The Molecular Probes Handbook, 11th Edition 3, The Molecular Probes Handbook www. thermofisher.com/handbook Fluorescen

フローサイトメトリー

製品およびリソースガイド

BioProbes Journal and newsletter 定評ある『BioProbes Journal』は、印刷版と オンライン版の双方で提供しています。 当社の新しい技術と製品を取り上げて最新の 研究成果を紹介します。 『BioProbes Journal』の最新版やバックナン バーは、ウェブサイトwww.thermofisher. com/bioprobesで閲覧できます。 リファレンスガイド オンラインツール いつでも最新の情報を どこでも利用できるモバイルアプリ オンライン学習ツール

The Molecular Probes Handbook, 11th Edition

既存の蛍光標識と検出技術に関する最も包括的な参考書。幅広い参考文献とテクニカルノートを掲載し、多様な生物標識分子と検出試薬を用いた 3,000種 類 以 上の 技 術 的ソリューションを提 供します。『The Molecular Probes Handbook（オンライン版 ）は、 ウェブ サイト』 www.

thermofisher.com/handbookで無償で閲覧いただけます。 抗体選択ツール 使いやすい選択ツールによって幅広い高品質一次および二次 抗体コンジュゲート製品群を検索できます。 www.thermofisher.com/antibodies Fluorescence SpectraViewer（オンライン） 14種類のフルオロフォアをひとつのグラフに表示。印刷や保 存も可能です。 www.thermofisher.com/spectraviewer フローサイトメトリー リソース センター プロトコールや手引き、アプリケーションノート、フルオロフォ アや製品の選択ガイド、参考文献その他の幅広い技術的リ ソースをひとつにまとめました。 www.thermofisher.com/flowresources フローサイトメーターとアクセサリ 細 胞を 個々に解 析するための 最 先 端 技 術。Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer は、精度と感度を損なうこ となくパフォーマンスとスループットを最適化します。

www.thermofisher.com/attune

Flow cytometry guide and protocols

試薬選択ガイドで特定のアプリケーションとプロトコールに 適した試薬を選択。遠隔操作によるトラブルシューティング も可能です。操作のタイミングを逃さない内臓プロトコール タイマーやアラームも搭載しています。 Fluorescence SpectraViewer フルオロフォアのスペクトルをグラフに表示して比較。スペク トルの適合性をチェックして波形を印刷可能な明瞭なフォー マットで電子メールとして送信します。

DailyCalcs science calculator

モル濃度や希釈率、分子量などを簡単に計算します。 無料オンラインセミナー 当社の研究者が多様な技術を共有し、実験のコツやヒントを提供します。 ウェブサイトwww.thermofisher.com/probeswebinarsでは、既存の ウェブセミナーの閲覧や新たなWebinarへのサインアップが可能です。 すべてのモバイルアプリはウェブサイトwww.thermofisher.com/appsから 無償でダウンロードできます。

詳しくは

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_{をご覧ください。}

BIOPROBES

72

MOLECULAR PROBES JOURNAL OF CELL BIOLOGY APPLICATIONS NOVEMBER 2015

SPECIAL IMAGING ISSUE

Visualize apoptosis in context

with Click-iT Plus TUNEL assays

ALSO FEATURING

Intracellular detection of hypoxia Formation of uniform 3D cancer spheroids Protection from photobleaching for live cells

リソース

@ThermoFisherJP facebook.com/ThermoFisherJapan 蛍光の基礎を学ぼう

!

意外に知らない蛍光イメージングの基礎知識 を分かりやすく解説。 「蛍光とは?」という基礎から蛍光顕微鏡の仕 組み、よりよいイメージング写真をとるコツま で様々な知識をギュッとウェブコンテンツに詰 めました。 授業に使える素材集もダウンロードできます。 ぜひご活用ください。 www.thermofisher.com/imagingbasics

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研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。

記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。

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For Research Use only.Not for use in diagnostic procedures. © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.

All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified.

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：03-6832-6980　FAX：03-6832-9584

営　業　部

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：03-6832-9300　FAX：03-6832-9580

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ライフテクノロジーズジャパン株式会社

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〒108-0023　東京都港区芝浦 4-2-8

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™

フローサイトメトリー

製品およびリソースガイド

本書はフローサイトメトリー製品とリソースのガイドで、当社の研究者がフローサイトメトリー用に最適化した一次抗体コンジュ ゲート、細胞機能アッセイ、その他のツールの概要を説明します。当社の研究チームは、蛍光プローブ開発分野でほぼ40年間、 最先端にいます。本書では、現在実用化されているあらゆるフローサイトメトリーツールの中でも最も有用な製品をご紹介します。 お客様が必要とするプローブやアッセイをフルスペクトルの蛍光色で提供する当社のフローサイトメトリー製品をご検討ください。 フローサイトメトリー製品とリソースの詳細については、 ウェブサイトwww.thermofisher.com/flow-cytometryをご覧ください。

フローサイトメトリーのワークフロー

サンプル調製 細胞保存 ____________________2 細胞溶解 ____________________2 固定および透過処理 __________2 Dynabeads 細胞分離 _________3

細胞解析

サンプル調製

抗原検出

装置のセットアップと校正

装置のセットアップと校正 アライメント ________________6 サイズキャリブレーション _____6 セルソーティングのセットアップ ___7 コンペンセーション __________7 細胞の絶対計数 ______________9 細胞解析 細胞生存率 ________________ 20 細胞増殖 __________________ 22 細胞周期 __________________ 24 アポトーシス ______________ 25 その他の細胞機能アッセイ ___ 28 抗原検出 一次抗体 __________________ 12 フルオロフォアの概要 ______ 12 抗体標識 __________________ 15 二次抗体 __________________ 18 カスタムサービス __________ 19

サンプル調製

高品質のデータを収集するには、高品質のサンプルを調製する ことが必要です。InvitrogenTM サンプル調製試薬は、血球保存用、 赤血球溶解用、サンプルの固定および透過処理用などを取り揃 え、最高の結果を提供します。これらの製品の詳細とプロトコー ルの入手については、ウェブサイトwww.thermofisher.com/ flow-sampleをご覧ください。

細胞保存

TransFix

試薬

InvitrogenTM _TransFixTM_{試薬（製品番号 FIX2、FIX20、FIX100）は、}

細胞解析用の白血球の固定と抗原保持に使用する全血保存剤で す。複数のサンプルを簡単にバッチ処理し、ラボのワークフロー を最適化します。またTransFix試薬で固定した血液は、解析用 に収集して他の場所に移すのも簡単です。

細胞溶解

Cal-Lyse Whole Blood Lysing Solution

InvitrogenTM _Cal-LyseTM プレミックス溶解液（製品番号 GAS010、 GAS010S100）は、全血や骨髄液をモノクローナル抗体染色し た後、赤血球を溶解するために作製されました。この試薬で処 理すると、赤血球は溶解し、白血球は固定されます。また、処 理によって白血球に結合した蛍光標識抗体が影響を受けること はなく、白血球の形態的な散乱光特性にも変化はありません。 Cal-Lyse溶解液は、染色における洗浄の要不要に関わらず使用 できます。

固定剤不含

High-Yield Lyse

InvitrogenTM _{High-Yield Lyse（製品番号 HYL250）は、固定剤不}

含の赤血球用プレミックス溶解液です。全血に含まれる赤血球 をフローサイトメトリー解析から除去しながら、一方で希少な 血液細胞集団のロスを最低限に抑えます。この試薬を使用する と、血液サンプルをモノクローナル抗体染色した後、すぐに赤 血球を溶解できます。洗浄手順は必要ありません。

固定および透過処理

FIX & PERM

試薬とキット

• 大半の細胞内抗原の解析に対応

• 細胞の形態的な散乱光に影響なし

• バックグラウンド染色を低減

• バリデーション済みのプロトコール

図1. FIX & PERM Cell Permeabilization Kitを使用して細胞内と細胞表面の

抗原を同時に染色

C57BL/6脾臓細胞を2つの群に分け、一方をブレフェルジン A の存在下、ホ

ルボールミリステートアセテート（PMA）およびイオノマイシンで5時間刺激 し、他方を未処理のまま残しました。その後、フルオレセイン（FITC）コンジュ ゲート抗マウスCD4抗体（製品番号 MCD0401）で細胞表面を染色しました。

次に FIX & PERM Cell Permeabilization Kit（製品番号 GAS003、GAS004）

でサンプルを固定および透過処理しました。透過処理中に、PE-Cy 7タンデ ムコンジュゲート抗マウスγインターフェロン（IFN-γ）抗体（製品番号

A18713）およびPacific Blueコンジュゲート抗マウス腫瘍壊死因子α（

TNF-α）抗体（製品番号 RM90128）で細胞内を染色しました。AttuneAcoustic Focusing Cytometer（ブルー/バイオレットレーザー）を使用して488 nm レーザーで励起後、530/30 nmバンドパスフィルターでFITC蛍光シグナル を、また640 nmロングパスフィルターでPE-Cy 7タンデム蛍光シグナルを 検 出 し、 デ ー タ を 収 集 し ま し た。Pacific Blue蛍 光 シ グ ナ ル は、 405 nmレーザーで励起し、450/40 nmバンドパスフィルターで検出しまし た。（A）は、すべてのマウス脾細胞をIFN-γ抗体とTNF-α抗体の双方で染 色し、リンパ球でゲーティングしました。未処理細胞が左、ブレフェルジンA の存在下、PMAとイオノマイシンで刺激した細胞が右です。（B）は、上記と 同条件で刺激した後、TNF-α（左）とIFN-γ（右）を発現したCD4+ _T 細胞 です。

IFN–γ–PE-Cy7 fluorescence

106 105 104 103 -103 TNF-α –Pacific Blue fluor escence TNF-α –Pacific Blue fluor escence 106 105 104 -10103 3

IFN–γ–PE-Cy7 fluorescence

CD4–Fluorescein fluorescence CD4–Fluorescein fluorescence

IFN– γ –PE-Cy 7 fluor escence 106 105 104 103 -103 106 105 104 -10103 3 106 105 104 103 -103 106 105 104 -10103 3 106 105 104 103 -103 106 105 104 -10103 3 TNF-α –Pacific Blue fluor escence A B

サンプル調製

InvitrogenTM _{FIX & PERM}TM _{Cell Permeabilization Kit}

（製品番号

GAS003、GAS004）は、 固 定 用（Medium A）と 透 過 処 理 用 （Medium B）の2つの試薬を組み合わせ、ひとつの細胞群で細 胞内と細胞表面の抗原を同時に分析できるようにします（図1）。 この手法では抗体が容易に細胞内構造に浸入するため、細胞の 形態的な散乱光特性が損なわれません。また独自の試薬により バックグラウンド染色を低減し、透過処理試薬と蛍光標識抗体 を同時に浸透させます。固定用試薬（製品番号 GAS001S100） と透過処理用試薬（製品番号 GAS002S100）は、別々に購入す ることもできます。

サンプル調製

Dynabeads

_細胞分離

• 実用的かつ機能的̶ポジティブ分離、ネガティブ分離、細胞の活性化および不活化 向けの製品 • 穏やか̶表面が不活性のビーズによるカラムフリー分離で細胞をこれまでより穏や かに取り扱い、調製時の汚染リスクを低減 • 高収量̶チューブによる分離で優れた細胞回収率を達成 細胞を元の環境から移動させると、実験手順が細胞のフェノタイプや機能に悪影響を及 ぼす恐れがあります。そのため下流の実験を成功させるには、正しい細胞分離法を選択 する必要があります。DynabeadsTM 磁気ビーズは、磁性物質を薄い不活性ポリマーシェ ルでコーティングした超常磁性のモノサイズポリマービーズです（図2）。この設計に よって、分離後にサンプルが鉄などの好ましくない物質で汚染されにくくなります。ま たネガティブ分離用およびdepletion用ビーズでは細胞はビーズにまったく結合せず、 ポジティブ分離用ビーズでは細胞を穏やかに分離した後、磁気ビーズから放出するため、 最終的な細胞サンプルは純度と生存率が高く、結果に影響を与える残留物がありません （図3）。

ヒト細胞分離

Dynabeads磁気ビーズは、チューブを用いて全血や単核細胞、バフィーコート、骨髄、 組織サンプルから、直接ヒト細胞を穏やかに分離します。分離した細胞は、フローサイ トメトリーをはじめ、下流のあらゆるアッセイに使用可能です（図4）。Dynabeads製 品には、ヒトT細胞、B細胞、幹細胞、NK細胞、単球、樹状細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、 白血球、顆粒球などの分離用製品群があります。 分離オプション

:

• ポジティブ分離と細胞溶出 • ネガティブ分離（細胞はビーズに結合しない） • 不要な細胞またはポジティブ分離細胞の除去（細胞アプリケーション用） • お客様独自の抗体を使用した細胞分離 ヒト細胞分離用の既成の製品が見つからない場合は、お客様の選択した抗体を組み合わ せて独自の細胞分離用ツールを作製できる幅広いDynabeads製品（ストレプトアビジ ンDynabeads、二次抗体コーティング済Dynabeads、表面活性化Dynabeadsなど） を提供しています。 詳細については、ウェブサイトwww.thermofisher.com/humancellisolationをご覧 ください。 図2. Dynabeadsは、均一な球体のビーズです。高度に規格化され、製品特性が安定しているため、 信頼性と再現性の高い結果を確実に提供します。 1 2 3 図3. Dynabeads ビーズによるチューブを使 用したポジティブまたはネガティブ細胞分離の ワークフロー 0 1,000 500 2,000 1,500 CD4 FITC 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 0 250 750 500 1,250 1,000 CD4 FITC 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 Count Count 図4. ヒト CD4+ _{T細胞の純度}

Dynabeads UntouchedTM _{Human CD4 T Cells}

Kitを使用した末梢血単核球のネガティブ分離前 （上）と後（下）の純度 0 1,000 500 2,000 1,500 CD4 FITC 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 0 250 750 500 1,250 1,000 CD4 FITC 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 Count Count 初期サンプルを Dynabeads で インキュベート ビーズに捕捉された 細胞を Dynal MPC マグネットで分離 ビーズに結合しない 細胞を含む上清を 新しいチューブに移動 ポジティブ分離細胞 （ビーズで捕捉された 細胞） 分子アプリケーション （mRNA/DNA 解析など） 細胞ベースアッセイ、フロー サイトメトリー、細胞培養 ビーズを分離 ネガティブ分離細胞 （ビーズに結合しない 細胞）

サンプル調製

マウス細胞分離

Dynabeadsは、チューブを用いて全血や脾臓、リンパ節、胸腺サンプルから、直接マウス細胞を穏やかに分 離します。分離した細胞は、フローサイトメトリーをはじめ下流のあらゆるアッセイに使用可能です（図5）。 Dynabeadsには、マウスT細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞などの分離用製品群があります。 分離オプション

:

• ポジティブ分離と細胞放出 • ビーズに結合しない細胞のネガティブ分離 • 不要な細胞またはポジティブ分離細胞の除去（細胞アプリケーション用） マウス細胞分離用の既成の製品が見つからない場合は、お客様の選択した抗体を組み合わせて独自の細胞分離 用ツールを作製できる幅広いDynabeads製品（ストレプトアビジンDynabeads、二次抗体コーティング済 Dynabeads、表面活性化Dynabeadsなど）を提供しています。 詳細については、ウェブサイトwww.thermofisher.com/mousecellisolationをご覧ください。

オンラインで詳細情報を提供

ウェブサイトwww.thermofisher.com/cellisolationでは、当社のすべての細胞分離製品についての詳細説明 と次の情報を提供しています。 • 最適の細胞分離製品を選択するためのガイド • サンプル調製プロトコールと細胞分離の手引き • 当社の細胞分離製品を他社の市販製品と比較した性能データ • 使用するチューブやプレートに最適の分離用磁石を選択するためのヘルプ • ビデオやパンフレット、アプリケーションノートおよびDynabeads製品を使用した参考文献へのリンク 図5. マウス脾細胞からのCD4+ _{T細胞の分離}

CD4+ _{T細胞の分離においてDynabeads FlowComp Mouse CD4 Kit（上）は、カラムベースのポジティブ細胞分離（下）} （純度と生存率はそれぞれ78%と63%）との比較で大幅に高い純度（97%）と生存率（86%）を示しました。 CD4+ 0 50 100 200 150 300 250 350 400 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 CD4+ 102 103 104 105 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 CD4+ 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 0 100 200 400 300 500 600 CD4+ 102 103 104 105 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5

Dynabeads® _{FlowComp™ Mouse CD4 Kit}

計　数 ヨ ウ化 プ ロ ピ ジウ ム ヨ ウ化 プ ロ ピ ジウ ム 計　数 Count ヨウ化プロピジウム カラムベース分離

Dynabeads FlowComp Mouse CD4 Kit

純度： 97.2% 純度： 78.5% 生存率： 63% 生存率： 86% ヨウ化プロピジウム Count

サンプル調製

サンプル調製製品のリスト

分類 製品名 生物種 ターゲット 細胞のタイプ 容量 製品番号 細胞保存 TransFix 試薬 NA NA 2 mL FIX2 20 mL FIX20 100 mL FIX100 赤血球溶解

Cal-Lyse Whole Blood Lysing Solution NA NA 25 mL GAS010 100 mL GAS010S100

High-Yield Lyse NA NA 500 mL HYL250

固定および透過処理 FIX & PERM Cell Permeabilization Kit NA NA 50回分 GAS003

200回分 GAS004

固定用試薬（Medium A） NA NA 100 mL GAS001S100

透過処理用試薬（Medium B） NA NA 100 mL GAS002S100

Dynabeads 細胞分離 Dynabeads FlowComp Human CD4 Kit ヒト T細胞 3 mL 11361D Dynabeads CD4 Positive Isolation Kit ヒト T細胞 5 mL 11331D Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ヒト T細胞 1キット 11352D Dynabeads FlowComp Human CD8 Kit ヒト T細胞 3 mL 11362D Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ヒト T細胞 5 mL 11333D Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit ヒト T細胞 1キット 11348D Dynabeads FlowComp Mouse CD4 Kit マウス T細胞 3 mL 11461D DETACHaBEAD Mouse CD4 Kit マウス T細胞 5 mL 12406D Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit マウス T細胞 2 x 10 mL 11415D Dynabeads FlowComp Mouse CD8 Kit マウス T細胞 1キット 11462D Dynabeads Untouched Mouse CD8 Cells Kit マウス T細胞 2 x 10 mL 11417D N/A は該当なしの略。 本カタログにて紹介している各種「Dynabeads製品」は株式会社ベリタスにて取扱いを致しておりま す。 ●お問い合わせ先 株式会社ベリタス  〒105-0001 東京都港区虎ノ門2-7-14 八洲ビル TEL 03-3593-3211（代） FAX 03-3593-3216 E-mail：veritas@veritastk.co.jp URL：http://www.veritastk.co.jp

装置のセットアップと校正

図6. 488 nmアルゴンイオンレーザーで励起し、3つの蛍光チャネルでモ

ニターした AlignFlow ビーズ

3つの蛍光チャネルすべてで明確な蛍光シグナルが検出されました。ビーズ の蛍光強度にほとんどばらつきがないことに注目してください（データ提供:

Carleton Stewart, Rosewell Park Cancer Institute）。

粒 子の数 緑色 橙色 赤色 蛍光強度 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 • 日々の装置のパフォーマンスを高い信頼性で最適化 • 一貫したデータ収集でばらつきを最小限に抑制 • どのような装置にも適合 フローサイトメーターは、個々の細胞その他の粒子を、高い精 密度と速度、正確度で定量測定するための装置です。他のあら ゆる高性能装置と同様、フローサイトメーターも精度と信頼性 を確保するため頻繁に校正する必要があります。当社のマイク ロスフィア製品は、その安定性と均一性、再現性によってフロー サイトメーターのセットアップと校正に不可欠のツールとなっ ています。 マイクロスフィア製品の概要については、ウェブサイトwww. thermofisher.com/flow-standardsをご覧ください。

アライメント

AlignFlow Cytometry Alignment Beads

InvitrogenTM _AlignFlowTM _{Flow Cytometry Alignment Beadsは、}

フローサイトメーターのアライメント、焦点調節、キャリブレー ション用に作製された信頼性の高いリファレンスビーズです。こ の蛍光染色ポリスチレンマイクロスフィアは、サイズや蛍光強度 の均一性に優れ（図6）、生体サンプルとほぼ同じサイズやシグナ ルの波長および強度を備えています。AlignFlowは、色素をビー ズの表面ではなく内部に含んでいるため、光化学的および物理的 安定性に優れ、装置のセットアップ用に信頼性の高いリファレン スシグナルを発します。ビーズの蛍光色素は、通常のフローサイ トメトリーで使用されるレーザー源の励起波長を最適化できるよ う慎重に選択されています。AlignFlowビーズには、350∼370 nm励起UV レーザー用（製品番号 A16502、A16505）、488 nm 励起ブルーレーザー用（製品番号 A16500、A16503）、633 nm 励起レッドレーザー用（製品番号 A16501、A16504）の3種類が あります。ビーズのサイズはそれぞれ直径2.5 µmと6.0 µmの 2種類です。

サイズキャリブレーション

Flow Cytometry Size Calibration Kit

InvitrogenTM _{Flow Cytometry Size Calibration Kit}

（ 製 品 番 号 F13838）は、信頼性の高いフローサイトメトリー用サイズリ ファレンスとして作製された非蛍光マイクロスフィア懸濁液の セットです。このキットには未染色ポリスチレンマイクロスフィ アの懸濁液が6種類同梱されています。各マイクロスフィアの 直径は、透過電子顕微鏡法で測定済みです。実験サンプルに含 まれる細胞のサイズは、前方散乱光（FSC）シグナルをリファレ ンスビーズと比較することで推定できます。このマイクロスフィ アは再現性のあるサイズマーカーとして働き、実験サンプルに 混合することも、また並行してランすることも可能です（図7）。

図7. Flow Cytometry Size Calibration Kit

Flow Cytometry Size Calibration Kit（製品番号 F13838）に同梱の6種類の

ポリスチレンマイクロスフィアサンプルを使用し、前方散乱光の強度（FSC） を表すログチャネル値のヒストグラムを解析しました。FSCの測定には励

起波長488 nmのBecton Dickinson FACScanフローサイトメーターを使用

しました。 FSC 800 1000 600 400 200 0 300 200 100 0 1.0 µm 2.0 µm 4.0 µm 6.0 µm 10 µm 15 µm 粒 子の数

装置のセットアップと校正

Flow Cytometry Sub-micron Particle Size

Reference Kit

InvitrogenTM _{Flow Cytometry Sub-micron Particle Size}

Reference Kit（製品番号 F13839）は、信頼性の高いフローサイ トメトリー用サイズリファレンスとして作製された緑色蛍光マ イクロスフィア懸濁液のセットです。キットにはポリスチレン マイクロスフィアが 6 種類同梱されています。各マイクロス フィアの直径は、透過電子顕微鏡法で測定済みです。すべての ビーズは、励起および発光プロファイルがAlexa Fluor 488また はFITCで染色した細胞とほぼ同一です（最大励起波長505 nm、最大発光波長515 nm）。 粒子の数 粒子の数 蛍光強度 FSC 緑色 橙色 赤色

装置のセットアップと校正

コンペンセーション

理想的な実験環境では、各フルオロフォアの蛍光プロファイル はきわめて強く、狭いピークを描き、他のシグナルのピークと 完全に分離できるはずです。しかし実際には、有機色素や蛍光 タンパク質は幅広いシグナルピークを描きます。一般に利用さ れる2つのフルオロフォアが描くピークの重複を図9に示しま した。これはAlexa Fluor 488色素とR-フィコエリスリン（ R-PE）の蛍光プロファイルです。収集したデータを正しく分析す るには、Alexa Fluor 488色素で収集した蛍光シグナルが確実に Alexa Fluor 488のものであり、波長領域の一部が重複している R-PEのシグナルが混じっていないことを確認する必要があり ます。そのためどのフルオロフォアを使用する場合も、蛍光シ グナルを正確に収集するには、すべての色素でシグナルの補正 が不可欠となります。この補正がコンペンセーションです。 当社は2種類のコンペンセーションキットを提供しています （表1）。InvitrogenTM _AbCTM _{Bead Kitは、蛍光標識抗体を用い}

たイムノフェノタイピング用蛍光色素のコンペンセーションに 使 用 し ま す。 ま たInvitrogenTM _ArCTM _{Amine Reactive}

Compensation Bead Kitは、InvitrogenTM _LIVE/DEADTM _Fixable

Dead Cell Stain Kitなどのアミン反応性色素を用いた細胞生存 率アッセイに使用します（詳細については20ページの「細胞生 存率」を参照）。

AbC compensation bead kits

• フローサイトメトリーのコンペンセーションに貴重なサンプ ルを使用する必要なし • マウスやラット、ハムスターの免疫グロブリンでは、異なる サブクラスにきわめて高い反応性を発揮 • 迅速でシンプルなビーズベースのフローサイトメトリー用コ ンペンセーション • 抗原発現のばらつきによる不安定さを解消 実験サンプルに含まれる生体粒子のサイズ（またはサイズ領域） は、FSCをリファレンスビーズと比較することで推定できます （図8）。各実験でマイクロスフィアは、再現性のあるサイズマー カーとして機能し、個別（ひとつのサイズのみ）にも、またはプ レミックス（2∼6サイズ）としても使用できる上、実験サンプ ルに混合することも、平行してランすることもできます。 このキットは、装置のパフォーマンスの確認やサブマイクロ粒 子の分析に適したパラメータの設定に利用できます。たとえば 次のような項目のチェックに使用します。 • 粒子サイズ測定の際の分解能の上限やダイナミックレンジ • 光電子増倍管の前方および側方散乱光の感度 • 装置のベースラインノイズのレベル • レーザーと光学系のアライメントと安定性 • 流体システムの安定性

セルソーティングのセットアップ

Cell Sorting Set-Up Beads

Cell Sorting Set-Up Beads（ 製 品 番 号 C16506、C16507、

C16508、C16509）は、フローサイトメトリー用セルソーター のセットアップと校正用に作製された信頼性の高いスタンダー ドです。直径6 µm（±10%）のこのビーズは、サイズやシグナ ルの波長および強度が多くの生物学的サンプルと同等です。そ のためドロップディレイや効率（ソーティング中の細胞損失の 割合）といったセルソーターの設定のチェックに利用できます。 またフローサイトメーターのレーザー源、光学系、流量の校正 にも使用できるため、貴重で繊細な実験サンプルを無駄にする ことがありません。

図8. Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit

Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit（製品番号 F13839）

には 6 種類のサイズの粒子が同梱されていますが、ここではそのうち5種類 を使用しました。この5つの粒子のシグナルは、Attune Acoustic Focusing

Cytometerを使用して488 nm レーザーで励起後、530/30 nmバンドパス

（BP）フィルターで収集しました。5種類の緑色蛍光マイクロスフィアの直径 は、グラフ上で粒子の蛍光シグナルを縦軸、側方散乱光を横軸に取り、特定し ました。

図9. Alexa Fluor 488色素（緑色）と R-PE（オレンジ色）の蛍光プロファイル

Rel ati ve i nt en sity ( % ) (nm) 0 25 50 75 100 300 400 500 600 700 800 900 波長 0.1 µm 0.2 µm 0.5 µm 1 µm 2 µm 106 105 103 ₁₀4 102 106 105 104 103 102 101 100 530/30 nm BP で収 集 し た粒 子 の 蛍光 シ グナ ル 側方散乱光 530/30 nm BP で収集した粒子の 蛍光シグナル 側方散乱光

装置のセットアップと校正

AbC Bead Kitは、フローサイトメトリーのコンペンセーション 用の安定した正確な使いやすいキットとして次の抗体に使用で きます。(1)蛍光標識ハムスター、マウス、ウサギまたはラット 抗体（AbC Total Antibody Compensation Bead Kit、製品番号

A10497、図10）、(2)蛍光標識マウス抗体（AbC Anti-Mouse Bead Kit、製品番号 A10344、図11）、(3)蛍光標識ラットまた はハムスター抗体（AbC Anti-Rat/Hamster Bead Kit、製品番号

A10389）。これら3つのキットには、いずれも特別に調製され たポリスチレンマイクロスフィアが2種類同梱されています。 一方は特定の免疫グロブリンのアイソタイプすべてに結合する AbCTM_{捕捉ビーズ（またはポジティブビーズ）、他方は抗体結合} 能のないネガティブビーズです。この2種類のビーズは、蛍光 標識一次抗体（使用するキットによりハムスター、マウス、ラッ ト、ウサギのいずれか）とインキュベーションすると、明確な ポジティブおよびネガティブ群に分かれるため、コンペンセー ションに利用できます（図11）。 細胞の染色に使用した蛍光標識抗体でコンペンセーションを実 施することも可能です。ビーズの散乱光の優れた安定性と表面抗 体の高い結合能により、どのような蛍光標識一次抗体を組み合わ せても、より安定性と精度の高いコンペンセーションが実現しま す。2つのマイクロスフィア（AbC捕捉ビーズおよびネガティブ ビーズ）はどちらも直径約6 µm（各ロットの正確なサイズは容 器に表示）です。またビーズ懸濁液は、サンプルに添加しやすい ようスポイト容器に封入されています。 製品名 アッセイの種類 ポジティブビーズ ネガティブビーズ 製品番号

AbC Total Antibody

Compensation Bead Kit イムノフェノタイピング ハムスター、マウス、ウサギ、ラットの抗体* 非結合 A10513A10497

AbC Anti-Mouse Bead Kit イムノフェノタイピン

グ マウスモノクローナル抗体* 非結合 A10344

AbC Anti-Rat/Hamster Bead Kit イムノフェノタイピン

グ ラットとハムスターのモノクローナル抗体* 非結合 A10389

ArC Amine Reactive

Compensation Bead Kit 細胞生存率アッセイ アミン反応性色素とCell Stain LIVE/DEAD Fixable Dead 非アミン反応性 A10346

* AbC 捕捉ビーズはすべてのアイソタイプに結合します。

これらはすべて研究用にのみ使用できる製品です。診断用には使用できません。

表

1.

コンペンセーションキット選択ガイド

ArC Amine Reactive Compensation Bead

Kit

• 細胞の煩雑な熱処理を省略

• すべての LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain kit用に最適化

• 迅速でシンプルなビーズベースのフローサイトメトリー用コ ンペンセーション

• コンペンセーションに貴重なサンプルを使用する必要なし

• 正確で安定した結果を提供

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit（ 製 品 番 号

A10346）は、フローサイトメトリーのコンペンセーション用の

安定した正確な使いやすいキットです。すべてのLIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitをはじめ、あらゆるアミン反応性色 素に使用できます。LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit（お よびアミン反応性色素）は、細胞内のアミンに反応するため、 哺乳類細胞の生存率評価に利用されています。これらの反応性 色素は、壊死細胞では損傷した細胞膜を通って細胞内に入り、 細胞の表面や内部の遊離アミンと反応して強い蛍光シグナルを 発します。一方、生細胞では、色素は細胞表面のアミンとのみ 反応するため、蛍光シグナルが比較的弱くなります。生細胞群 に比べて死細胞群の蛍光シグナルは、通常50倍以上です。 PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 1,000 PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 700 アルメニアン ハムスター IgG シリアン ハムスター IgG PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 マウス IgG1 マウス IgG2a マウス IgG2b マウス IgG3 マウス IgGM ラット IgG1 ラット IgG2a ラット IgG2b ラット IgG2c ラット IgGM Count Count Count Count PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 ウサギ モノクローナル IgG ウサギ ポリクローナル IgG

図10. AbC Total Antibody Compensation Bead Kit の染色能を示すヒストグラム

マウス（A）、ラット（B）、ハムスター（C）のモノクローナル抗体とウサギ（D）のモノクローナルおよびポリクローナル抗体におけるポジティブビーズのシグナ ル分離。最適量の各PE抗体コンジュゲートでビーズを標識し、488 nmレーザーで励起後、574/26 nmバンドパスフィルターを使用してAttune Acoustic Focusing Cytometerでシグナルを収集しました。 PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 1,000 PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 700 アルメニアン ハムスター IgG シリアン ハムスター IgG PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 マウス IgG1 マウス IgG2a マウス IgG2b マウス IgG3 マウス IgGM ラット IgG1 ラット IgG2a ラット IgG2b ラット IgG2c ラット IgGM Count Count Count Count PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 ウサギ モノクローナル IgG ウサギ ポリクローナル IgG PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 1,000 PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 700 アルメニアン ハムスター IgG シリアン ハムスター IgG PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 マウス IgG1 マウス IgG2a マウス IgG2b マウス IgG3 マウス IgGM ラット IgG1 ラット IgG2a ラット IgG2b ラット IgG2c ラット IgGM Count Count Count Count PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 ウサギ モノクローナル IgG ウサギ ポリクローナル IgG PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 1,000 PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 700 アルメニアン ハムスター IgG シリアン ハムスター IgG PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 900 マウス IgG1 マウス IgG2a マウス IgG2b マウス IgG3 マウス IgGM ラット IgG1 ラット IgG2a ラット IgG2b ラット IgG2c ラット IgGM Count Count Count Count PE fluorescence 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 0 200 100 400 300 600 500 800 700 ウサギ モノクローナル IgGウサギ ポリクローナル IgG A B C D

装置のセットアップと校正

図11. AbCAnti-Mouse Bead Kitを使用したコンペンセーション

（A）陽性のシグナルを発するAbC 捕捉ビーズと陰性のシグナルを発するネガティブビーズをフィコエリスリン（PE）コンジュゲートマウス抗ヒトCD56抗体 （製品番号 MHCD5604）で標識しました。（B）陽性のシグナルを発するAbC 捕捉ビーズと陰性のシグナルを発するネガティブビーズをFITC コンジュゲートマ ウス抗ヒトCD3抗体（製品番号 MHCD03014）で標識しました。（C）2つのパラメータで作成したプロットは、ゲーティング後のPEコンジュゲートマウス抗 ヒトCD56抗体とFITCコンジュゲートマウス抗ヒトCD3抗体で標識したヒトリンパ球です。このプロットは、AbCTM _{Anti-Mouse Bead Kit（製品番号}

A10344）でコンペンセーションした後、作成しました。 50 100 150 200 250 102 -102 _{0 10}3 ₁₀4 ₁₀5 Count PE fluorescence 50 0 100 150 200 250 102 -102 -350 0 103 ₁₀4 ₁₀5 Count

FITC fluorescence CD56-PE fluorescence

CD3-FITC fluor escence 102 -102_{0 10}3 ₁₀4 ₁₀5 105 104 103 102 0 -102

A

B

C

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit には、あらゆるアミン反応性色素に結合するArC反応ビーズ （コンポーネントA）と非反応性のArCTM

ネガティブビーズ（コンポーネントB）が同梱されています。この特 別に調製された2種類のポリスチレンマイクロスフィアがLIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainsのコンペン セーションを簡単にします。この2種類のビーズは、いずれのアミン反応性色素とインキュベーションしても 明確なポジティブおよびネガティブ群に分かれるため、コンペンセーションを設定できます（図12）。また

ArC Amine Reactive Compensation Bead Kitは、AbC Anti-Mouse Bead Kitと組み合わせて蛍光標識マウス 抗体に使用すると、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stainによるマルチカラーイムノフェノタイピング解析用 のより安定性と精度の高いコンペンセーションが可能です。

細胞の絶対計数

フローサイトメトリーは、細胞を迅速に定量化する技術です。しかしほとんどのフローサイトメーターは、サ ンプルに含まれる細胞の濃度を直接測定することも絶対計数することもできません。細胞の絶対計数は、幹細 胞研究をはじめとする幅広い分野で細胞群の定量や疾患の進行度の把握に利用されてきました。細胞の絶対計 数は通常、血球計数装置による細胞濃度の測定とフローサイトメーターの細胞群データの収集を別々に実行し て組み合わせるマルチプラットフォーム法、またはマイクロスフィアの内部計数標準をフローサイトメーター のサンプルに適用するシングルプラットフォーム法のどちらかで行われます。シングルプラットフォームのほ うがマルチプラットフォームよりも技術的に簡単であり、ラボ間でのばらつきや過小評価も抑えられるため、 望ましいとされています。

当社は細胞計数用製品としてInvitrogenTM _CountBrightTM _{Absolute Counting Beads}

とAccuCheck Counting

Beadsの2種類を提供しています。次ページの表2を参考に最適の製品を選択してください。

図12. 3つの LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitで染色した ArC Amine Reactive Compensation Bead Kitのプロファイル

（A）LIVE/DEAD Fixable Violet Dyeで染色したビーズ（製品番号 L34955）を405 nmレーザーで励起し、蛍光シグナルは450/50 nmバンドパスフィルターで収

集しました。（B）LIVE/DEAD Fixable Green Dyeで染色したビーズ（製品番号 L23101）を488 nmレーザーで励起し、蛍光シグナルは525/50 nmバンドパスフィ ルターで収集しました。（C）LIVE/DEAD Fixable Far Red Dyeで染色したビーズ（製品番号 L10120）を633 nmレーザーで励起し、蛍光シグナルは660/20 nm

バンドパスフィルターで収集しました。

LIVE/DEAD Fixable Green stain fluorescence 0 50 100 150 200 350 300 250 102 -102 -288 0 103 ₁₀4 ₁₀5 Count

LIVE/DEAD Fixable Red stain fluorescence 0 50 100 150 200 350 300 250 102 -102 -715 0 103 ₁₀4 ₁₀5 Count

LIVE/DEAD Fixable Violet stain fluorescence 0 50 100 150 200 350 400 300 250 102 -102_{0 10}3 ₁₀4 ₁₀5 Count

A

B

C

装置のセットアップと校正

製品名 サンプルの種類 ビーズのサイズ 励起波長（nm） 最大発光波長（nm） 測定パラメータ 製品番号

CountBright Absolute

Counting Beads すべてのサンプル 7 µm UV ∼ 635 385 to 800 細胞数 C36950 AccuCheck Counting Beads 全血 Bead A: 6.40 µm

Bead B: 6.36 µm Bead A: 488Bead B: 635 Bead A: 575–585Bead B: 660–680

細胞数と

ピペッティング精度 PCB100

表

2.

絶対計数用ビーズの選択ガイド

CountBright Absolute Counting Beads

• 幅広い蛍光色素を搭載し、あらゆるメーカーの装置に適合

• 使いやすいプロトコールで、溶解/非洗浄全血などさまざま な細胞に対応

• マルチプラットフォーム法に比べて、高い信頼性を発揮

InvitrogenTM _CountBrightTM _{Absolute Counting Beads}

（製品番 号 C36950）は、幅広い励起および発光波長（励起波長UV∼ 635 nm、発光波長385∼800 nm）で強い蛍光シグナルを発す る校正済みのマイクロスフィア懸濁液であり、既知の濃度のマ イクロスフィアを含有しています。絶対計数するには、特定の 量のマイクロスフィアを特定の量のサンプルに加え、サンプル とマイクロスフィアの量的割合がわかるようにします。分析し たサンプル量は、マイクロスフィアのイベント数から算出でき ます。また細胞のイベント数をもとに細胞の濃度も算出できま す。一般に、統計的に有意なサンプル量を測定するには、少な くとも1,000ビーズイベントが必要です。

CountBright Absolute Counting Beadsは、溶解/非洗浄全血 などのあらゆるサンプルに使用できます。試薬に含まれるマイ クロスフィアの直径は約7 µm、沈降特性はリンパ球と同等です。 細胞やマイクロスフィアのロスに繋がりかねないサンプル調製 （洗浄など）は避けてください。CountBright ビーズは、散乱光 または蛍光に閾値を設けて使用することができます。散乱光に 閾値を設ける場合は、マイクロスフィアのシグナルが閾値以上 になるようにしてください。マイクロスフィアはパラメータを ひとつ設定することでゲーティングできますが、パラメータを 複数用いてマイクロスフィアを細胞や他のイベントと分離する こともできます。

図13. CountBright Absolute Counting Beads

Jurkat細胞の生細胞と熱処理細胞の混合液をLIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity

Kit（製品番号 L3224）の試薬で処理しました。このサンプルに CountBright

Absolute Counting Beads（製品番号 C36950）を加え、488 nm レーザー励

起のフローサイトメトリーで解析しました。カルセイン蛍光シグナルを 530/30 nmバンドパスフィルターで収集し、エチジウムホモダイマー 1 （EthD-1）蛍光シグナルを610 nmロングパスフィルターで収集しました。デー タでは生細胞と死細胞だけでなくカウントビーズも明確に分離されています。 EthD-1 fluor escence Calcein fluorescence カウント ビーズ 死細胞 生細胞 105 105 104 104 103 103 102 102 0 0

AccuCheck Counting Beads

• 2色の蛍光ビーズの比率を利用した内部コントロールによっ

て、ピペッティングの精度をチェック

• 結果の安定性を高めるため、マルチプラットフォームよりも シングルプラットフォームを推奨

• 大半の免疫フェノタイピング実験でバリデーションが簡単

AccuCheck Counting Beads（製品番号 PCB100）は、効率的 なシングルプラットフォームで細胞を絶対計数します。フロー サイトメトリーによる直接免疫フェノタイピングのメリットと

2 種類の異なるビーズ（ビーズAとB）を使用できる利便性を組 み合わせました。この2つの蛍光マイクロスフィアは、血液量 の 算 出 に お い て 二 重 の 内 部 標 準 と な り ま す。 既 知 の 量 の

AccuCheck Counting Beadsを同じく既知の量の染色済み血液 サンプル（溶解/非洗浄）に加えます。ビーズと細胞を計数しま す。ビーズの濃度がわかっているため、蛍光ビーズの全イベン ト数とカウントした細胞の数から1マイクロリットルあたりの 細胞数（絶対計数）を割り出すことができます。その後、この細 胞数と容積単位あたりの全マイクロスフィアの数を乗じます。

AccuCheck Counting Beadsのシステムは、2つの蛍光マイク ロスフィアを既知の比率で使用するため、このビーズの比率か らアッセイのピペッティングの精度を検証できます。

装置のセットアップと校正

N/Aは該当なしの略。

*最大励起波長（Ex）と最大発光波長（Em）、単位はnm。

分類 製品名 レーザーの種類 Ex/Em* 容量 製品番号

アライメント AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads

for UV Lasers, 2.5 µm

UV 350–370/ _400–470 3 mL

A16502 AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads

for UV Lasers, 6.0 µm A16505

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for Blue Lasers, 2.5 µm

ブルー 488/515–660 3 mL

A16500 AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads

for Blue Lasers, 6.0 µm A16503

AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads for Red Lasers, 2.5 µm

レッド 633/645–680 3 mL

A16501 AlignFlow Flow Cytometry Alignment Beads

for Red Lasers, 6.0 µm A16504

サイズキャリブレーション Flow Cytometry Size Calibration Kit

（非蛍光マイクロスフィア） NA NA 1キット F13838

Flow Cytometry Sub-micron Particle Size

Reference Kit ブルー 505/515 1キット F13839 セルソーティングの

セットアップ Cell Sorting Set-Up Beads for UV Lasers UV 350–375/460 3 mL C16506

Cell Sorting Set-Up Beads for Blue Lasers ブルー 488/515 3 mL C16508 Cell Sorting Set-Up Beads for Green-Yellow

Lasers グリーン/イエロー 532, 561/575 3 mL C16509 Cell Sorting Set-Up Beads for Red Lasers レッド 633/680 3 mL C16507

コンペンセーション AbC Total Antibody Compensation Bead Kit NA NA 100 tests

25 tests A10497A10513 AbC Anti-Mouse Bead Kit NA NA 1キット A10344 AbC Anti-Rat/Hamster Bead Kit NA NA 1キット A10389 ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit NA NA 1キット A10346

細胞の絶対計数 AccuCheck Counting Beads ブルー/レッド 488/575-585

（ビーズ A） 10 mL PCB100 CountBright Absolute Counting Beads UV∼レッド UV to 635/385 to 800 5 mL C36950

抗原検出

抗原検出

図14. Attune NxT Acoustic Focusing Cytometerによるマウス調節性T

細胞と樹状細胞のマルチパラメータ（10色）解析

表4に挙げた表面抗原用一次抗体でC57BL/6脾細胞の表面を染色しまし た。 次 にFIX & PERM Cell Permeabilization Kit（ 製 品 番 号 GAS003、

GAS004）を用いてサンプルを固定および透過処理しました。透過処理中に、 PEコンジュゲートラット抗マウスFoxp3抗体で細胞内を染色しました。 FSC/SSCパラメータ（A、左側）を用いてリンパ細胞をゲーティングし、次 の 解 析 か らB220 発 現B細 胞 を 除 外 し ま し た（A、 右 側 ）。B220-_と CD45.2+_{のゲート内でCD3 の発現に基づいてT細胞を解析しました（A、} 下段左側）。共受容体CD4またはCD8の発現に基づいてCD3+ _T 細胞を2 つの集団に分離しました（B、左側）。CD4+ _{T細胞の中には、転写因子} Foxp3および細胞表面マーカーCD25（IL-2Rα）を発現している抑制性調 節性T細胞サブグループが存在します（B、右側）。CD3-_{細胞を分離し、レ} アなCD11c+ _MHCII+ プロフェッショナル抗原提示樹状細胞群を検出しまし た（C、左側）。さらに脾臓樹状細胞をそれぞれ特有の抗原提示特性を持つ CD11b+_およびCD8+_{樹状細胞サブセットに細分化しました（C、右側）。}

A

B

C

一次抗体

• 幅広い色素、タンパク質、InvitrogenTM _QdotTM_{抗体コンジュゲート} • 多様なアプリケーションで広範囲に特異性を発揮

• RUO、ASR、IVD試薬の揃った臨床および研究用の高品質製品

• 20,000 件以上の学術論文に引用 当社は、基礎研究と臨床研究の双方でターゲットに高い選択性 を示す多彩なRUO/ASR/IVD一次抗体を提供します。フローサ イトメトリー用にバリデーション済みのこれらの抗体は、CD マーカーやサイトカイン、ケモカイン、成長因子だけでなく、 腫瘍学や免疫学、細胞シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、 幹細胞などの研究用抗体にも特異性を発揮します。当社の蛍光 コンジュゲート一次抗体を用いたマルチカラーフローサイトメ トリーは、異種細胞群のサブセットの同定からレアイベントの 検出までの多様なアプリケーションにおいて、他の解析法より も短時間かつ少量のサンプルで複雑な細胞生物学の疑問にお答 えします。一次抗体コンジュゲートの検索には、ウェブサイト www.thermofisher.com/flow-searchantibodiesをご利用く ださい。

フルオロフォアの概要

当社の研究チームは1975年以来、Alexa Fluor色素やQdot標 識、InvitrogenTM _ZenonTM_{標識技術といった革新的な蛍光技術や} 細胞解析技術を次々と開発しているパイオニアです。当社は近 紫外線、可視光線、近赤外線の幅広いスペクトルをカバーする 蛍光標識製品を提供しています。この技術を一次および二次抗 体コンジュゲート技術に進化させ、より明るく安定的な蛍光コ ンジュゲートを開発しました。使用する装置を問わず、すべて のサンプル、すべてのフローサイトメトリーのランで最高のデー タを収集するよう作製された多彩な標識を提供します。フルオ ロフォア製品とその仕様については、表3のリストをご覧くだ さい。

標準的な蛍光色素とタンデム色素

当社は、Alexa Fluor、InvitrogenTM _{Pacific Blue}TM

、Pacific GreenTM 、 Pacific OrangeTM の各色素やフルオレセイン、蛍光タンパク質 （PE、PerCP、APC）などを標識した抗体、および11 種類の組 み合わせのタンデム色素といった幅広い蛍光標識一次抗体を取 り揃えています（表3）。この多様な色素製品は、今後装置の技 術が進歩し、より多くの蛍光色素が使用できるようになるにつ れ、ますます必要とされるでしょう（図14および表4）。

抗原検出

表

3.

フローサイトメトリー用フルオロフォア フルオロフォア レーザー 発光波長（nm） UV バイオレット 405 nm 488 nmブルー グリーン532 nm イエロー561 nm 633/635 nmレッド 抗体コンジュゲート Alexa Fluor 350 442 Alexa Fluor 405 421 Pacific Blue 455 Pacific Green 500 Pacific Orange 551 Alexa Fluor 488 519 フルオレセイン（FITC） 525 Qdot 605 605 Qdot 655 655 Qdot 705 705 Qdot 800 800 ペリジニンクロロフィル（PerCP） 678 PerCP-Cy5.5 695 R-フィコエリスリン（R-PE, PE） 575 PE-Texas Red 615 PE-Alexa Fluor 610 628 TRI-COLOR® _{(TC, PE-Cy5) 670} PE-Cy 5.5 694 PE-Alexa Fluor 700 723 PE-Cy 7 767 アロフィコシアニン（APC） 660 APC-Cy 5.5 694 APC-Cy 7 767 APC-Alexa Fluor 750 775 Alexa Fluor 647 668 Alexa Fluor 700 719 APC-Alexa Fluor 750 775 表

4. T

細胞と樹状細胞のマルチパラメータ解析（図

14

）で使用した製品 ターゲット 宿主動物 フルオロフォア レーザー 最大発光波長（nm） 製品番号

MHCII ラット Pacific Blue dye バイオレット 455 A14901

CD4 ラット Pacific Green dye バイオレット 500 C11207

B220 ラット Pacific Orange dye バイオレット 551 RM2630

CD11b ラット FITC ブルー 525 RM2801

Foxp3 ラット R-PE ブルー 575 N/A

CD3 ハムスター PerCP-Cy 5.5 ブルー 695 A14784

CD11c ハムスター PE-Cy 7 ブルー 767 A15849

CD25 (IL-2Rα) ラット APC レッド 660 N/A

CD45.2 マウス APC-Cy 7 レッド 767 A18642

CD8 ラット Alexa Fluor 700 レッド 719 MCD0829

*これらはすべて研究用にのみ使用できる製品です。他に記載のない限り、診断用には使用できません。

抗原検出

ターゲット* クローン

コンジュゲート‡

Qdot 605 Qdot 655 Qdot 705 Qdot 800

CD2 S5.5 Q10172 Q22140§ _Q22141§ _Q22142§ CD3e S4.1 (AKA 7D6) Q10012 Q22149§ Q10484§ Q10054 CD4 S3.5 Q10008 Q10007 _Q10060 Q22153§ S3.5 Q10480§ _Q10482§ _Q10485§ CD4† _{RM4-5 Q10092 Q22163}§ _Q22164§ _Q22165§ CD8 3B5 Q10009 Q10055 Q10059 Q22157§ 3B5 Q10481§ _Q10483§ CD10 MEM-78 Q10481§_{" Q22136}§ CD14 HIT2 Q10053 Q10064 TüK4 Q10013 Q10056 Q22137§ _Q22139§ CD19 SJ25-C1 Q10306 Q10179 Q22138§ _Q22162§ CD19† _{6D5 Q22160}§ _{Q10379 Q22161}§ CD27 CLB-27/1 Q10065 Q10066 Q22152§ CD38 HIT2 Q22150§ _Q10156 CD45 H130 Q10051 Q22154§ _{Q10062 Q22168}§ CD45R† _{RA3-6B2 Q22166}§ _{Q10176 Q22167}§ _Q22156§ CD45RA MEM-56 Q10047 Q10069 Q22155§ _Q10063 HLADR（クラス II） Tü36 Q10052 Q22158§ _Q22159§ アイソタイプコントロールマウス IgG2a Q10014 Q10015 Q10076 * すべての抗体の宿主動物は、他に記載のない限りマウスです。これらはすべて研究用にのみ使用できる製品です。他に記載のない限り、診断用には使用できません。 †宿主動物はラットです。 ‡すべての製品の容量は、他に記載のない限り100回分です。 §本製品の容量は25回分です。

Qdot

抗体コンジュゲート

• 励起波長405 nmまたは488 nmでバイオレットレーザーを 最大限に利用 • 既存の有機色素と組み合わせ、検出可能なパラメータを拡大 • タンデム色素のような経時劣化がなく、高い再現性を確保 • 発光スペクトルが狭域のため、単一の励起光源を使用する際 の補正が最小限 Qdot抗体コンジュゲートは、微量の細胞外タンパク質の検出に 最適の強い蛍光シグナルを発します。R-PEとほぼ同じサイズで 既存の有機蛍光標識とも組み合わせ可能なQdot抗体コンジュ ゲートは、最大発光波長未満のすべての波長で励起されますが、 UVレーザーまたはバイオレットレーザーが最適です。狭い左右 対称の発光特性を持つQdot抗体コンジュゲートは、単一励起 光源を使用する際の補正を最小限に抑えられます。またきわめ て長いストークスシフトを示すため、405 nmバイオレットレー ザーを使用したより効果的なマルチカラーアッセイが可能です。 フローサイトメトリー向けのマルチカラーを取り揃えたQdot 抗体コンジュゲート（図15および表5）は、これらのメリット により抗体の標識と染色に高い性能を発揮します。 Qdotナノクリスタルとそのフローサイトメトリーアプリケー ションについては、ウェブサイトwww.thermofisher.com/ flow-qdotをご覧ください。 図15. Qdot 標識の吸光および発光プロファイル （A）モル吸光係数で表したQdot標識の吸光スペクトル。（B）Qdot標識の 標準化した発光スペクトル。数字で示した各標識はパネルAと同じです。 波長（nm） 吸光係数 (cm –1M –1) 1,000,000 0 2,000,000 3,000,000 4,000,000 5,000,000 400 450 1 2 3 4 7658 500 550 600 650 700 750 800 1. Qdot® ₅₂₅ 2. Qdot® 565 3. Qdot® 585 4. Qdot® ₆₀₅ 5. Qdot® 625 6. Qdot® ₆₅₅ 7. Qdot® ₇₀₅ 8. Qdot® 800 波長（nm） 蛍光 シ グナ ル 450 500 550600650700 750 800850900 4 3 2 1 5 6 7 8

A

B

表

5. Qdot

一次抗体コンジュゲート選択ガイド

抗原検出

mCherry

ラットモノクローナル抗体コンジュゲート

mCherry蛍光タンパク質用にアフィニティー精製した当社のラットモノクローナル抗

体用蛍光コンジュゲート（表6）は、フローサイトメトリーで野生型および変異型の

mCherryまたはmCherry融合タンパク質を検出できます（図16）。完全長のmCherry

を免疫原として使用しているため、生成されたモノクローナルIgG2aアイソタイプ抗 体は野生型および変異型のmCherryを検出します。mCherry単量体赤色蛍光タンパク 質は、その優れた輝度と光安定性、成熟速度によって生理学的プロセスのモニタリン グや導入遺伝子発現の検出に不可欠の赤色蛍光タンパク質となりつつあります。

色素コンジュゲート レーザー色 励起/発光波長（nm） 製品番号

Pacific Blue dye バイオレット 405/455 M11238 Alexa Fluor 488 ブルー 488/519 M11239 Alexa Fluor 594 レッド 590/617 M11240 Alexa Fluor 647 レッド 650/668 M11241 表

6. mCherry

ラットモノクローナル抗体（クローン

16D7

）コンジュゲート 図16. mCherryタ ン パ ク 質 を 発 現 し、 Pacific Blue色素コンジュゲートラット抗 mCherry抗体（製品番号 M11238）で標識 した後、ゲーティングしたU2-OS細胞の ヒストグラム

サ ン プ ル は、Attune Acoustic Focusing

Cytometerを使用して405 nmレーザーで

励起、522/31 nmバンドパスフィルターで

シグナルを収集し解析しました。

抗体標識

当社は、蛍光シグナルの強いAlexa Fluor色素やQdotナノクリスタル、R-フィコエリ スリン（R-PE）だけでなく、ビオチンまでを10 µg未満から1 mg のIgG抗体に直接 結合させる多様な標識キットを提供しています。抗体に直接標識すると、１回の染色 で2つ以上の同種の抗体を使用できるようになります。お客様のアプリケーション向 けに最適化した標準的な標識試薬や、クリックケミストリ法による部位特異的な標識 が使用できます。ここでは、フローサイトメトリー用一次抗体の簡単な標識法を2種 類ご紹介します。詳しい説明と製品群については、ウェブサイト www.thermofisher. com/flow-antibodylabelingをご覧ください。

SiteClick

抗体標識システム

• 100 µgのIgG抗体を標識できる試薬を同梱 • わかりやすい段階的なプロトコール • 再現性の高い部位特異的な高性能標識試薬 • フローサイトメトリー用R-PE/Qdot 標識 InvitrogenTM _SiteClickTM システムは、抗体の部位選択的標識を身近なものにする新たな 技術を提案します。モジュール式のクリックケミストリによるこの標識法を使用する と、基本的にすべての抗体の重鎖N結合型グリカンを酵素標識できます。SiteClick部 位選択的標識法は、煩雑で不安定になりがちな従来の抗体標識法と異なり、抗体に高 い安定性と再現性で標識を結合させます。検出分子の選択肢も多彩です。 SiteClickシステムの部位選択的標識法（図17）は、従来のアミンまたはチオール反応 性標識試薬で起こりやすい抗原結合ドメインのかく乱を抑えます。修飾前に遺伝子操 作で標識部位を抗体に組み込む必要もありません。この部位選択的標識法は、特に内 部や周辺にリジン残基を含む抗体結合ドメインをモノクローナル抗体で標識する際に 効果的です。このようなドメインの標識では、抗原結合がかく乱されやすいためです。 またモノクローナル抗体は、還元システイン標識に使用されるジスルフィド結合還元 試薬に対する感受性に差があり、部分的に分離した抗体の断片が残ることで抗体との 結合能や収量が損なわれる危険もあるためです。 図17. SiteClick抗体標識システム 最初にβ-ガラクトシダーゼで重鎖N結合 型グリカンから末端ガラクトース残基を除 去し、修飾可能なすべてのGlcNAc残基を 露出させます。次に、末端 GlcNAc残基に

GalT（Y289L）酵素でGalNAzを酵素結合

させ、遊離末端GlcNAc残基をアジドタグ で活性化します。最後にアジド残基をジベ ンゾシクロオクチン（DIBO）で官能基化し たプローブ（Alexa Fluor 488 DIBO alkyne

など）と反応させると標識化抗体を作成で きます。抗体1分子あたり平均3∼ 3.5分 子のプローブが結合します。 N3 N3 N3 N3 アジド活性化抗体 抗体 • ポリクローナル抗体 • モノクローナル抗体 • 組み換え抗体 部位選択的に標識された抗体 β-ガラクトシダーゼ GalT(Y289L) UDP-GalNAz DIBO アルキン標識

Pacific Blue fluorescence

106 105 104 103 102 Count 0 100 200 300 400 500 600 700

抗原検出

当社はR-PEや幅広いQdot標識（表7）を用いた一連のSiteClick抗体標識キットをフ ローサイトメトリー用に設計し、提供しています。これらのキットは、初心者も熟練 研究者も毎回効率的に抗体を標識できるよう、わかりやすいワークフローを特長とし ています（図18）。また抗体グリカンは異なる種でも保存性が高いため、SiteClickTM 標識も異なる抗体に対して再現性がきわめて高く、新たな抗体を獲得するたびに標識 を最適化する必要がありません。 詳しくは、ウェブサイトwww.thermofisher.com/flow-siteclickをご覧ください。

Zenon

ラベリングテクノロジー

Zenonラベリングテクノロジーは、マウスIgG1、IgG2aおよびIgG2bアイソタイプ やウサギ、ヤギ、ヒトIgG抗体用の使いやすい多用途標識システムです。優れた 色素 だけでなく、他社製のフルオロフォア、ビオチン、発光タンパク質、酵素などにも使 用できます。Zenonは、直接化学標識法に比べて次のようなメリットがあります。 • スピード̶ラベリング手順はわずか10分間 • 効率性̶溶液中の一次抗体をほぼ100%標識 • 経済性̶ 1マイクログラム未満の抗体を標識 • 簡便性̶標識前後の抗体の精製不要 • 柔軟性̶ 1回の実験に複数の一次抗体を簡単に使用 Zenonラベリングテクノロジーは、フルオロフォア、ビオチン、酵素などを標識した Fabフラグメントを使用し、インタクトなIgG抗体のFc部位と結合して非共有結合 の標識複合体を形成します。Zenon標識試薬は、目的の抗体のFc部位に対する高い 親和性と選択性を確保するため、製造過程でアフィニティー精製されています。 Zenon標識法は、免疫選択性を利用しているため、複合体形成前に抗体サンプルから 外因性タンパク質やアミン含有バッファーを取り除く必要はありません。この技術で 標識した抗体複合体は、直接標識した一次抗体と同等の蛍光強度または酵素活性を示 します。 Zenon標識試薬は、幅広い色素（表8）を混合したり組み合わせたりできるため、フロー サイトメトリーで複数の色素と抗体を利用した実験が可能となり、柔軟性が高まりま す。Zenon抗体ラベリングテクノロジーおよびその他の抗体標識製品の詳細について は、ウェブサイトwww.thermofisher.com/flow-antibodylabelingをご覧ください。 CD4 陽性細胞 （ % ） SiteClick R-PE SiteClick Qdot 605 0 20 40 60 初心者 熟練研究者 市販品： R-PE 図18. 初心者にも熟練研究者にも効率的な抗体 標識 初心者と熟練研究者の双方がSiteClick Qdot 605

Antibody Labeling Kit とSiteClick R-PE Antibody

Labeling Kitを使用して抗CD4モノクローナル抗 体を3つずつ標識しました。これらの標識抗体で ひとりのドナーの血液から単離した CD4陽性細 胞を標識し、その後フローサイトメトリーで解析 しました。リファレンスサンプルには、市販の R-PE抗CD4抗体コンジュゲートを使用しまし た。データは細胞全体に対するCD4陽性細胞の 割合を、またエラーバーは各ユーザーが3つずつ 標識したサンプルのばらつきを示します。この初 心者は、これまでタンパク質の生体共役反応の経 験はありませんでしたが、熟練研究者と同等の効 率で標識できました。 製品名 レーザー色 発光波長（nm） 製品番号

SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit ブルー 578 S10467

SiteClick Qdot 525 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー 525 S10449

SiteClick Qdot 565 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン 565 S10450

SiteClick Qdot 585 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 585 S10451

SiteClick Qdot 605 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 605 S10469

SiteClick Qdot 625 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 625 S10452

SiteClick Qdot 655 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー 655 S10453

SiteClick Qdot 705 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー、レッド 705 S10454

SiteClick Qdot 800 Antibody Labeling Kit UV、バイオレット、ブルー、グリーン、イエロー、レッド 800 S10455

抗原検出

色素 Ex/Em* マウス IgG1 マウス IgG2a マウス IgG2b ウサギ IgG ヤギ IgG ヒト IgG

Alexa Fluor 色素† Alexa Fluor 350 346/442 Z25000 Z25100 Z25300 Alexa Fluor 405 402/421 Z25013 Z25113 Z25213 Z25313 Alexa Fluor 488 495/519 Z25002 Z25102 Z25202 Z25302 Z25602 Z25402 Alexa Fluor 546 556/573 Z25004 Z25104 Z25304 Alexa Fluor 555 555/565 Z25005 Z25105 Z25205 Z25305 Z25605 Alexa Fluor 568 578/603 Z25006 Z25106 Z25306 Alexa Fluor 594 590/617 Z25007 Z25107 Z25207 Z25307 Z25607 Z25407 Alexa Fluor 647 650/668 Z25008 Z25108 Z25208 Z25308 Z25608 Z25408 Alexa Fluor 680 679/702 Z25010 Z25110 Z25210 Alexa Fluor 700 696/719 Z25011 Alexa Fluor 750 749/775 Z25312 標準的色素† Pacific Blue 410/455 Z25041 Z25156 Pacific Green 411/500 Z11203 Pacific Orange 400/551 Z25256 フルオレセイン 494/518 Z25042 Z25342 ビオチン† ビオチン XX NA Z25052 Z25152 Z25252 Z25352 Z25452 フィコビリタンパク質およびタンデム色素‡ R-PE 496§_{/578 Z25055 Z25155 Z25255 Z25355 Z25455} R-PE-Alexa Fluor 610 496§_{/630 Z25020} R-PE-Alexa Fluor 647 496§_{/668 Z25021} アロフィコシアニン（APC） 650/660 Z25051 Z25151 Z25251 Z25351 Z25451 APC-zAlexa Fluor 750 650/775 Z25031 酵素‡ horseradish peroxidase; HRP NA Z25054 Z25154 Z25254 Z25354 Z25454 * おおよその最大励起波長と最大発光波長、単位はnm。

† Alexa Fluor色素、標準的色素、ビオチンなどと組み合わせた各Zenon標識キットの容量は、標識50回分です。1回の標識に必要なZenon試薬の量は、1µgの抗体を 標識できる量と定められています。 ‡ フィコビリタンパク質または酵素と組み合わせた各 Zenon 標識キットの容量は、標識25回分です。タンデム色素と組み合わせたキットの容量は、標識10回分です。 §他にも546 nmと565 nmに励起のピークがあります。 N/Aは該当なしの略。 詳細については、ウェブサイトwww.thermofisher.com/flow-zenonをご覧ください。 表

8. Zenon

標識キット選択ガイド