総合研究題目

総合研究題目

マウス腎臓における 2 つのマクロファージ集団の同定と その機能および糖尿病性腎症の新規治療法に関する研究

伊

^い

藤

^とう

誓

^せい

悟

^ご

（腎臓病学専攻）

防衛医科大学校

令和 2 年度

目次 頁

第

1

章 背景 … 1

第

2

章 研究

1

腎臓における機能に着目した

2

種類のマクロファージの同定と糖尿病性腎症への 関与

第

1

節 背景および目的 …

3

第

2

節 材料と方法

(1)

使用実験動物 …

5

(2) 尿アルブミン排泄量、血清クレアチニン値および随時血糖値の測定

… 5

(3)

腎臓および糸球体の細胞懸濁液の作成 …

5

(4) フローサイトメトリー

… 6

(5) Mφs

の

TNF-α

産生能の評価 …

7

(6) Mφs

の

ROS

産生の評価 … 8

(7) Mφs

の貪食能の評価 …

8

(8) 腎ホモジネートTNF-α

の測定 … 8

(9)

腎臓の組織学的評価 …

9

(10) 糸球体におけるWilms tumor 1

陽性細胞の評価 … 9

(11)

間質における

alpha smooth muscle actin

発現の評価 …

10

(12) 腎に限局した間歇的低線量放射線照射

… 11

(13)

統計解析 …

11

第

3

節 結果

(1)

腎における

2

種類の

Mφs

集団の同定 …

13

(2) 糖尿病の有無と腎TNF-α

および各

Mφs

機能の関連 … 13

(3) 糖尿病性腎症の進行に伴う尿アルブミン排泄とCD11b^high Mφs

の増加 … 14

(4)

腎症進行モデルにおける

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の性質 …

14

(5) 腎症進行モデルにおけるCD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の機能 … 15

(6)

糖尿病性腎症の進行と腎

Mφs

の機能変化 …

16

(7) 糸球体におけるMφs

の分布と

TNF-α

産生能 … 16

(8)

腎に限局した間歇的低線量放射線照射が腎症へ及ぼす効果 …

16

(9) 腎に限局した間歇的低線量放射線照射が腎Mφs

へ及ぼす効果 … 17

第

3

章 研究

2

糖尿病性腎症マウスモデルにおける

C-C

ケモカイン受容体タイプ

2

アンタゴニスト の治療効果

第

1

節 背景および目的 …

19

第

2

節 材料と方法

(1)

使用実験動物 …

21

(2) 尿アルブミン排泄量、血清クレアチニン値および随時血糖値の測定

… 21

(3)

腎臓の細胞懸濁液の作成 …

21

(4) フローサイトメトリー

… 21

(5) Mφs

の

TNF-α

産生能の評価 …

21

(6) Mφs

の

ROS

産生の評価 … 21

(7) Mφs

の貪食能の評価 …

21

(8) 腎臓の組織学的評価

… 21

(9)

糸球体における

Wilms tumor 1

陽性細胞の評価 …

21

(10) INCB3344

の投与 … 21

(11)

統計解析 …

21

第

3

節 結果

(1) INCB3344

が腎症および全身に及ぼす効果 … 23

(2) INCB3344

が腎臓の炎症や

Mφs

分布に及ぼす効果 …

23

(3) INCB3344

が腎

Mφs

の

M1/M2

フェノタイプや機能に及ぼす効果 … 23

第

4

章 研究

3

糖尿病性腎症マウスモデルにおける

L-

カルニチンの治療効果ならびに腎

Mφs

に与 える影響

第

1

節 背景および目的 …

25

第

2

節 材料と方法

(1)

使用実験動物 …

26

(2) 尿アルブミン排泄量、血清クレアチニン値および随時血糖値の測定

… 26

(3)

腎臓の細胞懸濁液の作成 …

26

(4) フローサイトメトリー

… 26

(5) Mφs

の

TNF-α

産生能の評価 …

26

(6) Mφs

の

ROS

産生の評価 … 26

(7) Mφs

の貪食能の評価 …

26

(8) 腎ホモジネートTNF-α

の測定 … 26

(9)

腎臓の組織学的評価 …

26

(10) 糸球体におけるWilms tumor 1

陽性細胞の評価 … 26

(11)

腎実質細胞および

Mφs

におけるミトコンドリア由来

ROS

産生の評価 …

26

(12) 近位尿細管細胞におけるミトコンドリア由来ROS

産生の評価 … 27

(13)

腎組織における

Superoxide dismutase 2

発現の評価 …

27

(14) L-カルニチンの投与

… 28

(15)

統計解析 …

28

第

3

節 結果

(1) 糖尿病モデルマウスの腎実質細胞および腎 Mφs

におけるミトコンド リア由来

ROS

の解析

… 29

(2) L-カルニチンが腎実質細胞および Mφs

のミトコンドリア由来

ROS

に及ぼす効果

… 29

(3) L-カルニチンが近位尿細管細胞のミトコンドリアに及ぼす効果

… 29

(4) L-

カルニチンが腎

SOD2

発現に及ぼす効果 …

30

(5) L-カルニチンが腎症へ及ぼす効果

… 30

(6) L-

カルニチンが腎

Mφs

の分布や機能に及ぼす効果 …

30

第

5

章 考察 …

32

第

6

章 結論 …

48

謝辞 …

50

略語一覧 … 51

引用文献 …

53

図 … 72

1

第

1

章 背景

糖尿病の重大な合併症のひとつである糖尿病性腎症は、先進国および発展途 上国の両方を含む全世界において、末期腎不全の主要な原因疾患であり

¹

、特に 本邦においては、血液透析に至る患者の

40%を占め、透析導入後の 5

年生存率 は

50%

程度とその予後は非常に不良である

²

。したがって、その病態の解明と治 療法の確立は、これらの患者の予後の改善において重要である。

糖尿病、アテローム性動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝炎（

non-alcoholic steatohepatitis

：

NASH

） に 至 る 基 礎 病 態 と し て メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム

（

metabolic syndrome

：

MetS

）が存在し

³

、近年、

MetS

に関連したマウス実験モ デルにおいては、マクロファージ（Mφs）およびそれが産生する

tumor necrosis

factor-α

（

TNF-α

）が慢性炎症を介し病態の進行に関連しており、特に接着因子で

あり補体

C3b

受容体でもある

CD11b

を高発現した

Mφs

（CD11b

^high Mφs）が関与

していることが報告されている

^4-7

。

CD11b^high Mφs

は、自己免疫性腎炎の病態へ の関与が報告されており、近年、腎臓病学の領域においても注目を集めている

Mφs

集団である

^8-10

。さらに、糖尿病性腎症については活性酸素種（

reactive oxygen

species：ROS）もまた、病態に関与していることが示唆されている¹¹

。

これまでに、関らは、肝臓において、

Mφs

をその表現型と機能に応じて、骨 髄由来（bone marrow-derived：BM-）Mφs と、組織固有（tissue resident：Res-）

Mφs

という

2

つの集団に分類した

^12-16

。さらに、

BM-Mφs

およびそれらの

TNF- α

産生が細菌感染に関連し、

NASH

病態の誘発に重要であることを示した

¹⁶

。ま

た、最近

10

年程の間に、肝臓の

Kupffer

細胞、脳のミクログリア、皮膚のラン

ゲルハンス細胞などの

Res-Mφs

は、胎児の卵黄嚢に由来し臓器固有の前駆細胞

より分化した細胞であることが示され、

BM-Mφs

と発生学的にも機能的にも異

なる集団であると捉えられるようになってきた

^17-20。

実際に、マウスの肝臓

Mφs

2

においては、

Res-Mφs

（

Kupffer

細胞）が

ROS

を生成し、細菌に対して強力な貪 食・殺菌作用を示す一方で、炎症性サイトカインの産生能は弱く、放射線抵抗性 の性質を持ち、対照的に、

BM-Mφs

は、貪食作用は弱いものの、強い炎症性サイ トカインの産生能を有し、放射線感受性の性質を持つことが明らかにされた

12,13,15

。

しかしながら、腎臓においては、様々な

Mφs

の分類が試みられているものの

21

、

BM-Mφs

と

Res-Mφs

という異なる

2

種類の

Mφs

という観点からの腎臓にお ける分布とその機能の解析はこれまでなされていない。

本研究は、腎臓における、これらの

2

種類の

Mφs

の分布と機能、およびそれ

らが糖尿病性腎症の病態に対し、いかに関わるかを明らかにし、またその結果を

踏まえ、新規の糖尿病性腎症に対する治療法を探索することを目的とする。

3

第

2

章 研究

1

腎臓における機能に着目した

2

種類のマクロファージの同定と糖尿病性腎症への関 与

第

1

節 背景および目的

近年、糖尿病性腎症の病態の根底には慢性炎症が存在し、マウスモデルを使 用した研究においては、

CD11b

陽性

Mφs

の関与が報告されている

^4,5

。

Mφs

を活 性化する因子として、

Mφs

に発現する

Toll

様受容体（toll-like receptor：TLR）が 知られており、これらは感染初期における病原体のパターン認識受容体として 作動し、

TLR4

はグラム陰性桿菌の菌体抗原であるリポ多糖（lipopolysaccharide ：

LPS

）を認識し、

TLR9

は細菌が普遍的にもつ非メチル化

CpG

モチーフを認識す る

²²

。TLR9 はマウスにおいては主に

Mφs

と

B

リンパ球に存在し、非メチル化

CpG

モチーフをもつ細菌

DNA

により刺激され活性化することで、

TNF-α

産生 に関与し、細菌感染時の初動免疫として機能する

^23,24

。なお、TLR9 活性化には 負の側面も存在し、敗血症性急性腎障害の病態に関与するとの報告もあり

²⁵

、私 どもの過去の研究においても、CpG 刺激により、TLR9 を介し、Mφs と

natural

killer T

（

NKT

）細胞が互いに協同して、急性の肝障害および腎障害を起こしたこ

とを示した

^26-28。

最近、これらの受容体は病原体の認識装置として感染防御に関わるのみなら

ず、代謝性疾患に生ずる全身性の慢性炎症の端緒としても機能している可能性

が指摘されており、特に、

TLR4

については、糖尿病性腎症の病態への関与が示

唆されている

^4,5,29

。他方、

TLR9

については、

MetS

および肥満症における、自然

免疫活性化より始まる慢性炎症病態の契機となりうることが示唆されているも

のの

³⁰

、糖尿病性腎症における関与については不明である。

4

以上を踏まえ、研究

1

においては、まず

2

型糖尿病モデルマウスと非糖尿病

正常マウスの腎臓における

Mφs

の存在と分布、それらの様々な機能とその違い

を解析した。その上で、

Mφs

における

TLR9

発現と糖尿病性腎症の病態との関

連について解析した。さらに、糖尿病性腎症の新規治療として腎臓への低線量放

射線照射を行い、その効果を検討した。

5

第

2

節 材料と方法

（1） 使用実験動物

雄

5-20

週齢の

2

型糖尿病モデル

db/db

マウス（

C57BLKS/J lar- +Lepr^db/+Lepr^db

マウス）と、その非糖尿病正常対照群として

misty

マウス（C57BLKS/J lar-m+/m+

マウス）を日本クレア（東京）から購入し使用した。全てのマウスは

12

時間置 きの明暗サイクル下かつ自由に飲水および摂餌可能な環境で飼育された。

本研究で用いた動物実験の手順は防衛医科大学校動物実験倫理委員会により 承認されており（承認番号：19004） 、全ての実験においては、動物の苦痛を最小 限化する最大限の努力を払うとともに、倫理委員会が定めたガイドラインと規 則を遵守して行った。

（2） 尿アルブミン排泄量、血清クレアチニン値および随時血糖値の測定

db/db

マウスは

5

、

8

、

12

、

16

、

20

週齢において、

misty

マウスは

8

、

12

、

16

、

20

週齢において、代謝ケージ（CL-0305、日本クレア）を用いて

24

時間、自由 飲水および摂餌可能な環境で蓄尿を行った。蓄尿中の飲水量ならびに摂餌量も 同時に測定された。得られた尿を

4℃・1500 rpm

で

5

分間遠心後、その上清を採 取し、マウス尿中アルブミン酵素結合免疫吸着測定法（

enzyme-linked immuno- sorbent assay：ELISA）キット（Albuwell M; Exocell, Philadelphia, PA）を用い定量

した。

血清クレアチニン（Cr）値と随時血糖値は、自由に摂餌可能な環境下で血液 サンプルを採取し、それぞれ酵素法により測定した（

SRL

、東京）。

（

3

） 腎臓および糸球体の細胞懸濁液の作成

マウスを深麻酔下で安楽死させ、生理食塩水による灌流後に腎臓を摘出した。

6

摘出した左腎臓を細切後に

37

℃の温浴槽で

40

分間コラゲナーゼ処理し（コラゲ ナーゼ；富士フイルム和光純薬、大阪） 、ステンレススチール製メッシュに濾過 して溶解した。その細胞溶解液を等張性

30%

パーコール溶液（

Sigma, St. Louis,

MO）に再懸濁し、等張性60%パーコール溶液に重層した後、15℃・1500 rpm

で

30

分間遠心分離した。遠心分離後に、

60%

と

30%

のパーコール溶液の間に生成 する単核球（mononuclear cell：MNC）が豊富に含まれる層を収集し、赤血球溶解 溶液に再懸濁した後、

40 μm

のポリプロピレン製セルストレーナーで濾過した。

本法は、肝臓

MNC

を採取するために確立された手法を改変したものである

²⁷

。 また、糸球体の細胞懸濁液については、

100 μm

および

70 μm

のセルストレー ナーを用いたシービング法による糸球体単離の後に、腎臓全体の細胞懸濁液と 同様に作成した。なお、その際は右腎を糸球体の解析に供し、左腎を腎全体の解 析に供することで、同一マウスにおいて糸球体と腎全体の細胞を比較出来るよ うにした。

（

4

） フローサイトメトリー

使用抗体と免疫細胞が持つ

Fc

受容体との非特異的結合を防止する目的で、腎 臓

MNC

を豊富に含む細胞懸濁液へ

Fc

ブロッカー（

Clone: 2.4 G2; BD Biosciences,

Franklin Lakes, NJ）を加え、4℃・15

分間インキュベートした。続いて、Mφs を

同定する目的で、

APC

標識抗

CD45

抗体（

Clone: 30-F11; eBioscience, San Diego, CA）

、FITC 標識または

PE

標識抗

F4/80

抗体（Clone: BM8; eBioscience） 、および

PE-Cyanine5

標識抗

CD11b

抗体（

Clone: M1/70; eBioscience

）を加え、

4

℃・

15

分 間インキュベートした。 腎に浸潤した

Mφs

の数を解析する検体に対しては、

Ly6G

を高発現する好中球を除外して解析を行う目的で、

PE

標識抗

Ly6G

抗体（

Clone:

1A8-Ly6g; eBioscience）を加え、Mφs

の表現型を解析する検体に対しては、各実

7

験目的に応じ、

PE

標識抗

Ly6C

抗体（

Clone: HK1.4; eBioscience

） 、

PE

標識

CD80

抗体 （Clone: B7-1; eBioscience） 、

PE

標識

CD206

抗体 （Clone: MR6F3; eBioscience） 、 および

PE

標識

TLR9

抗体（

Clone: J15A7; BD Biosciences

）をそれぞれ追加し、

同様にインキュベートした。なお、

CD206

抗体および

TLR9

抗体は、それぞれ細

胞内の

CD206

および

TLR9

発現の評価に供するため、これらの抗体のインキュ

ベ ー ト 直 前 に 、 細 胞 懸 濁 液 に 対 し 、

BD Cytofix/Cytoperm^TM Fixation/Permeabilization Kit

（

BD Biosciences

）を用い、細胞膜透過処置を行った。

抗体を反応させた細胞懸濁液は

Novocyte flow cytometer（ACEA Biosciences, San Diego, CA

）を用いて

fluorescence-activated cell sorting

（

FACS

）解析された。なお、

その際に、上記蛍光標識抗体のアイソタイプコントロール抗体を適時置いて使 用した。

（

5

）

Mφs

の

TNF-α

産生能の評価

腎細胞懸濁液を、温度応答性ポリマーを表面に固定化した

96

穴ポリエチレン プレート

UpCell

（セルシード、東京）に播種し、

in vitro

において

CpG

モチーフ 含有合成オリゴヌクレオチド（CpG oligodeoxynucleotides：CpG-ODN）20 ng/mL

（

HC4033: TCCATGACGTTCCTGATGCT; Hycult Biotechnology, Uden, Nederland

） を

TLR9

アゴニストとして添加し、37℃で

4

時間刺激培養した。なお、その際、

産生された

TNF-α

を

Mφs

内に蓄積させる目的で、細胞内のゴルジ体の働きを停 止させる作用のある

monensin（BD Biosciences）も共に添加した。その後、プレ

ート温度を

37

℃以下に低下させて細胞を剥離させた後に回収し、上記と同様に、

Fc

ブロッキングに続いて

APC

標識抗

CD45

抗体（30-F11） 、PE 標識抗

F4/80

抗

体（

BM8

）および

PE-Cyanine5

標識抗

CD11b

抗体（

M1/70

）を加えインキュベー

トし、細胞膜透過処置を行った後に

FITC

標識抗

TNF-α

抗体（Clone: MP6-XT22;

8

eBioscience

）でインキュベートした。なお、

MP6-XT22

のアイソタイプコントロ

ール抗体として、FITC 標識抗

Rat IgG1 kappa

抗体（Clone: eBRG1; eBioscience）

を使用した。

FACS

にて、対象の細胞集団において

TNF-α

のアイソタイプコント ロールと比較し、TNF-α 陽性と判断された細胞分画の平均蛍光強度（mean

fluorescent intensity

：

MFI

）を、細胞の

TNF-α

産生能として評価した。

（

6

）

Mφs

の

ROS

産生の評価

腎細胞懸濁液に

Fc OxyBURST™ Green Assay Reagent（Thermo Fisher Scientific,

Waltham, MA

）を添加し、

37

℃で

30

分間インキュベートした。本試薬は、

Fc

受

容体を介し細胞内に取り込まれ

ROS

を検知した際に、蛍光を発することから、

目的の細胞集団における

ROS

産生は、

OxyBURST

由来の蛍光が陽性である細胞 分画の

MFI

または、蛍光陽性分画が当該集団に占める割合として

FACS

にて解 析された。なお、本試薬を加えない検体の細胞をネガティブコントロールとして 使用し、OxyBURST 添加検体との差分を陽性と評価することで、各細胞が持つ 固有の自家蛍光を排除した。

（

7

）

Mφs

の貪食能の評価

腎細胞懸濁液を

UpCell

に播種し、in vitro で

Fluoresbrite YG Microspheres 0.75 μm

（

Polysciences, Warrington, PA

）を添加し

37

℃で

30

分間培養した。対象の細胞 集団の貪食能は、本

FITC

標識ビーズを貪食した結果、蛍光陽性となった細胞分 画が当該集団に占める割合として

FACS

にて解析された。なお、本検討において も、

FITC

標識ビーズを加えない検体をネガティブコントロールとして使用した。

（8） 腎ホモジネート

TNF-α

の測定

9

腎臓組織に対し、

1%

プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク、京都）

を添加した

radioimmunoprecipitation

（RIPA）バッファー（富士フイルム和光純薬）

を細胞溶解バッファーとして加え、組織を機械的に破砕してタンパク抽出を行 った。抽出された各マウスのタンパクサンプル中の

TNF-α

濃度を測定するため、

TNF alpha

マウス

ELISA

キット（

BMS607-3; Thermo Fisher Scientific

）を用いた。

同時に、タンパクサンプルにおける総タンパク濃度を、Pierce BCA タンパクア ッセイキット（

Thermo Fisher Scientific

）を用いて測定し、これで

TNF-α

濃度を 除することで、腎臓組織タンパク

1g

あたりの

TNF-α

レベルを定量した。

（9） 腎臓の組織学的評価

摘出した右腎臓を

4%

パラホルムアルデヒド溶液にて固定後に、パラフィンに て包埋し

4 μm

の組織切片を作成した。

組織切片は、

Periodic Acid-Schiff

（

PAS

）染色および

Masson trichrome

染色を行 い、光学顕微鏡

BZ-X710

（キーエンス、東京）にて観察した。糖尿病性腎症に伴 うメサンギウム基質拡大を評価するため、それぞれのマウスの

PAS

染色標本に おいて

40

倍拡大下で

10

個の糸球体を無作為に選び、正常糸球体は

0

点、メサ ンギウム領域が糸球体内に占める割合が

25%

までは

1

点、

25-50%

は

2

点、

50-

75%は3

点、

75%以上は4

点なる糸球体スコアを用い

0-5

点で半定量的に評価し

た

^4,31,32

。また、糖尿病性腎症に伴う腎線維化を評価するため、

Masson trichrome

染色標本において、20 倍拡大下で

4

視野を無作為に撮影した後に

ImageJ-Fiji

を 用いて線維化領域を抽出し、線維化率を算出した

³³

。

（

10

） 糸球体における

Wilms tumor 1

陽性細胞の評価

Wilms tumor 1（WT-1）は糸球体ポドサイトの核に発現することから、糸球体

10

における

WT-1

陽性細胞数を観察することで、糸球体障害におけるポドサイト残 存の程度を評価することが出来る

⁷

。

パラフィン包埋切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノールで親水化の後、

pH 6

クエン酸緩衝液に浸漬し、98℃で

1

時間、抗原賦活化を行った。ブロッキ ング・ワン（ナカライテスク）にて非特異的結合阻害を行った後、一次抗体とし て

100

倍希釈したウサギ由来抗

WT-1

ポリクローナル抗体（SC-192; Santa Cruz

Biotechnology, Dallas, TX

）を

4

℃にて一晩反応させた。

Dako REAL Peroxidase- Blocking Solution（Agilent, Santa Clara, CA）にて組織中の内因性ペルオキシダー

ゼ阻害を行った後に、二次抗体としてヒストファインシンプルステインマウス

MAX-PO（R）（ニチレイ、東京）を室温にて 40

分反応させ、DAB+ Substrate

Chromogen System

（

Agilent

）を用いジアミノベンジジン染色をした。核染色はマ イヤーヘマトキシリン（富士フイルム和光純薬）を用い、その後、エタノールで 脱水、キシレンにて透徹し、封入した。

各検体において

40

倍拡大下で

10

個の糸球体を無作為に選び、各糸球体にお ける

WT-1

陽性細胞数を数え、その平均値を算出した

⁷

。

（

11

） 間質における

alpha smooth muscle actin

発現の評価

alpha smooth muscle actin（α-SMA）は線維芽細胞に発現し、腎間質線維化の際

に発現増加がみられることが知られている

³⁴

。

パラフィン包埋切片を脱パラフィン、親水化の後、pH 6 クエン酸緩衝液にて

98

℃で

1

時間、抗原賦活化を行った。非特異的結合阻害後に、一次抗体として

1000

倍希釈したウサギ由来抗

α-SMA

モノクローナル抗体（Clone: EPR5368;

abcam, Cambridge, UK

）を

4

℃にて一晩反応させた。組織中の内因性ペルオキシ

ダーゼ阻害を行い、二次抗体としてヒストファインシンプルステインマウス

11

MAX-PO

（

R

） （ニチレイ）を室温にて

40

分反応させた後に、ジアミノベンジジ

ン染色をした。核染色はマイヤーヘマトキシリンにて行い、脱水、透徹の後に封 入をした。

各検体において

20

倍拡大下で

4

視野を無作為に撮影した後に

ImageJ-Fiji

を用 いて

α-SMA

陽性領域を抽出し、陽性面積率を算出した

³³

。

（

12

） 腎に限局した間歇的低線量放射線照射

腎臓に限局した低線量放射線照射は、

X

線照射装置

MBR-1520R-3

（HITACHI、

茨城）を使用し、

db/db

マウスに対し

8

週齢から開始し

1

週間毎に

1

回

1 Gy

の 照射で

16

週齢まで行われた（全

8

週間） 。放射線量や照射頻度については、先行 研究を参考にし、放射線照射による全身への悪影響を極小化するべく決定され

た

^15,35

。放射線照射は、被照射マウスを放射線透過性のプラスチック製円筒容器

内に固定し、その外側から両側の腎臓以外の領域を厚さ

2 mm

の鉛板で遮蔽する ように覆う照射ユニットを作成し、本ユニットを照射装置内に静置し、放射線照 射装置を稼働することにより行われた。なお、本

X

線照射装置において、放射 線被ばくを防ぐには、厚さ

2 mm

の鉛板で十分であることは、装置内において、

同鉛板の遮蔽下では放射線の検知が出来ないことをもって確認した。

（

13

） 統計解析

結果は平均±標準誤差で示した。統計学的分析には、JMP Pro バージョン

14

（

SAS Institute Japan

、東京）を用い、統計学的有意差の検定には、

2

群間かつ、

それぞれの群に対応がない場合は

Student

の

t

検定を使用し、対応がある場合は

paired t

検定を使用した。また、

3

群以上の場合は

Tukey-Kramer

の

honestly significant difference (HSD)

検定を使用した。全ての分析において、有意水準

5%

12

以下の場合を有意差ありとした。

13

第

3

節 結果

（1） 腎における

2

種類の

Mφs

集団の同定

まず、一般的なマウス腎の

Mφs

分布を同定するために、非糖尿病

misty

マウ スの腎を用いて解析を行った。Mφs やリンパ球を含む細胞集団は、好中球を除 くべく、前方散乱（

forward scatter

：

FSC

）と側方散乱（

side scatter

：

SSC

）によ ってゲートされた（図

1A）

。ゲートされた細胞集団は、免疫細胞以外の尿細管 細胞等の腎実質細胞を依然として含むことから、それらの細胞を除外し

Mφs

と リンパ球のみを解析の対象とするため、さらに汎白血球マーカーである

CD45

陽性の細胞集団をゲートした（図

1B

） 。同集団を、汎

Mφs

マーカーである

F4/80

と接着因子である

CD11b

によって展開したところ、F4/80

^-CD11b^-

で表現 されるリンパ球に加えて、

F4/80^low CD11b^high

を示す細胞集団（以下、

CD11b^high Mφs）およびF4/80^high CD11b^low

を示す細胞集団（以下、CD11b

^low Mφs）が同定

された（図

1C

） 。次に、それぞれにおける、骨髄由来マーカー

Ly6C

の発現を検 討したところ（図

1D

および

E）

、CD11b

^high Mφs

については、陽性率

61.4

±

0.7%

であったが、

CD11b^low Mφs

については、陽性率

3.0

±

0.3%

にとどま った（図

1F）

。なお、2 型糖尿病モデルである

db/db

マウスにおいても、これら

Mφs

における

Ly6C

発現は同様であった（図

1G

） 。以上から、

CD11b^high Mφs

は、骨髄由来（Bone marrow-derived：BM-）Mφs の性質をもち、CD11b

^low Mφs

は組織固有（

Tissue resident

：

Res-

）

Mφs

の性質をもつと考えた。

（

2

） 糖尿病の有無と腎

TNF-α

および各

Mφs

機能の関連

16

週齢の糖尿病モデル

db/db

マウス群と、非糖尿病

misty

マウス群における

比較を行った。腎に浸潤した

CD11b^high Mφs

中の

TLR9

発現は、

db/db

群におい

て、misty 群より高く（図

2A）

、CD11b

^low Mφs

でも同様であった（図

2B）

。腎ホ

14

モジネートの

TNF-α

は、

db/db

群において、

misty

群より著しく高かった （図

2C

） 。

CD11b^low Mφs

中の

ROS

産生細胞率も、

db/db

群において

misty

群より高く（図

2D

） 、

CD11b^low Mφs

中のビーズ貪食細胞率もまた同様に、

db/db

群が

misty

群よ り高かった（図

2E）

。

（3） 糖尿病性腎症の進行に伴う尿アルブミン排泄と

CD11b^high Mφs

の増加

db/db

マウス

5-20

週齢と

misty

マウス

8-20

週齢を用い、

5

・

8

・

12

・

16

・

20

週 齢の時点において尿アルブミン排泄量を測定した後に、腎白血球に占める

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の割合を解析した。以後の実験では、これらのマ ウス群を

16

週齢以上の加齢群と

12

週齢以下の若齢群に分けて、 解析を行った。

尿アルブミン排泄量については、

db/db

マウス加齢群は

db/db

マウス若齢群に比 べ有意に多かったが（図

3A）

、misty マウスにおいては、加齢群および若齢群共 に尿アルブミン排泄をほぼ認めなかった。腎

CD11b^high Mφs

（

%

）についても、

db/db

マウスにおいては加齢群が若齢群に比べ有意に高かったが、misty マウス

の加齢群と若齢群との間に差を認めなかった（図

3B

、

C

および

D

） 。

db/db

加齢群においては、尿アルブミン排泄量が増加していたことから、糖尿

病性腎症の進行期にあると考えられた。同時に、腎への

CD11b^high Mφs

浸潤の増 加が観察されたことから、以後は、腎症進行と腎

Mφs

の関連を検討する目的で、

db/db

加齢群に着目して解析を行い、それと週齢を一致させた

misty

マウスを正

常対照群として使用することにした。

（4） 腎症進行モデルにおける

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の性質

db/db

加齢群において、

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

における

M1

マー

カー（CD80）および

M2

マーカー（CD206）の発現を、フローサイトメトリーを

15

用いて検討した（図

4A-E

） 。

CD80

発現についての

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

における代表的な結果を図

4B

に、

CD206

発現についての結果を図

4C

に示 す。

Mφs

の

CD80

発現は、

CD11b^high Mφs

において、

CD11b^low Mφs

に比べ有意に 高かったが（38.0±2.8%および

23.3±1.8%）（図 4D）、CD206

発現は低かった

（

15.9

±

2.8%

および

53.8

±

3.0%

） （図

4E

） 。これらの結果は

misty

マウスでも同 様に観察された（データ示さず） 。

（5） 腎症進行モデルにおける

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の機能

Mφs

の機能として、

TNF-α

産生能、

ROS

産生および貪食能を評価した。

TNF- α

産生能は、 腎

Mφs

における

TLR9

の糖尿病性腎症への関与を検討する目的で、

採取した

Mφs

を

TLR9

アゴニストである

CpG-ODN

とゴルジ体機能阻害薬

（monensin）で培養し、各

Mφs

内に

TLR9

を介した刺激により産生された

TNF- α

を蓄積させ、これを

FACS

で測定することで評価した（図

5

） 。

db/db

加齢群において、これら

Mφs

の機能を

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

に分けて解析した結果を示す（図

6A-G

） 。

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の

TNF- α

産生能、ROS 産生およびビーズ貪食能の代表例を、それぞれ、図

6B、C

およ び

D

に示している。肝臓の

Mφs

と同様に

^14,16、TNF-α

産生能を示す

MFI

は

、

CD11b^high Mφs

において、CD11b

^low Mφs

に比べ高かった（29406±2388 および

14668

±

1036

） （図

6E

） 。

ROS

産生細胞の

MFI

は、CD11b

^high Mφs

において、CD11b

^low Mφs

に比べ低く

（

33864

±

4461

および

70535

±

8319

） （図

6C

） 、さらに細胞集団に占める

ROS

産 生細胞の割合も同様に低かった（46.6±4.4%および

79.0±2.8%）

（図

6F）

。

貪食細胞の割合も同様に、

CD11b^high Mφs

において、

CD11b^low Mφs

に比べ低か

った（0.78±0.18%および

3.92±0.50%）

（図

6G）

。

16

（

6

） 糖尿病性腎症の進行と腎

Mφs

の機能変化

CD11b^high Mφs

中の

TLR9

発現は、db/db 加齢群において若齢群より有意に高 かったが（図

7A

） 、

CD11b^low Mφs

中の

TLR9

発現は、

db/db

加齢群と若齢群との 間に差は無かった（図

7B）

。

CD11b^high Mφs

の

TNF-α

産生能は、

db/db

加齢群において若齢群より高かった

（図

7C）

。

ROS

産生

CD11b^low Mφs

の割合は、

db/db

加齢群において若齢群より高く（図

7D）

、貪食

CD11b^low Mφs

の割合も同様に、db/db 加齢群が若齢群より高かった

（図

7E

） 。

（

7

） 糸球体における

Mφs

の分布と

TNF-α

産生能

db/db

マウス

16

週齢の同一個体から得た糸球体ならびに腎全体における

Mφs

分布について解析した。糸球体においては、

Mφs

のほとんどを

CD11b^high Mφs

が 占めていた（図

8A）

。さらに、糸球体由来の

CD11b^high Mφs

の

TNF-α

産生能は、

腎全体由来のそれと比べ有意に高かった（図

8B

および

C

） 。

（

8

） 腎に限局した間歇的低線量放射線照射が腎症へ及ぼす効果

腎限局放射線照射は、

db/db

マウスに対し、

8

週齢から

16

週齢までの間、

1

週 間に

1 Gy

ずつ、計

8

週間行われた。その際に作成し使用した遮蔽装置を示す（図

9A

および

B）

。図

9A

は斜め上方から撮影した装置、図

9B

は横から撮影した装 置の画像である。

尿アルブミン排泄量は、照射群（Irradiation：

Ir

群）において、非照射群（Non-

irradiation

：

Non-ir

群）よりも有意に少なかった（図

9C

）。血清クレアチニン（

Cr

）

は両群間で差は無く（図

9D）

、末梢血白血球数、体重、飲水量、摂餌量や尿量も

17

差を認めなかった（データ示さず） 。しかしながら、腎重量および腎に浸潤した 白血球数は、

Ir

群において、

Non-ir

群よりも有意に少なかった（図

9E

および

F）

。 これは、放射線照射が、糖尿病性腎症による炎症を伴う腎腫大を改善した結果と 考えられた。

糸球体病変について、

PAS

染色切片を用いて評価したところ、

Ir

群において メサンギウム増加・硬化所見の改善（図

10A

および

B）ならびに有意な糸球体

スコアの低下がみられた（図

10C

） 。さらに、糸球体

WT-1

陽性細胞数は、

Ir

群 において有意に多かった（図

10D-F）

。

間質病変について、

Masson trichrome

染色切片を用いて評価したところ、

Ir

群 において有意に腎線維化が少なかった（図

11A-C）

。また、α-SMA の陽性面積率 については、両群間に差は見られなかった（図

11D-F

） 。

（

9

） 腎に限局した間歇的低線量放射線照射が腎

Mφs

へ及ぼす効果

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の分布が

Non-ir

群と

Ir

群の間で異なっており

（図

12A

） 、その比は

Ir

群に有意に低かった（図

12B

） 。各

Mφs

の片腎あたりの 浸潤数については、Ir 群において、Non-ir 群よりも

CD11b^high Mφs

数が有意に少 なく（図

12C

） 、

CD11b^low Mφs

は少ない傾向にあった（図

12D

） 。これは、腎にお いても

CD11b^high Mφs

が放射線感受性であり、

CD11b^low Mφs

が放射線抵抗性であ ることを示すと考えられた。この現象は、糖尿病である

db/db

マウスほど明らか ではなかったが、非糖尿病マウスである

misty

マウスにおいても観察された（デ ータ示さず） 。

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

中の

TLR9

発現は、Ir 群において、Non-ir

群よりも有意に低かった（図

13A

および

B

） 。さらに、

CD11b^high Mφs

の

TNF-α

産生能、腎ホモジネートの

TNF-α

や

ROS

産生

CD11b^low Mφs

の割合は、Ir 群に

18

おいて、

Non-ir

群よりも明らかに低かった。 （図

13C

、

D

および

E

） 。しかしなが ら、特記すべきことに、貪食

CD11b^low Mφs

の割合は、Ir 群において、Non-ir 群 よりも明らかに高かった（図

13F

） 。

以上の結果をまとめると、表のようになる。

19

第

3

章 研究

2

糖尿病性腎症マウスモデルにおける

C-C

ケモカイン受容体タイプ

2

アンタゴニストの 治療効果

第

1

節 背景および目的

C-C

ケモカイン受容体タイプ

2（C-C chemokine receptor type 2：CCR2）は単球

の遊走を促進させ、慢性炎症性疾患における治療標的であることが示されてい る。腎臓病学の領域においても、この

CCR2

のリガンドである単球走化性タン パク質

1

（

Monocyte chemotactic protein-1

：

MCP-1

、別名

CCL2

）の中和作用をも つ薬剤

NOX-E36

（emapticap pegol）による

MCP-1

の阻害が、糖尿病性

apoE

ノッ クアウトマウスにおいて、炎症性

Mφs

の腎への浸潤と分化を抑制し、糖尿病性 腎症の改善効果を示したことが報告されている

³⁶

。さらに、

CCR2

を直接阻害す る検討として、

CCR2

アンタゴニストである

RS102895

を

db/db

マウスに投与し たところ、耐糖能の改善とともに、腎臓への

Mφs

浸潤の抑制、酸化ストレス減 少による糸球体におけるネフリンの保護、尿蛋白の減少等の腎症改善効果がみ られたことが報告されている

³¹

。これまで、

CCR2

アンタゴニストとしては、様々 な物質が報告されているが

^6,31,37,38

、

CCR2

アンタゴニストには、げっ歯類に対す る交叉反応性の欠如という固有の特性が存在することが報告されていることか ら、

CCR2

への選択的結合性を高めた薬剤を選択することが、その治療効果を検 討する上で重要である

³⁹

。

CCR2

アンタゴニストの一つである、

INCB3344

（別名、

15a

）は半数阻害濃度

10 nM

でマウス単球への

MCP-1

の結合を阻害し、ERK リン酸化や化学走化性と

いった

MCP-1

を介した作用に対する用量依存的な阻害効果を示す

³⁹

。また、

INCB3344

は

CCR2

に対する高い選択性と、げっ歯類での良好なバイオアベイラ

20

ビリティをもち、マウスモデルにおける臓器への

Mφs

浸潤の用量依存的な阻害 をもたらすことが報告されている

³⁹

。さらに、

INCB3344

は、約

5nM

の解離定数 である高親和性でヒトの

CCR2

にも結合可能であり、その結合は迅速かつ可逆 的であることから、ヒトへの臨床応用も期待可能な薬剤である

^40,41

。近年では、

INCB3344

が、その長い薬物動態的半減期により、高い

CCR2

占有率を維持する

ことで、これを投与された

apoE

ノックアウトマウスにおいて、循環血中の

CCR2

陽性単球数と頚動脈および大動脈起始部のアテロームサイズの減少がみられた ことが報告されている

⁴¹

。

そこで、

INCB3344

を糖尿病マウスモデルに投与し、腎における

Mφs

の分布

や機能の変化、それに関連した糖尿病性腎症に対する治療効果が得られるかを

検討した。

21

第

2

節 材料と方法

（1） 使用実験動物

（

2

） 尿アルブミン排泄量、血清クレアチニン値および随時血糖値の測定

（3） 腎臓の細胞懸濁液の作成

（

4

） フローサイトメトリー

（5）

Mφs

の

TNF-α

産生能の評価

（

6

）

Mφs

の

ROS

産生の評価

（7）

Mφs

の貪食能の評価

（

8

） 腎臓の組織学的評価

（9） 糸球体における

Wilms tumor 1

陽性細胞の評価 以上については、すべて研究

1

と同様の手法で行った。

（

10

）

INCB3344

の投与

Bot

らが検討し得られた結果より、治療効果が見込める投与量として

5 mg/kg

体重

/

日を設定した

⁴¹

。マウス投与用の薬液は、

INCB3344

を

10%

ジメチルスルホ キシド（DMSO）含有生理食塩水に溶解し、1 回の

INCB3344

投与量が上記にな り、かつ

1

回の投与液量が

10mL/kg

体重になるように作成した。治療群

（INCB3344 群）においては、これを週

3

回、

8

週齢から

16

週齢の

8

週間、腹腔 内注射し、対照群（

Vehicle

群）においては、同量の

10%DMSO

を同様に腹腔内 注射した。

（11） 統計解析

研究

1

と同様の方法で行った。なお、

misty

マウスにおける

Vehicle

群および

INCB3344

群、

db/db

マウスにおける

Vehicle

群および

INCB3344

群の計

4

群を対

22

象に解析する際、

misty-INCB3344

群と

db/db-Vehicle

群との比較については、有

意差を表記しなかった。

23

第

3

節 結果

（1）

INCB3344

が腎症および全身に及ぼす効果

尿アルブミン排泄量は、

db/db

マウスの

10%DMSO

腹腔内投与群（

db/db- Vehicle

群）において、misty-Vehicle 群よりも有意に多く、INCB3344 腹腔内投 与群（

db/db-INCB3344

群）において、

db/db-Vehicle

群よりも有意に少なかった

（図

14A）

。血清

Cr

値も、db/db-INCB3344 群において、db/db-Vehicle 群よりも 有意に低かった（図

14B

） 。随時血糖値、末梢血白血球数および体重は、

misty

および

db/db

マウス内の両群間に差は無かった（図

14C、14D

および

14E）

。

糸球体病変について、

PAS

染色切片を用いて評価したところ、

db/db-

INCB3344

群において、メサンギウム増加・硬化所見の改善がみられ（図

15A

および

B

） 、有意に糸球体スコアが低下していた（図

15C

） 。さらに、糸球体

WT-1

陽性細胞数は、db/db-INCB3344 群において有意に多かった（図

15D-F）

。

（2）

INCB3344

が腎臓の炎症や

Mφs

分布に及ぼす効果

腎重量および腎に浸潤した白血球数は、

misty

および

db/db

マウス内の両群間 で有意な差を認めなかったが（図

16A

および

B）

、CD11b

^highMφs

数は、db/db-

Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも有意に多く、

db/db-INCB3344

群にお いて

db/db-Vehicle

群よりも有意に少なかった（図

16C）

。なお、CD11b

^lowMφs

数については

misty

および

db/db

マウス内の両群間に差を認めなかった（図

16D）

。

（3）

INCB3344

が腎

Mφs

の

M1/M2

フェノタイプや機能に及ぼす効果

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

における

M1

マーカー（

CD80

）発現は、

db/db-Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも有意に高く、db/db-INCB3344 群

24

において

db/db-Vehicle

群よりも有意に低かった（図

17A

および

B

） 。さらに、

CD11b^high Mφs

における

M2

マーカー（CD206）発現は

misty

および

db/db

マウス 内の両群間に差はみられなかったが（図

17C

） 、

CD11b^low Mφs

における

CD206

発 現は、db/db-INCB3344 群で有意に高かった（図

17D）

。

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

における

TLR9

発現は、

db/db-Vehicle

群に 比べ、db/db-INCB3344 群において有意に低かった（図

18A

および

B）

。

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

における

TNF-α

産生能は、

db/db-Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも有意に高く、

db/db-INCB3344

群において

db/db-

Vehicle

群よりも有意に低かった（図

19A

および

B

） 。さらに、腎ホモジネートの

TNF-α

も同様の結果であった（図

19C）

。また、ROS 産生 CD11b

^low Mφs

の割合 は、

misty-INCB3344

群および

db/db-INCB3344

群において、各マウス種の

Vehicle

群に比べ有意に少なかった（図

19D）

。なお、貪食

CD11b^low Mφs

の割合は

misty

および

db/db

マウス内の両群間に差はみられなかった（図

19E

） 。

25

第

4

章 研究

3

糖尿病性腎症マウスモデルにおける

L-カルニチンの治療効果ならびに腎 Mφs

に与 える影響

第

1

節 背景および目的

糖尿病性腎症マウスモデルにおいては、その病態にミトコンドリア機能異常 が関与し

⁴²

、ミトコンドリアに局在し、ミトコンドリア由来

ROS

の消去系酵素 として働く

Superoxide dismutase 2

（

SOD2

）

⁴³

のダウンレギュレーションが起こ っていることが報告されている

^44-46

。同様に、高脂肪食を摂取した肥満マウスモ デルでは、ミトコンドリア機能異常によるミトコンドリア由来の

ROS

産生亢進 が起こり、ミトコンドリア内の脂質

β

酸化が阻害され、細胞内に脂質が集積し た結果、腎糸球体における血管内皮細胞および足細胞の障害により蛋白尿が誘 発され、尿細管細胞の障害により間質の炎症が生じることが示されている

⁴⁷

。ま た、敗血症マウスモデルにおいては、循環血中のミトコンドリア由来

DNA

（mtDNA）が

TLR9

活性化を引き起こし、敗血症性腎障害を増悪させるとの報 告もある

²⁵

。近年、

L-

カルニチン（

L-carnitine

：

LC

）は透析患者におけるカルニ チン欠乏症や、それに由来する赤血球造血刺激因子製剤抵抗性貧血に対し使用 されるようになってきており、脂肪酸がミトコンドリアに利用される際の担体 として働くとともに、ミトコンドリア保護効果を持つことが知られ

^48-50

、SOD2 の回復に寄与する可能性も報告されている

^51-54

。そこで、

L-

カルニチンを、肥満 を有する

2

型糖尿病マウスモデルに投与し、腎におけるミトコンドリア保護効 果を通じて、糖尿病性腎症に好ましい効果が得られるかを検討した。その際に、

腎

Mφs

の分布や機能について影響を及ぼすか併せて検討した。

26

第

2

節 材料と方法

（1） 使用実験動物

（

2

） 尿アルブミン排泄量、血清クレアチニン値および随時血糖値の測定

（3） 腎臓の細胞懸濁液の作成

（

4

） フローサイトメトリー

（5）

Mφs

の

TNF-α

産生能の評価

（

6

）

Mφs

の

ROS

産生の評価

（7）

Mφs

の貪食能の評価

（

8

） 腎ホモジネート

TNF-α

の測定

（9） 腎臓の組織学的評価

（

10

） 糸球体における

Wilms tumor 1

陽性細胞の評価 以上については、すべて研究

1

と同様の手法で行った。

（11） 腎実質細胞および

Mφs

におけるミトコンドリア由来

ROS

産生の評価 腎細胞懸濁液に

MitoSox™ red mitochondrial superoxide indicator

（

Thermo Fisher

Scientific）を添加し、37℃で10

分間インキュベートした。本試薬は、細胞内の

ミトコンドリア内に取り込まれ

ROS

を検知した際に、蛍光を発する性質を持つ ことから、解析対象の細胞集団のミトコンドリア由来

ROS

産生は、当該集団に

おける

MitoSox

の蛍光陽性細胞が集団の全細胞に占める割合（

MitoSox

陽性細胞

数/対象集団の全細胞数）として

FACS

にて評価された（同時に、対象の細胞群 の

MFI

も評価した）。なお、本試薬を加えなかった検体を対照として使用し、

MitoSox

添加検体と比較することで、細胞固有の自家蛍光を排除し、MitoSox に

よる蛍光陽性細胞を同定した。

27

（

12

） 近位尿細管細胞におけるミトコンドリア由来

ROS

産生の評価

腎細胞懸濁液に

MitoSox™をインキュベートした後に、Fc

ブロッカー（Clone:

2.4 G2, BD Biosciences

）による非特異的ブロッキングを行い、

APC

標識抗

CD45

抗体（Clone: 30-F11,eBioscience）および近位尿細管細胞のマーカーである

Lotus tetragonolobus lectin

（

LTL; Vector Laboratories, Burlingame, CA

）を加え

⁵⁵

、

4

℃下 で

15

分間インキュベートした。FACS 解析においては、まず非白血球の細胞群 として

CD45

陰性の細胞群を同定し、その中で

LTL

陽性の細胞集団を近位尿細 管細胞として同定した。その際、

LTL

を加えない検体を同時に解析し、細胞固有 の自家蛍光を排除した。近位尿細管細胞中の

MitoSox

陽性細胞率を前項の手法 により評価した。

（13） 腎組織における

Superoxide dismutase 2

発現の評価

抗

SOD2

抗体を用いた免疫組織化学により、腎（特に尿細管）における

SOD2

発現を評価した。

まず、パラフィン包埋切片を脱パラフィン、親水化の後、

pH 6

クエン酸緩衝 液にて

98℃で 1

時間、抗原賦活化を行った。非特異的結合阻害後に、一次抗体 として

1000

倍希釈したウサギ由来抗

SOD2

ポリクローナル抗体 （

ab13534, abcam

）

を

4℃にて一晩反応させた。組織中の内因性ペルオキシダーゼ阻害を行い、二次

抗体としてヒストファインシンプルステインマウス

MAX-PO

（

R

）（ニチレイ）

を室温にて

40

分反応させた後に、ジアミノベンジジン染色をした。核染色はマ イヤーヘマトキシリンにて行い、脱水、透徹の後に封入をした。

各切片において

20

倍拡大下で

4

視野を無作為に撮影し、ImageJ-Fiji を用いて

SOD2

陽性領域を抽出し、陽性面積率を算出した

³³

。

28

（

14

）

L-

カルニチンの投与

事前検討として

db/db

マウスの飲水量を測定したところ、8 週齢から

16

週齢 においては、平均

10 mL/

日程度であった。既報から、

L-

カルニチン

L-

酒石酸塩

（LC；富士フイルム和光純薬）の一日投与量を

25 mg/個体と決定したため⁵⁶

、

同

2.5 g/L

の溶液を調製し、これを飲水として

8

週齢から

16

週齢までの

8

週間

経口投与した（LC 群） 。なお、対照群として通常飲水群（Vehicle 群）を設定し た。

（

15

） 統計解析

研究

1

と同様の方法で行った。なお、misty マウスにおける

Vehicle

群および

LC

群、

db/db

マウスにおける

Vehicle

群および

LC

群の計

4

群を対象に解析する

際、misty-LC 群と

db/db-Vehicle

群との比較については、有意差を表記しなかっ

た。

29

第

3

節 結果

（1） 糖尿病モデルマウスの腎実質細胞および腎

Mφs

におけるミトコンドリア 由来

ROS

の解析

腎細胞懸濁液サンプルから、フローサイトメトリーによって、

CD45

陰性の細 胞群を同定し、腎実質細胞として解析した。腎実質細胞におけるミトコンドリア 由来

ROS

陽性細胞率は、16 週齢の

db/db

マウスで、同週齢の

misty

マウスに比 べ、有意に高かった（図

20A

） 。腎

CD11b^high Mφs

におけるミトコンドリア由来

ROS

陽性細胞率は、

db/db

マウスと

misty

マウスの間で差はなかったが （図

20B）

、

CD11b^low Mφs

については、腎実質細胞と同様に、

db/db

マウス群で有意に高かっ

た（図

20C）

。

（2）

L-カルニチンが腎実質細胞およびMφs

のミトコンドリア由来

ROS

に及ぼ

す効果

LC

を

8

週間飲水に混ぜ経口投与した

db/db

マウス群（db/db-LC 群）は、通常

飲水

db/db

マウス群（

db/db-Vehicle

群）に比べ、腎実質細胞におけるミトコンド

リア由来

ROS

陽性細胞率が有意に低かった（図

21A）

。また、腎

CD11b^high Mφs

におけるミトコンドリア由来

ROS

陽性細胞率は、 両群の間で差は無かったが （図

21B）

、CD11b

^low Mφs

では、db/db-LC 群で有意に低かった（図

21C）

。

（3）

L-カルニチンが近位尿細管細胞のミトコンドリアに及ぼす効果

近位尿細管細胞（

Proximal tubular cells

：

PT cells

）中のミトコンドリア由来

ROS

陽性細胞率は、

db/db-Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも有意に高く、

db/db- LC

群において

db/db-Vehicle

群よりも有意に低かった（図

22A

および

B

） 。

さらに、電子顕微鏡にて

db/db-Vehicle

群および

db/db-LC

群の近位尿細管細胞

30

のミトコンドリア形態を観察したところ、

db/db-Vehicle

群において数多くみられ ていたミトコンドリアの膨化やクリステの消失が、db/db-LC 群においては改善 を認めていた（図

22C

および

D

） 。

（

4

）

L-

カルニチンが腎

SOD2

発現に及ぼす効果

腎切片中の

SOD2

陽性面積率は、db/db-LC 群において、db/db-Vehicle 群より 有意に高く、

LC

による

SOD2

発現の回復がうかがわれた（図

23A

、

B

および

C

） 。

（

5

）

L-

カルニチンが腎症へ及ぼす効果

尿アルブミン排泄量は、db/db-Vehicle 群において

misty-Vehicle

群よりも有意 に高く、

db/db-LC

群において

db/db-Vehicle

群よりも有意に低かった（図

24A

） 。 血清

Cr

は群間に差が無かった（図

24B）

。なお、腎重量および腎浸潤白血球数 は、

db/db-LC

群において有意に少なかった（図

24C

および

D

） 。これは、

L-

カル ニチン投与が糖尿病性腎症による炎症性腎腫大を改善した結果と考えられた。

体重、摂餌量および随時血糖値については、

misty

マウスおよび

db/db

マウス

内の

Vehicle

および

LC

両群間に差を認めなかった（図

25A、B

および

C）

。

糸球体病変について、

PAS

染色切片の評価を行ったところ、

db/db-LC

群にお いて糖尿病性腎症進行に関連するメサンギウム増加・硬化所見の改善がみられ

（図

26A

および

B

） 、糸球体スコアも低下していた（図

26C

） 。さらに、糸球体

WT-1

陽性細胞数は、db/db-LC 群において有意に多かった（図

26D-F）

。

間質病変については、

Masson trichrome

染色切片の評価を行ったところ、

db/db- LC

群において、有意に腎線維化が少なかった（図

27A-C）

。

（6）

L-カルニチンが腎Mφs

の分布や機能に及ぼす効果

31

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の分布も

Vehicle

群と

LC

群の間で異なってお り、腎白血球に占めるそれらの比は、

db/db-LC

群において、

db/db-Vehicle

群より も有意に低く（図

28A

） 、その理由として、腎

CD11b^high Mφs

の減少が考えられ た。

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

の

TLR9

発現は、

db/db-Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも高く、db/db-LC 群において

db/db-Vehicle

群よりも明らか に低かった（図

28B

および

C

） 。

CD11b^high Mφs

の

TNF-α

産生能については、

db/db-LC

群において

db/db-Vehicle

群よりも低い傾向がみられ（図

29A

） 、腎ホモジネートの

TNF-α

は

db/db-Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも高く、db/db-LC 群において

db/db-Vehicle

群よ

りも有意に低かった（図

29B

） 。

ROS

産生

CD11b^low Mφs

の割合もまた、

db/db- Vehicle

群において

misty-Vehicle

群よりも高く、

db/db-LC

群において

db/db-Vehicle

群よりも低かった。 （図

29C

） 。しかしながら、特記すべきことに、貪食

CD11b^low Mφs

の割合は、

db/db-LC

群において、

db/db-Vehicle

群よりも高かった（図

29D）。

32

第

5

章 考察

本研究は研究

1、研究2

および研究

3

から構成されているため、まず研究

1

の 考察を述べ、次の研究の考察へと続き、最後に全者に共通する腎

Mφs

の糖尿病 性腎症における役割を論じることとする。

研究1. 腎臓における機能に着目した

2

種類のマクロファージの同定と糖尿病性腎症 病態との関わりの検討

（1） マウス腎臓における

CD11b^high Mφs

と

CD11b^low Mφs

の同定、糖尿病性腎症 における

CD11b^high Mφs

と

TLR9

の関与

まず、肝臓における

Mφs

の分類にならい

^12,13

、マウスの腎臓において、

F4/80^low CD11b^high Mφs

（以下、

CD11b^high Mφs

）および

F4/80^high CD11b^low Mφs

（以下、

CD11b^low

Mφs）からなる 2

つの

Mφs

集団を同定した。前者は骨髄由来マーカーを高発現

していたのに対し、後者はほとんど発現していなかったが、それらは糖尿病の有 無に関わらなかったことから、この

2

種類の腎

Mφs

における固有の性質である と考えられた。

次に、糖尿病と

Mφs

機能の関連を検討するため、正常マウスと糖尿病マウス において解析を行った。主に

Mφs

に存在し細菌感染に対する初動免疫として働 く

TLR9

は、

CD11b^high Mφs

および

CD11b^low Mφs

の両方で、糖尿病マウスにおい て発現が亢進しており、

TLR9

活性化が糖尿病の病態と関連する可能性が考えら れた。 さらに、

Mφs

において

TLR9

刺激を介して炎症性サイトカインである

TNF- α

が産生されること、本検討において、過去の報告と一致して

⁵

、糖尿病マウス 腎において

TNF-α

レベルが高値となっていたことから、Mφs における

TLR9

活

性化が、

TNF-α

産生を介して糖尿病性腎症の病態に関与していることが示唆さ

れた。続いて、糖尿病性腎症の病態に関わるとされている

Mφs

の

ROS

産生につ