37°C の嫌気環境で 48 時 間培養した．また，嫌気培養には炭酸ガス発生袋 （アネロパック・ケンキ，三菱ガス化学），嫌気保存 用パウチ袋（三菱ガス化学）を用いた． 3. 抗菌剤に対する酪酸菌の感受性 3-1. 薬剤感受性試験 感受性試験は日本化学 療法学会標準法である微量液体希釈法4,5)_に準拠し て行った．まず，GAM 寒天培地上で培養した酪酸 菌をスパーテルで釣菌し，GAM 液体培地中に採取 した．このとき，菌液の濃度（濁度）を McFarland 2 番（6×108_{cfu/mL）相当になるように吸光度計} を用いて調整した．作製した菌液 25 mL を GAM 液 体培地 12 mL 中に接種し，十分に攪拌した上で， これを感受性試験に用いた．感受性試験には MIC 測定用ドライプレートを用い，96 ヵ所のウェルに 調製した菌液を 100 mL ずつ分注した．最終接種菌 液の濃度はおよそ 106_{cfu/mL であり，使用した抗} 菌剤の濃度範囲は Table 1 に示した．これを 37°C の嫌気環境で 48 時間保存し，酪酸菌の発育の有無 を肉眼で観察した．なお，試験は 7 回行い，3 回以 上同じ結果が得られたものを採用した．感受性試験 の結果は，使用したすべての濃度で酪酸菌が育った 場合，酪酸菌がその薬剤に対して耐性（R），すべ ての濃度で育たなかった場合，酪酸菌がその薬剤に 対して感受性（S），その中間（I）の 3 段階に分け た． 3-2. 抗菌剤濃度希釈後の酪酸菌の生存確認 上 記の分類において感受性試験の結果が S 又は I であ った各薬剤において MIC の菌液を，GAM 液体培 地を用いてそれぞれ 2 倍，4 倍，8 倍に希釈した． 希釈した菌液は 96 穴プレートにて 37°C の嫌気環境 で培養し，酪酸菌の発育の有無を 12 時間後，24 時 間後，48 時間後に肉眼で観察した．なお，試験は 4 回以上行い，2 回以上同じ結果が得られたものを採 用した． 4. 芽胞形成有無の確認 抗菌剤存在下におけ る酪酸菌の芽胞形成の有無を調べるため，酪酸菌に 対する各々の抗菌剤の MIC にて培養した菌液につ いて，芽胞染色（M äoller の法)6)_{を行った．使用薬} 剤は時間依存性，濃度依存性の作用機序の違いを考 慮し，それぞれ代表的な薬剤である PCG, LVFX とした．同様の試験を耐性乳酸菌についても行った． 結 果 1. 薬剤感受性試験 酪酸菌に対する各種抗菌 剤の MIC 測定結果を Table 2 に示す．S であった ものが 10 種類，I であったものが 7 種類，R であ ったものは 3 種類のみであった． この結果を抗菌剤の系統別に分類すると，S はマ ク ロ ラ イ ド 系 の AZM ， フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 の LVFX 等，I がb-ラクタム系の PCG 等でみられ， 耐性乳酸菌製剤の適応がないグリコペプチド系の VCM は R であった． 2. 抗菌剤濃度希釈後の酪酸菌の生存確認 薬 剤感受性試験の結果が S 又は I であった場合，その 薬剤の MIC の菌液を希釈し，その後の増殖に必要 な希釈倍率と時間をまとめた結果を Table 3 に示

Table 2. Categories, Action Mechanisms7)_{and MICs against}

Butyric Acid Bacteria of Antimicrobial Agents Used in This Study

Categories _mechanismsAction Antimicrobial_{Agents (mg/mL)}MIC Judgment

Betalactam _{Inhibit cell} wall synthesis PCG 0.12 I ABPC ≦0.12 S CEZ ≦0.5 S CTM ＞2 R CTRX 1 I CFPM 2 I CCL 1 I CFPN ≦0.25 S IPM 2 I MEPM 0.25 I S/A ≦0.12/0.25 S Glycopetide VCM ＞1 R Tetracycline Inhibit protein synthesis at ribosome MINO ≦0.12 S Lincomycin CLDM ≦0.12 S Macrolide CAM ≦0.12 S AZM ≦0.12 S

Fluoroquinolone Inhibit nucleic_{acid synthesis}

LVFX ≦1 S MFLX ≦0.5 S GFLX 0.5 I Trimethoprim-Sulfamethoxazole combination Inhibit folic acid synthesis ST ＞38/2 R

Table 3. EŠect of Dilution on Growth of Butyric Acid Bac-teria Treated with Antibiotics at MIC for 48 h

Judgment Antimicrobial_Agents

Dilution ratios and incubation times

necessary for

vegetative growth _mechanismsAction Dilution

ratios Incubationtime (h)

I PCG ×4 24 Bacteriocidal CTRX ― ― CFPM ×4 12 CCL ×2 24 IPM ×2 12 MEPM ×4 24 GFLX ×4 12 S ABPC ― ― CEZ ― ― S/A ― ― CFPN ― ― LVFX ×8 12 MFLX ×2 12 MINO ― ― Bacteriostatic CLDM ×8 12 CAM ×4 12 AZM ×4 12 す．表中において，再増殖に必要な希釈倍率・時間 の欄が空白の薬剤は，抗菌剤濃度を希釈しても酪酸 菌が発育しなかったものである．抗菌薬は殺菌的に 作用する殺菌性抗菌薬と，発育の抑制はするが殺菌 はしない静菌性抗菌薬とに分かれる．タンパク合成 阻害薬が静菌性抗菌剤に該当し，今回使用した薬剤 では MINO, CLDM, CAM, AZM が該当する．それ 以外の薬剤は殺菌性抗菌薬である． 結果を見ると，MINO を除く静菌性抗菌薬では 発育を抑えられていた酪酸菌の再増殖が認められ た．また，殺菌性抗菌薬では b-ラクタム系で判定 が S であった薬剤を中心に，再増殖できなかった ものが多くみられたが，耐性乳酸菌製剤の効能効果 に記載がない FQs ではすべての薬剤において再増 殖することが確認できた． 3. 抗菌剤存在下における酪酸菌芽胞形成の様子 　 PCG 及び LVFX の酪酸菌に対する MIC（それ ぞれ 0.12 mg/mL, 1 mg/mL）において，酪酸菌はそ れぞれ芽胞形成していることが確認できた（Fig. 1）．一方，耐性乳酸菌はこれらの抗菌剤に対して生 菌数が減少したほか，一部で細胞膜が破れ，溶菌し ていると考えられた（Fig. 2）． 考 察 抗菌剤投与に起因する下痢予防を目的として，耐 性乳酸菌製剤整腸剤が汎用されているが，それらが 上市された以降に開発された新規抗菌剤に対する感 受性は明らかではない場合がある．1)_{本研究で注目} し た の は ， 芽 胞 を 形 成 す る 酪 酸 菌 （ Clostridium butyricum）を有効成分とした生菌整腸剤である．2) 本製剤中の酪酸菌は人為的に耐性を付与されてはい ないものの，芽胞形成菌であるため抗菌剤の影響を 受け難く，下痢発症の予防・治療に有用性が認めら れている．1) 佐藤らの報告によると，ラットを用いた酪酸菌製

Fig. 1. Spore Formation of Butyric Acid Bacteria

Vegetative cells are stained blue, and spores are stained red. (a) Butyric acid bacteria (intact). (b) Butyric acid bacteria under the MIC of PCG. (c) Butyric acid bacteria under the MIC of LVFX.

Fig. 2. Spore Formation of Antibiotic-resistant Lactic Acid Bacteria

Vegetative cells are stained blue, and spores are stained red. (a) Antibiotic-resistant lactic acid bacteria (intact). (b) Antibiotic-resistant lactic acid bacteria un-der the MIC of PCG. (c) Antibiotic-resistant lactic acid bacteria unun-der the MIC of LVFX.

剤投与後の腸管内動態についての検討において，酪 酸菌は投与 30 分後には小腸の上部から中央部で発 芽し，投与 2 時間後には分裂増殖を始めることが確 認されている．8)_{これは，酪酸菌が消化管内におい} て抗菌剤に曝露される時点では発芽状態である可能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る ． そ の た め 今 回 ， in vitro における薬剤感受性試験は発芽状態の酪酸菌 に対して行った．酪酸菌に対する各種抗菌剤の MIC を測定した結果（Table 2）より，酪酸菌が感受性 （S）を示した薬剤が 20 種類のうち 10 種類，中間 （I）であった薬剤が 7 種類であった．したがって， 酪酸菌は多くの薬剤に対して感受性を示すことが明 らかとなった．これは耐久型の芽胞に対してではな く，発芽後の酪酸菌に対して薬剤感受性試験を実施 したためと考えられた． 耐性乳酸菌製剤は新規抗菌剤に対して感受性であ り，耐性乳酸菌製剤の添付文書上記載のない抗菌剤 に対しては，酪酸菌製剤の投与が望ましいと報告さ れている．1)_{ところが，その中でも FQs に対し，本} 研究と同じ条件，すなわち in vitro における発芽状 態の酪酸菌は感受性を示すことが明らかになってお り，3)_{われわれの薬剤感受性試験の結果もこれを支} 持している．そこで今回，抗菌剤曝露により発育が 抑制された酪酸菌の菌液を希釈後再度培養し，菌の 発育の有無を調べた． Table 3 に示した抗菌剤濃度を希釈した実験の結 果 を 見 る と ， MINO を 除 く 静 菌 性 の 抗 菌 剤 に 加 え，殺菌性の FQs と一部の b-ラクタム系抗菌剤に おいて酪酸菌が希釈後に再増殖したことが確認でき た．したがって，酪酸菌は殺菌性の抗菌剤に曝露さ れても，試験した薬剤の半数以上で生存しているこ とが示唆された．今回再増殖が確認できなかった CTRX を除く ABPC, CEZ, S/A, CFPN, MINO に ついては，薬剤感受性試験において Table 1 に示し た該当薬剤の最小濃度でも酪酸菌が生育しなかっ た．これらの菌液を希釈しても，酪酸菌に対する抗 菌剤の MIC を下回らなかった可能性がある． 酪酸菌に芽胞染色を施した Fig. 1 の結果から， 酪酸菌は抗菌剤曝露によって増殖が抑制されると芽 胞形成することが明らかとなり，酪酸菌は抗菌剤に

より生育が阻害されると芽胞形成するものと考えら れた．これに対して耐性乳酸菌は，これらの抗菌剤 に対して生菌数の減少，あるいは一部で溶菌を起こ していることから，殺菌性の強い抗菌剤服用時には 整腸作用を発揮できない可能性があると考えられた （Fig. 2）． これらの結果は，酪酸菌が抗菌剤に曝露されても 芽胞として生存しているという仮説を支持するもの であり，酪酸菌が抗菌剤の影響を受け難いことを示 したマウスを用いた実験の結果2)_{はある程度説明で} きるものと考えられた． したがって，酪酸菌は消化管内の抗菌剤濃度が低 下すると再び発芽・増殖し，整腸剤としての機能を 回復するものと考えられ，耐性乳酸菌製剤が臨床的 に無効な場合の代替製剤となり得る可能性が示唆さ れた． REFERENCES

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