第６章ヒト型酵素を添加したマルチ酵素標品の特性
その２．ＧＧＴ（γ‑グルタミルトランスペプチダーゼ）の施 設間差是正のための常用酵素標準候補としての評価
は じ め に
γ一グルタミルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．２．２．（γ一 glutamyltransferase;GGT］は、γ一カルボキシル基で結合しているグル タミン酸を切り離す酵素で、ヒト血清中のＧＧＴは肝臓由来の酵素であ る。セラクリアＨＥに添加されているＧＧＴは、ヒトマクロファージ細 胞（Ｍ①細胞）由来の酵素であるが、ＧＧＴは臓器特異性に乏しいこと が知られており、酵素化学的な性状は血清酵素と近似しているものと考 えられた。しかし、ＧＧＴ活性の測定には種々の人工基質を用いた日常 法があって、動物酵素ではヒト酵素と反応性に違いが生じやすいことが 知られている。本章では、測定法としてＩＦＣＣ勧告法および日本の代 表的な７種類の日常法を選んだ。これらの日常法には構造の異なる５種 類のγ‑グルタミール基を含む基質が用いられている。これらの人工基質 に対するヒト型酵素標品の酵素特性とＩＣＥＳ法による方法間差是正効 果を検討した。
[材料と方法］
1．測定機器
ヒト血清検体や酵素標品の酵素活性は、日立−７０５０自動分析機を １３１
用いて測定した。酵素標品の勧告法による表示値決定には、島津ＵＶ−
２６０ダブルビーム分光光度計を用いた。分光光度計の波長の検定には ＳＲＭ９３５を用いた。ペルチェ式恒温温度計の較正にはガリウムセル およびＳＲＭ１９６８を使用した。
２．試料および酵素標準候補
酵素標準候補にＩＦＣＣ勧告法の３０℃と３７℃での表示値を付ける ために用いた試薬は全てＩＦＣＣ勧告法の試薬規格を満たすものを選択 した')。ＥＲＭ候補として、以下の酵素標品を用いた。セラクリアＨＥ
（正常域および異常域コントロール）、酵素リファレンス、ブタ腎由来 ＧＧＴを含むＣＲＭ３１９（ＢＣＲ）２ 4)ヒト血清にウシ腎由来ＧＧＴ を添加したＢＭＹ社製のPrecipath‑EとBMYCalibrtatorおよびDade社 のMoniごrroll。これらは総て凍結乾燥製品である。この他に液状製品 としてウシ腎由来ＧＧＴヒト血清に添加したOrthoLiquid ReferenceSerumll（Ortho社）を使用した。比較のために患者血清を 候補品として各測定のたびに使用した。
３．試薬
セラクリアＨＥなどのＥＲＭ候補品にＩＦＣＣ勧告法で値付けするた めに使用した試薬は第４章に使用したものと同じである。ＩＦＣＣ勧告 法は自動分析装置に合わせるため、容量を変更したが、試薬の終濃度は 勧告法に一致させた。市販の７種測定キットはmablelに示したものを 使用した。４−nitoroandline溶液は、和光純薬から購入した。
１３２
４．分析方法
1）酵素動力学的特性
セラクリアＨＥの３０℃、３７℃でのＩＦＣＣ法による見かけのミカ エリス定数（Ｋｍ）およびｐＨ特性についてトランスアミナーゼの場合 と同様にして測定した。みかけのＫｍの決定には、供与体(I1able2)の濃 度を０．１，Ｍから勧告法が指定した濃度まで変化させ、受容体は、
Glycylglysineの濃度は３，Ｍから変化させた。
2）勧告法測定値の決定
患者検体およびＥＲＭ候補品の勧告法による測定は、測定温度を勧告 法指定の３０℃でなく３７℃に変えた以外は勧告法に従って行った。
３）８種の日常法による検体の測定とＥＲＭ候補品による測定結果のキャ リブレーション
日常法による患者検体とＥＲＭ候補品の測定は２回に分けて行った。
一回目の測定では、患者血清２５検体について３０℃と３７℃の両温度 でＥＲＭ候補品と同時に８種の日常法で二重測定した。自動分析機を用 いた日常法の測定に当たっては、試薬メーカーが指定した換算係数を用 いた。但し、試薬１〜５は実測Ｋ値を用いた。（実測Ｋ値の測定には、
試薬３〜５は4mitoroanilineを用い、試薬１，２は５−aminObenzoate l33
を反応指示物質として用いた。）試薬８のキヤリブレーションは2判、
N‑di‑n‑propylaminobenzoicａｃｉｄ溶液を用いて行った。二回目の測定 では、患者血清２１検体を用いて同様に測定したが、測定後に２検体を 異常検体として分析対象から外した。２検体中の１検体は測定限界を超 える高活性で直線性が得られないため異常検体とした。他の１検体は、
３０℃と３７℃の活性比（活性化エネルギー）の異常により除外した。
したがって、最終的に患者血清４４検体（ＩＦＣＣの３７℃測定で １００Ｕ/Lまで）と８種類のＥＲＭ候補品を検体として測定した。それ ぞれのＥＲＭ候補について試薬毎の平均とＣＶを勧告法の値に換算して 算出した。試薬間の生のパリデーションデータも出した。
4）ＥＲＭ候補のCommutabilityの評価
前章のトランスアミナーゼの場合と同様、３０℃と３７℃で各々二回 ずつ測定し、患者血清４４検体について各ＥＲＭ候補の日常法問の Commutabilityについて評価した。
｢結果」
1．自動分析用ＩＦＣＣ準拠試薬
自動分析装置にＩＦＣＣ勧告法を適合させたＩＦＣＣ準拠試薬で患者 血清１４検体を測定して得られた値を（Ｙ）とし、これと同様に ＩＦＣＣ勧告法（３７℃）で測定して得た値（Ｘ）から、ｙ＝0.065＋
0.999Ｘ，ｒ＝0.9996,Ｓｙ/ｘ=1.96Ｕ/Ｌの直線式を得た。
１３４
2．ＥＲＭ候補品の動力学的パラメーター
ＥＲＭ候補品と患者４検体の平均の見かけのＫｍ値を'mable3に示し た。得られたＫｍ値は、Ｓｈａｗら2)がヒト血清ＧＧＴのPing‑pongbi‑bi 機構に基づいて基質のEr‑glutamylanilideが0.65Glycilglyl8mMで
出した値とよく符号している。ＩＦＣＣ勧告法（３０℃）でＣＲＭにつ いてSchileら')は、見かけのＫｍ値として基質が1.12,Ｍ，受容体が 31,Ｍと報告している。これらの結果から、動物由来のＧＧＴの基質に 対するＫｍ値は、ヒト血清のその値より一般に大きい値をとることが分 かる。３７℃におけるｐＨと活性値の関係をまとめたのがFig.１である。
３７℃測定でｐＨ７．７の時の活性を１００％とした時の相対活性で示し てある。３０℃測定の場合も同様のパターンを示した。３７℃のｐＨ値 は、３０℃のｐＨ値よりも0.1も.2(､0.14)程度低かった。至適ｐＨ値は、
動物由来ＧＧＴを含む管理物質の方がヒト血清のＧＧＴより明らかに高 かった。これに対してセラクリアＨＥのＧＧＴはヒト血清ＧＧＴより幾 分低い傾向を示した。Schileらは2)、３０℃測定でヒトプール血清 ＧＧＴの至適ｐＨを７．９、ＣＲＭ３１９のそれを８．３と報告している。
ヒト型酵素の酵素反応学的特性は動物由来のものより、ヒト血清のその 値に近似していた。
日常法の評価
検討したすべての日常法で患者血清４４検体を２重測定し、ＩＦＣＣ 自動化法の値と比較した。'Eable4に示すように検討した日常法のすべ
１３５
てが３０℃および３７℃測定でＩＦＣＣ自動化法との相関係数が0.999以 上とよい相関を示した。そこで、これら総ての日常法を勧告法と相関性 の高い測定法とみなし、ＥＲＭ候補品の評価分析に使用したが、６〜８ の測定法は測定条件が１〜５の方法とはかなり異なっていた。
4．酵素活性に及ぼす測定温度の影響
３０℃測定値に対する３７℃測定値の平均活性比を患者血清４４検体 について求めたところ、測定法６，７では、平均値よりも低値で、測定 法８では高値傾向を示した（Fig.2）。セラクリアＨＥのＧＧＴの活性比 は 、 ヒ ト 血 清 の 値 と 近 似 し て い た 。 一 方 、 動 物 由 来 の Ｇ Ｇ Ｔ を 含 む ＥＲＭ候補品は測定法５〜８で明らかにヒト血清と異なっていた。特に 測定法６では、ブタ腎由来ＧＧＴを含むＣＲＭ３１９およびPrecipathE では、活性比が異常に低く外れていた。したがって、動物由来ＧＧＴを 添加したＥＲＭ候補品では、測定装置によっては測定温度の違いによる 影響を補正することが出来ないと考えられる。
５．ＥＲＭ候補品のＩＣＥＳキヤリブレーダーとしての評価
患者血清４４検体の生データの方法間変動の平均はすべての測定法で ２０％まで達したぐmable5、ｎ=8）。セラクリアＨＥを共通のキヤリブ レーダーとして用いたときの収束効果は４％で、患者血清の一つをキャ リブレーダーとして用いた場合の２．５％よりも高かった。試作段階での 結果と異なりＢＳＡベースの酵素リファレンスの収束効果は、不満足な 結果に止まった。ＣＲＭ３１９を含む動物ＧＧＴを添加したＥＲＭ候補
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品による収束効果は３０％で、キヤリブレーションの効果はなかった
、をlble5）。ヒト由来ＧＧＴを含む酵素標品、特に酵素リファレンスで は５種類の測定方法間のキャリプレーダーとして収束効果を示すことが 分かった。ｍａｂｌｅ５にはＥＲＭ候補品でキヤリブレートした後の全平均 が示されており、その中でヒト由来の候補品では３１５Ｕ/L，ＣＶ３％
でほぼ一致していることが分かった。このことから、ヒト由来ＧＧＴを 添加したＥＲＭ候補品をキャリブレーダーとして用いれば、ＧＧＴの方 法間差を解消できることが考えられる。また、Ｆｉｇ．３に示した Commutabilityの評価結果は、患者血清４４検体について日常法測定値 をＥＲＭ候補を用いて勧告法の値に換算した値と同じ検体を実際に勧告 法で測定した値との間の偏差から出したものである。この図から、各
ＥＲＭ候補品は、キャリブレーダーとして有用で使えることが分かる。
３ ０ ℃ お よ び ３ ７ ℃ の い ず れ の 測 定 方 法 に お い て も 、 動 物 由 来 の ＧＧＴを添加したＥＲＭ候補は、ＣＲＭ３１９を含め、ヒト由来ＧＧＴ を添加したものに比べてどの測定方法についてもCcmmutabilityが低かっ た。動物由来酵素を添加した標品は、測定法６の場合に温度依存性の Commutabilityが顕著に認められた。特に、ブタ腎ＧＧＴは、温度の影
響が活性にさまざまの不規則な影響を及ぼすため、測定法６でそうなる
ことは予想されていたことである（Fig.2）。ヒト由来ＧＧＴを含有する ４種類の酵素標品では、測定法８で−８％まで両測定温度で偏差があった ものの、セラクリアＨＥが最もよい結果であった。他の測定試薬では、
すべて偏差は±４％以下であった。これは、ヒト血清ＧＧＴの値に匹敵 するものである。３％ＢＳＡベースに１００％細胞培養由来ＧＧＴを加 えた酵素リファレンスは測定法７に対して反応性がヒト血清と異なって
１３７
いた。これに対してヒト細胞培養のＧＧＴ以外にベースのヒト血清由来 酵素を含むセラクリアＨＥは反応性に問題がなかった。セラクリアＨＥ に関連する試料は、どれもヒト血清に近似した測定法間変化能力を示し た。測定法７に関して酵素リファレンスだけが反応測定時間内に非直線 性の吸光度変化を示した。これが測定法７に対して酵素リファレンスが Commutabilityを欠く主な原因であると思われる。さらに、この測定法 では、ブタ由来ＧＧＴをＢＳＡベースのマトリックスに添加した ＣＲＭ３１９やPrecipathEなどは、ヒト血清ベースにそれを添加した Calibratorなどよりもさらに大きな偏差を生じた。その差は、酵素リファ レンスとセラクリアＨＥの問にみられるような反応性の差ではなかった
（ＦＹｇ３）が、動物酵素を添加した標品でもＧＧＴについてマトリックス 効果がCommutabilityに影響を与えることが示唆された。
｢考察」
欧州で開発されたＣＲＭ（認証リファレンス物質）の多くは、動物由 来の酵素を添加して調製されたものである。ＢＣＲ標準酵素の中で最初 に市販されたＧＧＴ用のＣＲＭ３１９は、ブタ腎由来のＧＧＴを含んで いるが、ＩＦＣＣ、ＳＳＣＣおよびＦＳＢＣ勧告法の３勧告法問のバラ ツキは、３０℃、３７℃いずれの温度でも４．８％以下であるとされてい た。これらの勧告法は、いずれも4‑nitroanilideを基質としているが、同
じ基質の市販の分析試薬を用いて２つの検査室間で調べた結果では、
ＣＲＭ３１９で補正しても施設間差はＢＣＲが報告したようには収束し なかった5)。ＣＲＭ３１９のCommutabilityを各種日常法と勧告法の間 でそれぞれ比較したところ、基質が4‑nitoroanilideまたは３−carboKy‑
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４nitroanilideの測定法２〜５では、３７℃では他の基質を用いた測定法 ６〜８よりも良かった。日常法の３７℃の値をＣＲＭ３１９でキヤリブ レートして勧告法に換算したときの方法間差はＣＶ値で４．７％で、同じ ブタ腎由来のＧＧＴを含むPrecipath‑EやCalibratorのCommutability の結果も似かよっていた。このようにＣＲＭ３１９はＩＦＣＣ勧告法の
１次標準として、あるいはＩＦＣＣに近似した測定方法との間をつなぐ キャリブレーダーとしては問題ないが、勧告法と種々の日常法を橋渡し する常用ＥＲＭとしては適していないことが分かった。
MoniざnFolとOrtholjquidReferenceは共にウシ腎由来のＧＧＴを含む 酵 素 標 品 で 、 こ れ ら は 、 ３ ０ ℃ で も ３ ７ ℃ で も 共 に よ く 似 た Commutabilityのパターンを示した。しかし、ブタやヒト由来のＧＧＴ を含んだＥＲＭ候補品とは違うパターンであった。このことから、
ＧＧＴのCommutabilityについては、管理物質のマトリックスや由来臓 器の違いよりも、ヒトと動物種の違いが、より強く現れることが示され た。塚田ら6)は、基質を変えたときのＧＧＴの反応性の違いは同一種で は 臓 器 の 違 い に よ る 差 違 は 明 ら か で な い が 、 由 来 動 物 の 差 違 は 明 ら か で あることを報告している。ＧＧＴでは、ＥＲＭの添加酵素としてはヒト 由来の酵素が好ましく、今回の結果でも、ヒト・マクロファージ由来の ＧＧＴは、ヒト血清酵素ほどではないとしても、他動物由来のＧＧＴよ りも広範囲に測定法の違いを越えてCommutabilityを示した。こうした オリジンの違いによる差は、酵素特性、例えばＫｍ値、至適ｐＨ，温度 特性などＩＦＣＣ勧告法測定条件で活性に影響を与える種々のファクター の違いを反映していると考えられる。ＧＧＴの場合は、ヒト由来酵素で あることがＥＲＭ候補の酵素として最も大切である。海外でも、PLC／
PRF/5やHepG2細胞などのヒト細胞ＧＧＴ７)や、遺伝子組換えヒト型
１３９
ＧＧＴ酵素8,9)がＥＲＭ用酵素の酵素起源として検討され、有望である と考えられている。さらに、常用ＥＲＭには、単に添加酵素がヒト由来 であるということではなく、測定結果に影響するマトリックス効果など を 考 慮 し て 、 実 際 に 標 品 と し て 勧 告 法 と 各 日 常 法 と の 間 に Commutabilityがとれることが確かめられなければならない。
｢まとめ」
②
患者血清４４検体とヒト型酵素標品を含む各種の常用ＥＲＭ候補品を 日本で市販されている数種の日常法を用いて３０℃と３７℃で測定し、
各酵素標品の測定方法間のコミュータビリティーを検討した。常用 ＥＲＭ候補品としては、動物由来ＧＧＴを含むＢＣＲのＣＲＭ３１９や 市販管理血清とヒト細胞由来ＧＧＴを含むセラクリアＨＥおよび酵素リ
ファレンスを使用した。その結果、ヒト・マクロファージ由来のＧＧＴ を含むセラクリアＨＥは、ヒト血清ほどではないものの、他動物由来の ＧＧＴを添加した酵素標品よりも広範囲に試薬の違いを越えてコミュー タビリティーを示すことが確認された。したがって、セラクリアＨＥは、
他の市販の動物由来のＧＧＴを加えた管理血清と比較して方法間の ＧＧＴ活性値の統一化をより広範囲に得ることができることが示唆され た。一方、同じヒト型酵素を添加して調製された酵素リファレンスは、
一部の日常検査試薬で反応測定時間内に非直線性の吸光度変化を示し、
反応性がヒト血清と異なっていた。これは、酵素リファレンスのマトリッ クスに由来するマトリックス効果と思われる。
140
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142
Ｂ Ｒ ａ ｔ ｅ Ｂ Ｒ ａ ｔ ｅ Ａ Ｒ ａ ｔ ⑧
ＢａｓｅｄｏｎＩＦＣＣＲ⑧ｆｅｒｅｎｃｅＮ⑧ｔｈｏｄ Assay
Rea9⑧ｎｔＤｏｎ◎rAprocedumDet⑧ctlOn(nm)且 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｌｓｔｉｃｓｈ ＴｒａｄｅＮａｍｅ ＳｕｐＰ１１ｅｒＥ
D1r⑥cｔ(４１５/660）
Ｄ１ｒｅｃｔ(４１５/660）
Direct(４１５/505）
１２３
Table１．ＲＯｕｔｌｎｅｍ⑧thods(r⑧a9ents）andthelrcharacterlstlcs．
γ 一 Ｇ Ｔ − Ｂ Ｈ Ｙ Ｂ Ｍ Ｙ Ｓ◎1ｕｂｌｌｉｚｅｄｂｙａβ一ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒボ、γ一GＴＰ−ＨＡＴｅｓｔＷａｋｏＷＫ
ｄｅｒｉｖａｔｌｖｅ
Ｂａｓ⑧ｄｏｎＳＳＣＣ且ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＨｅｔｈＯｄＮ⑧ｓｃａｕｔｏγ一ＧＴＰ−Ｖ５ＮＳ ＢａｓｅｄｏｎＳＳＣＣ且Ｒｅｆ⑧ｒｅｎｃｅＮｅｔｈｏｄｘａｔｒｏγ一ＧＴＰＲａｔｅＤＡ Ｓ Ｒ ( P ⑧ n t a c y a n o a m l n e f e r r o a t e ） N ‑ A s s a y γ 一 Ｇ Ｔ Ｐ Ｎ Ｂ ＳＲ(CondensatjonWithTOOS且underBODL）γ一ＧＴＰＲｅａｇｅｎｔＫｏｋｕｓａｌｍ Ｓ Ｒ ( p ‑ X y l e n ◎ １ ＋ N a X O ） Ａ ｕ ｔ ｏ ｓ ｅ ｒ ａ − Ｇ Ｇ Ｔ Ｄ Ｘ D1mct(４１５/480）
Ｄｆｒｅｃｔ(４１５/570）
ＳＲ(700ﾉ600）
ＳＲ(700/600）
ＳＲ(660/700）
４５６７８
Ａ Ｒ ａ ｔ ｅ
Ａ Ｒ ａ ｔ ｅ Ｃ Ｒ ａ ｔ ｅ Ｄ Ｒ ａ ｔ ｅ Ｅ Ｏ ｎ ⑧ ｐ ｏ ｉ ｎ ｔ
師寺﹇
ａｓ⑧ｅＴａｂｌｅ２ｆｏｒｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ・
且ＳＲ:Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｒ⑧ａｃｔｌ◎ｎ．
負BHY：Ｂ◎⑧hrlngerHannhelmYamanouchl(T◎kyo，Japan）；ＷＫ：WakoPureChemfcals(Osaka，Japan)；ＮＳ：N1ppOnShojl
（Osaka Japan)；ＤＡ：D1a‑Iatron(Tokyo，Japan)；ＮＢ：Ｎ１ｔｔＯｂ◎･Chemlcals(TOkyo，Japan)；
ＺＲ：InternatlonalRea9⑧nts(Kob⑧，Japan)；ａｎｄＤｴ：DallchlPureChemlcalB(Tokyo，Japan）．
且ＳＳＣＣ:ＳｃａｎｄｌｎａｖｌａｎＳｏｃｌ⑧ｔｙｆ◎ｒＣ１１ｎｌｃａｌＣｈｅｍｌｓｔｒｙ・
aTOOS:N‑Ethyl‑N(2‑Hydroxy‑3‑Sulf◎propyl）一m‑Toluldlne．
』ＬＢＯＯ:Ｂ１１１ｒｕｂｌｎｏｘ１ｄａｓｅ・
ＡＢＣＤＥ
Ｔａｂｌｅ２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆ◎ｒｄ◎ｎ．ｒｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ
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0．００２６ ０．００３３ ０．００１７ ０．００１３ ０．００２９ ０．００１．６ ０．００１８ ０．００３０ ０．００１６ ０．００１６ ０．００１９ ０．００２３ 4．２６０．４８２８０．００２３
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第７章ヒト型酵素標品を添加したマルチ酵素標品の特性
その３．ＣＫ（クレアチンフオスフオキナーゼ）およびＬＤ
（乳酸脱水素酵素）の施設間差是正のための常用酵素標準候補 としての評価
は じ め に
ＣＫおよびＬＤは、ＡＳＴ，ＡＬＴやＧＧＴなどの酵素と異なり、正 常なヒト血清においても複数のアイソザイムおよびアイソフォームが存 在し、その多様な構成比が臨床的な意味を持っている。各アイソザイム 間には、酵素化学的、物理化学的性状の違いがあるため、アイソザイム 構成が複雑なＣＫおよびＬＤについては、常用ＥＲＭを用いて方法間差 を是正するのが難しいのではないかと想像された。本章では、セラクリ アＨＥを中心にヒト型酵素標品を、数種の市販管理血清およびＬＤとＣＫ のＢＣＲ標準と、ＥＲＭ候補として比較した結果をまとめた。なお、ＬＤ についてはＩＦＣＣ勧告法')を、ＣＫについてはＪＳＣＣ常用基準法2）
を基準として、いずれも３７℃で表示値を付けた。方法間差の検討に用 いた日常法は、勧告法と相関性の高い勧告法準拠試薬など８法を選択し た。
1．クレアチンキナーゼ（ＥＣ2.7.32,creatinekinase；ＣＫ）活性測 定における方法間差およびＣＫアイソザイムについて
ＣＫは、クレアチンとクレアチンリン酸との間に作用し、ＡＴＰから のリン酸を転移する転移酵素の一種で、アイソザイムの多様性が知られ
１５１
ている3,4)。ＣＫの標準的測定法として、ＪＳＣＣ勧告法が公表されて いるが、９４年度日本医師会精度管理調査結果報告書5）によると、ＣＫ の日常法としては、ＧＳＣＣ（ドイツ臨床化学会）勧告法、ＳＳＣＣ
（スカンジナビア臨床化学会）勧告法の準拠試薬が全体の８０％を占め ており、測定法の統一はなされていない。ヒト型酵素標品の評価は、多 数の患者血清とヒト型酵素標品を含む常用ＥＲＭ候補を同時に測定し、
常用ＥＲＭ候補の方法毎の測定値とＩＦＣＣ勧告法３７℃測定で付けら れた基準値をもとに、各検体の生データを基準法の値に換算して方法間 の変動を算出して判断した。さらに、換算値の変動を細かく見るために、
基準法との差を各検体毎に算出し、その平均値が±５％に収まるかどう かで常用ＥＲＭ候補を評価した。
Ⅱ、乳酸脱水素酵素（ＥＣ1.1.1.27,ELactatedehydrogenase；ＬＤ）
活性測定における方法間差およびＬＤアイソザイムについて
ＬＤは、解糖系の酵素で、乳酸とピルビン酸の可逆反応（乳酸：Ｌご Ｐ：ピルビン酸）を触媒する酸化還元酵素の一種である。５種類のアイ ソ ザ イ ム が 存 在 し 、 電 気 泳 動 で 陽 極 へ の 移 動 度 の 早 い 順 に Ｌ Ｄ １ 、 ＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ４、ＬＤ５と命名されている6)。正常ヒト血清中 では、ＬＤ２が最も多く、次がＬＤ１、ＬＤ３で、ＬＤ４とＬＤ５は各々 全体の５％以下である。測定法を原理別に分類すると乳酸を基質とする 方法とピルビン酸を基質にする方法に分けられる。国内では、約９割の 検査施設がピルビン酸を基質とする方法を日常検査法として採用してい るが、ＪＳＣＣは乳酸を基質とする方法を勧告した7)。乳酸を基質とす る方法（Ｌ→Ｐ）には、ＬＤアイソザイムを均等に測定するＪＳＣＣ法
１５２
と、ＬＤ１アイソザイムを主に測定する目的で開発されたＩＦＣＣ法が ある。両法の相違点は緩衝液の種類とその濃度、至適ｐＨにあり、乳酸、
ＮＡＤ+濃度は同じである。一方、ピルビン酸を基質とする方法（Ｐ→Ｌ）
には、ＳＦＢＣ（フランス臨床化学会），ＧＳＣＣＳＳＣＣ勧告法が あり、ピルビン酸濃度に差がみられる。ヒト型酵素標品の評価方法はＣＫ と同様にして行った。
[材料］
1．機器
日立−７０５０形自動分析装置を用いて３０℃と３７℃で酵素活性を 測定した。常用ＥＲＭ候補品の表示値付けは、島津ＵＶ−２６０ダブルビー ム分光光度計を使用した。
2．試薬および酵素標品
乳酸リチウム、ジエタノールアミン（DEA）は和光純薬から購入した。
ＮＡＤはＢＭＹ製を、Ｎ一メチルＤ一グルカミン（ＮＭＧ）はナカライ・テ スク製を用いた。その他の勧告法試薬は第四章に示したものを使用した。
ＥＲＭは、ＢＣＲのＣＫ標準品ＣＲＭ２９９８)およびＬＤ標準品 ＣＲＭ４０４９)を用いた。ＥＲＭ候補品として、セラクリアＨＥの正常 域および異常域、酵素リファレンス、動物酵素を添加したＢＭＹ社製 ＢＳＡベースのプレチパスＥとDade社のヒト血清ベースのモニトロール ーⅡ、ヒトプール血清にヒト臓器由来酵素を添加したAaltoControlllを
１５３
使用した。以上の酵素標品はすべて凍結乾燥品である。この他に液状品 でヒト心筋由来酵素を含有するOrthoIR（Ortho社製）とDade社のモ ニトロールーＬも検討した。ｍａｂｌｅｌにこれらの酵素標品の酵素オリジン とアイソザイム構成を示した。なお、ヒトＬＤアイソザイムの対照品と して、国際試薬の分画ＬＤ１−ＬＤ３およびＬＤ５を使用した。また、測 定毎にヒトプール血清を対照として用いた。
3．測定試薬
ＬＤの活性測定には、（Ｌ→Ｐ）の反応試薬としてＩＦＣＣ及び ＪＳＣＣ勧告法に合わせて調製した自製試薬と市販のＪＳＣＣ準拠試薬 ネスコートＬＤ−Ｖ７（アズウェル）、国際試薬ＬＤ。Ｅの２種類を使用
した。（Ｐ→Ｌ）反応試薬としては、ＳＦＢＣ勧告法'０)に従って自製し た試薬、ＢＭＹのＬＤＨ−ＳＦＢＣ，ＧＳＣＣ勧告法に準拠した三光純薬 のサンテストＬＤＨおよびＳＳＣＣ勧告法に準拠したアズウェルのネス コートＬＤ−Ｖ２の５種類の試薬を用いた。
ＣＫの測定試薬については、ＪＳＣＣ準拠試薬として勧告法自製試薬、
市 販 試 薬 と し て ア ズ ウ ェ ル の ネ ス コ ー ト ー Ｃ Ｋ Ｖ ７ 、 国 際 試 薬 一 ＣＰＫ。Ｅの３種類、ＧＳＣＣ勧告法試薬として、和光一ＣＰＫⅡ−
ＨＡ、メルクオートＣＫ，ＢＭＹのＣＫ−ＮＡＣ，第一化学クリニメイ トＣＰＫの４種、さらに勧告法以外の日常法としてダイヤヤトロンのイ ヤトロファインＣＫレートを加えた合計８種類の測定試薬を用いた。こ れらの試薬は、すべて基質としてクレアチンリン酸を用いる方法である が、和光一ＣＰＫⅡ一ＨＡはＥＤＴＡ抜きで、第一化学クリニメイト
１５４
ＣＰＫはイミダゾール緩衝液でなくてピペラジン緩衝液を用いており、
緩衝液に関しては違いがある。測定は、グルコキナーゼ・Ｇ６ＰＤ法に よるＫファクターを実施した上で自動分析法で行った。
４．分析方法
1）見掛けのＫｍ値
見掛けのＫｍ値は、日立７０５０自動分析機に合わせて勧告法の試薬 終濃度に合わせて自製したＩＦＣＣ準拠試薬およびＪＳＣＣ準拠試薬で、
それぞれＬＤとＣＫを３０℃と３７℃の両温度で測定して算出した。
2）表示値付け
ＣＫについては、ヒト型酵素標品などのＥＲＭ候補品とヒト血清検体 は、温度管理装置を付けた島津ＵＶ−２６０ダブルビーム分光光度計を用 いて勧告法による表示値を付けた。しかし、数種のＥＲＭ候補品は、自 動分析機とＪＳＣＣ準拠試薬を用いて測定して得られた値を表示値とし た。ＬＤに関しても基本的にはＩＦＣＣ勧告法で表示値を付けたが、サ ンプル量が少ないＣＲＭ４０４や分離アイソザイム標品などは自動分析 で得た活性値を表示値として使用した。
3）日常法による分析
患者血清とＥＲＭ候補品を同時に日常検査試薬を用いて日立７０５０ １５５
自動分析機で測定した。検量係数は、日常法それぞれについて３０℃と ３７℃で市販のＤグルコース測定試薬セットを実測して用いたが、その 他は試薬指定のファクターを用いて測定した。ＢＣＲのＣＲＭ４０４お よびＣＲＭ２９９は、それぞれ１回ずつしか測定しなかったが、その他 のＥＲＭ候補品とヒト血清は、同一検体を３０℃と３７℃で数回ずつ測 定した。日常法の勧告法に対する相関係数を算出するため、ＬＤについ てはヒト血清９８検体、ＣＫについては１０８検体を用いた。
４）ＥＲＭ候補品を用いたキヤリブレーシヨン
前章までと同様のキャリブレーション法で、ヒト血清検体の８種類の 日常法で測定した値を勧告法の測定値に換算した。各ヒト血清検体毎に ８種類の日常法で得られた値を勧告法に換算して、方法間の平均とＣＶ 値を算出した。ＬＤに関しては、ヒト血清９８検体について方法別に換 算後の平均とＣＶを求めた。ＣＫについては、全数で１０８検体のヒト 血清を３７℃で測定した。１０８検体中８０検体は３０℃でも測定して キャリブレーションを行った。
5）各ＥＲＭ候補品のCommutabilityの評価
ＬＤとＣＫについて、それぞれヒト血清９８検体および８０検体と常 用ＥＲＭ候補を同時に４回測定し、常用ＥＲＭ候補の方法毎の測定値と
ＩＦＣＣ法３７℃測定で得られた基準値をもとに、各検体の生データを 基準法の値に換算して方法間の変動を算出した。さらに、換算値の変動 を細かく見るために、基準法との差を各検体毎に算出し、その平均値が
１５６
±５％に収まるかどうかで常用ＥＲＭ候補を評価した。各ＥＲＭ候補品 のコミュータビリティーの評価を行った。
6）アイソザイム分析
ＬＤ，ＣＫ酵素活性高値の患者血清およびＥＲＭ候補品についてアガ ロースゲル電気泳動を行ってアイソザイムを分析した。
[結果］
１．各ＥＲＭ候補品のアイソザイム構成
分析結果は、添加酵素のオリジンと共にtablelに示した。まずＬＤに 関しては、ＣＲＭ４０４は、ヒト赤血球由来の酵素を含有し、主要アイ ソザイムはＬＤ１であることが分かった。セラクリアＨＥは、ヒト血清 と同様のアイソザイム構成を示した。キャリブレータ、モニトロール、
オーソリキッドリファレンスは、ヒト血清をベースに動物由来ＬＤを添 加しており、添加酵素の特徴が現れているが、全体としてはヒト血清の パターンに近似していた。プレチパスＥは、ＢＳＡベースにブタ心筋由 来の酵素が添加されており、ＬＤ１よりさらに陽極側にバンドが認めら れた。
次にＣＫについては、患者血清のアイソザイムは、ＣＫ−ＭＭ型がほ とんどで、これに若干のＭＢ型とマクロＣＫが認められた。市販管理血 清については、オーソＬＲはヒトＣＫ−ＭＭが主で、ヒト臓器酵素を添加 したAaltoControllIは、９０％のＣＫ−ＭＭに１０％のＣＫ−ＢＢを含ん
１５７
でいた。セラクリアＨＥや酵素リファレンスはＣＫ−ＭＭとＣＫ−ＢＢの 構成比が半々かＣＫ−ＢＢが若干低い程度であった。ＢＣＲの標準品 ＣＲＭ２９９は、ヒト胎盤由来酵素を含むため、ＣＫ−ＢＢが主であった。
プレチパスＥとＣＡＬＩＢのような動物酵素を添加した試料は、動物の Ｃ Ｋ − Ｍ Ｍ 型 が 多 い が 、 モ ニ ト ロ ー ル は Ｃ Ｋ − Ｍ Ｂ が 主 で あ っ た 。 ＣＲＭ２９９は、ＣＫ−ＢＢ型であった。
2．各ＥＲＭ候補品の見掛けのＫｍ値
ＬＤおよびＣＫについて、各ＥＲＭ候補品とヒト血清の３０℃と３７
℃の見掛けのＫｍ値をmable2に示した。まず、ＬＤに関しては、乳酸 に対するＫｍ値は、ヒト血清（n=7）が３０℃で1.9±0.1,Ｍ，３７℃で 2.8±0.2,Ｍであったのに対して、セラクリアＨＥのノーマルは両温度 で若干低値であったが、セラクリアＨＥのアブノーマル、酵素リファレ ンスおよびオーソＬＲについては、ほぼヒト血清と近似した値を示した。
これに対してキャリブレータ、プレチパスＥ，モニトロールは、いずれ の温度でもヒト血清よりも若干低値を示した。ＮＡＤ+に対するＫｍ値は、
ヒト血清が３０℃で0.19±0.04,Ｍ，３７℃で0.29士0.06,Ｍという結 果になりセラクリアＨＥのノーマルが低値である他は、いずれのＥＲＭ 候補品とも、ほとんどヒト血清と近似した値を示した。
ＣＫのクレアチンリン酸に対するＫｍ値は、ヒト血清（n＝５）が３０
℃で2.5±0.2,Ｍ，３７℃で2.3±0.1,Ｍであったのに対して、ヒト臓 器由来酵素を添加したAaltoContrOlIIだけは近似した値であったが、そ の他のＥＲＭ候補品はヒト血清の値とやや禿離していた。すなわち、上
１５８
