MPP easy guide

(1)

Mass Profiler Professional

簡易マニュアル

マニュアル作成環境：（旧版を下記で改定）

・Mass Profiler Professional B12.5 Build 179640

・MassHunter Qualitative Analysis B.05.00 SP1

(2)

Mass Profiler Professionalの主な機能

機能

特徴

Fold Change

グループ間の平均で閾値以上のコンポーネントを抽出します。

t-検定（2群）、ANOVA（3

群以上）

グループ間で平均値とばらつきから、グループ間で変動があると判断さ

れるコンポーネントを抽出します。

Volcano Plot

Fold Changeとt-検定を同時に行います。

主成分分析(PCA)

サンプル全体の大まかな傾向を視覚化します。

多変数（コンポーネント）を集約し、各データファイル（サンプル）の総合

得点（スコア）を算出して、表示します。

各コンポーネントの係数（ローディング）とスコアの関係から、コンポーネ

ントの考察を行うことができます。

クラスタ分析

似た変動のコンポーネントを集めて視覚化します。

Class Prediction

(判別予測、判別分析)

グループ間の違いを表すコンポーネントと分類の基準値（コンポーネント

のアバンダンス）を探し出し、サンプルをグループで分類します。分類後

にコンポーネントと基準値が妥当かどうかの確認を行います。

Pathway分析

(オプション)

バイオマーカー探索で主に用いられる機能。コンポーネントのライブラリ

サーチ結果から化合物の代謝経路などを推定し、Pathway

と呼ばれる化合物の反応経路の地図に落とし込む機能です。

(3)

MassHunterとMPP用いた解析の流れ

MassHunter

・MSやRTの再現性良好なデータ

・xxx.d ⇒ xxx.cef変換

MPP

MassHunter

_{※必須：マスクロマトグラムと}

マススペクトルで確認

・データベースサーチや

組成式計算等

cef

③

候補検出後確認

・Export for

Recursionで

化合物リスト作成

・ID Browserで

化合物検索

①Experiment作成

強度正規化条件選択

1. None

2. Z-Transform

3. Baseline to (median/

mean) of (all/control)

samples

定型Wizard

Data Import Wizard

Class Prediction: Build and Test Model

Analysis: Significance Testing and Fold Change

②Analysis

(差異の検出)

・Volcano Plot

・Clustering

・PCA

etc

任意Workflow

(4)

CEFファイル作成方法概要

(Agilent MassHunterユーザーのみ）

①該当データ上で右クリックします。 ②Export as CEFを選択します。 ③データ保存先等設定します。 ④OKをクリックします。処理するデータファイル数と Compounds数によっては処理に長時間かかります。

(5)

MPPソフトの概念と用語１

Project _{ユーザーがデータを格納するワークスペースです。MPPを複数人で} 共有する場合など各個人でプロジェクトを作ると、閲覧権限等は設定できませんが、データを分けることができます。用途の異なるデータは混乱を招くため異なるプロジェクトにしたほうが無難です。 Experiment _{エクスペリメントはデータの解析単位になります。シグナルデータのイ} ンポートを行うとエクスペリメントが1つできます。ノーマライズはエクスペリメント単位で決定され変更することはできません。 Sample _{GC/MSやLC/MSのデータです。データファイル名がSample名になり} ます。 Entity _{LC/MSの場合は、MFEで抽出されたFeatureです。サンプルごとの強} 度変動情報が含まれます。

Project A

・・・

Experiment 1 Sample （データファイルセット） Condition （サンプルのグループ化情報） Entity List （クロマトグラムピークリスト） Object （クラスタツリー、判別モデル等） Experiment 2 Sample （データファイルセット） Condition （サンプルのグループ化情報） Entity List （クロマトグラムピークリスト） Object （クラスタツリー、判別モデル等） ※Experimentは他のProjectへコピーすることもできます。

拡大

1つ1つが

RT,分子量,強度

情報を持つデータ

= Entity = Feature

LC/MS注入

1回分のデータ = Sample

Experiment

例：ｺｰﾋｰ豆種類= Parameter

(6)

MPPソフトの概念と用語２

Interpretations（グループ定義） Analysis（Entity List及び解析結果のオブジェクト） Interpretations _{Interpretationは、MPPで読み込んだSample(データファイル)をグループ化して} 表示させる方法です。 Interpretationの元になるのはParameterです。 1つのSampleに複数のParameterが設定されている場合に、どのParameterでグループ化して表示し、クラスタ分析やt-検定、PCAなどを行うかを決めます｡ Analysis _{該当するSample(データファイル)を選択したInterpretationで解析した結果です。} プロジェクトを閉じる Experiment を作成する既にあるExperimentを Projectに追加する選択されたEntityの Entity Listを作成する選択されたEntity List のInspectorを表示する CSVなどで作成したファイルをEntity ListとしてImportする散布図を表示する Profile Plotを表示するヒストグラムを表示するマトリクスプロットを表示する Venn図を表示する箱髭図を表示するヒートマップを表示するスプレッドシートを表示する（Normal/Raw Abundance で選択可能) 各サンプルの統計情報を表示する新しいPathway を作成する

(7)

MPP用語集①

MPPの用語意味 Alignment (アライメント) アライメントは英語の「位置合わせ」の意味で、MPPではEntityを作成する際に行われます。 LC/MSやGC/MSのデータを読み込む際、複数のSample（データファイル）からそれぞれの化合物ピークの強度を1つのピーク情報としてまとめる必要があります。ただ、LC/MSもGC/MSも、測定毎に多少リテンションタイムやMSのm/zがずれることがあります。アライメントは、このような測定誤差を考慮して、リテンションタイムやm/zの許容誤差を設定します。 MPPへ読み込まれた複数のデータファイルのピークリスト（CEFファイルやELUファイル）に含まれるピークの情報（リテンションタイム、m/z、ピーク強度)から、アライメントの許容誤差範囲内のピーク同士をまとめて、1つのEntityとします。許容誤差から外れたピークは、別のEntityとしてMPPで扱われます。

Condition 設定されたパラメータ内にある各条件です。Parameterが経時変化なら、『1時間、2時間、3時間』がCondition、Parameterが製造場所なら、『A工場、_{B工場、C工場』がConditionに相当します。MPP用語集のParameterも参照。} Entity EntityはMPPのデータの取り扱い単位の一つで、GC/MSやLC/MSのデータに含まれる化合物ピークのことを指します。 Entityには、化合物ピークのリテンションタイム、モデルイオン(m/z)、各サンプルのピーク強度が含まれます。 Hierarchical Cluster (階層型クラスタ)分析階層型クラスタツリーは、データファイル間の距離を測り、距離の近いもの同士をまとめてクラスタとしてまとめていく手法です。以下の手順で計算されます。 1．データファイル間の距離(MPPではピーク強度の変動パターンの類似度)を全て測定する。 2．距離の近いデータ同士をそれぞれまとめてクラスタを作る。 3．それぞれのクラスタの位置(重心など)を計算する。 4．クラスタ同士の位置を測定し、近いものをクラスタとしてまとめる。 5．新しくできたクラスタの位置を計算する。 6．4→5を、1つのクラスタになるまで繰り返す。階層型クラスタは、計算が煩雑であるものの、k-means法のような「予めいくつのクラスタに分ける」ことが不要なため、適用範囲が広い手法と言えます。階層型クラスタでは、データやクラスタ間の距離を「デンドログラム」というツリーで表します。デンドログラムの距離が離れているクラスタやデータ同士は、類似度が低くなります。階層型クラスタ分析では、クラスタの位置や、クラスタ間の距離をどのように定義するかで、結果が異なることがあります。例えば、距離の位置の定義を｢クラスタ間の最短距離」とするか、｢最長距離｣とするかで、クラスタ間の違いを過小・過大評価することになります。また、距離の測定方法もMPPではいくつかの手法が提供されており、デンドログラムのクラスタ間の距離に影響を与えます。

(8)

MPP用語集②

MPPの用語意味 Indentified LC/MS(TOF,Q-TOF)やGC/MSDのデータをMPPに読み込む際に、「化合物名が(ライブラリサーチなどで)推定された」ピークリストをのことを「Identified」なピークリストといいます。また、GC/QQQ、LC/QQQのMRMデータ、GC/MSDのスクリーナー結果も「Identified」の形式でMPPに読み込まれます。 Interpretation Interpretationは、MPPで読み込んだSample(データファイル)をグループ化して表示させる方法です。 Interpretationの元になるのは「Parameter（HelpファイルにはConditionとも表記されることあり)」です。 1つのSampleに複数のParameterが設定されている場合に、どのParameterでグループ化して表示し、クラスタ分析やt-検定、PCAなどを行うかを決めます｡また、1つのParameterで複数回測定したデータ(レプリケイト；再現性などの確認のために取られたデータ)の強度を平均化するかどうかも、設定することができます。 k-means k-meansクラスタ方は、古くから行われているクラスタ分析法で、データをあらかじめ「k個」のクラスタに分けることを決めてから、実際にデータを整理していく手法のことです。例えば、あるデータの散布図上にある測定データを「4個」に分類する、と決めてクラスタ分析を行う場合、4k-means法といいます。実際の計算は、以下のとおりです。 1．散布図上にランダムに4点のポイントを置く。 2．データファイルと4点のポイントとの距離を測り、データファイルを一番近いポイントとして分類する。(データファイルは4つのクラスタに分類される) 3．各クラスタの重心を計算する。(4つの重心が求まる) 4．3で求めた重心と、各データとの距離を測り、データファイルを一番近いポイントとして分類する。(データファイルは4つのクラスタに分類される) 5．上記3→4を、重心が移動しなくなるまで繰り返す。 k-means法は計算もそれほど煩雑でないため古くから行われていた手法ですが、最初のクラスタ数（kの値）をどのように決めるかで結果が異なるため、kの値が既知の実験でないと妥当性のある結果が得られない、と言われております。そのため、MPPのクラスタ分析は、k-means法よりもHierarchical Cluster (階層型クラスタ)をまず行い、その結果から妥当なkの数を見つけてk-means法でEntityを分類するワークフローが提案されています。 Parameter Parameterは実験条件のことで、データを測定した条件のことを指します。 1時間、2時間、3時間がConditionなら、『経時変化』がParameter、A工場、B工場、C工場がConditionなら、『製造場所』がParameterに相当します。 Conditionをまとめる概念です。 Unidentified Unidentifiedは、MPPにLC/MS(TOF,Q-TOF)やGC/MSDのデータファイルを読み込む際に、「化合物名が(ライブラリサーチなどで)推定されていない」ピークリストをのことをいいます。 Unidentifiedで読み込まれたEntityのCompound Nameは「m/z＠RT」の形式で名前が付けられます。 GC/MSDのAMDISの場合は、ELUファイルをUnidentifiedファイルとして読み込みますが、AMDISのIdentifiedのピークリストであるFINファイルに含まれるピークは、ELUファイルにも含まれます。

(9)

Mass Profiler Pro. (MPP)のワークフロー、、、その前に

Entity Listの作成 データファイルの 読み込み ピークアライメント （Entityの作成） Entityのフィルター （ノイズ除去） グループ定義 データの準備 PCA（主成分分析） 階層型クラスタ分析 統計的有意差によるEntity 抽出 t-検定、ANOVA解析 分けて見つける IDBrowser （化合物の推定） Class Prediction （判別分析） 推定する

Entity Listの出力 ChemStation, MassHunter_での解析

詳細のクロマトグラム・マススペクトルを解析する ChemStation, MassHunter でデータを取る。 実験計画を検討する。 目的、仮説など。 条件を満たすEntityを探す （Venn図）

(10)

MPPによる解析に持ち込むまでの

Agilentプラットフォームのデータ処理概略

分析装置

SQ or QQQ ChemStation AMDIS (.elu) Target analysis TOF, QTOF or QQQ Target analysis or Non-target analysis target analysis MFE (.cef) Find by Formula (.cef) LC/MS GC/MS TOF, QTOF QQQ SQ _QQQ Non- target Target Quant Report (.xml) Quant Report (.xml) “Unidentified” or

“Combined” experiment “Identified” experiment

“Unidentified” or “Combined” experiment “Identified” experiment Target analysis or Non-target analysis Quant Report (.xml) “Identified” experiment Target Non- target Target analysis ICP-MS Quant Report (.xls, .csv) “Identified” experiment

(11)

Mass Profiler Pro. (MPP)のワークフロー

(12)

Analysis Workflow（Baselining Option設定後に起動）

Summary Report _{Experiment Grouping} (Interpretationも作成)

Filter Flags

Filter By Frequency QC on samples

(表示のみ) Significance Analysis/Fold Change

(13)

Workflow（Baselining Option設定後）メニュー一覧

主に上から順に

設定します

(14)

(15)

Projectはexperimentの上位構造です。（例：project名 metabolites

Experiment名 LCMS_positive, negative, GCMS_positive, negaive など)

ProjectとExperiment作成(1/2)

project

Experiment 1 Experiment 2

(16)

ProjectとExperiment作成(2/2)

同定、未同定混合の場合は “Combined” MRMデータ等、全化合物が同定されている場合は“Identified” 化合物が全く同定されていない場合は“Unidentified” ※重要：正しく選択してください まずはMPP、オプションがある場合は Pathwayも選択可 Data Import：データ取り込み Analysis：限定された解析の流れ Class Prediction：判別分析

この画面は合成してあります

(17)

Data Import Wizardの流れ：

MS Experiment Creation Wizard (1/11)

TOF LC/MSデータ

Pathway解析(page 155)の場合のみ正しく選択することが必須です

(18)

(19)

(20)

MS Experiment Creation Wizard (5/11)

(21)

MS Experiment Creation Wizard (6/11)

最終的に全てにグループ名を付けます

(22)

MS Experiment Creation Wizard (7/11)

特定の保持時間領域のみでの比較や一定のイオン強度以上の化合物のみで比較を行いたいときに使用します。

(23)

MS Experiment Creation Wizard (8/11)

化合物のアライメント（LC/MSの場合）

RT Window= 0.1% + 0.15 min

Mass Window= 5.0 ppm + 2.0 mDa

既知物質を用いて保持時間の補正を行なう場合、 Perform RT correlationをチェックし、with standardsを選択します。 CE/MSではMT(MPP内ではRTと表示されます), m/zに よるアラインメントを測定条件によって変化させますが、この値を大きくすると異なる化合物を同一と誤認識するフォールスポジティブのリスクが高くなりますので注意が必要です。具体例は後述します。

(24)

MS Experiment Creation Wizard (9/11)

点の色はFrequencyを表します。

再現性の悪いものは赤色で、全て

のサンプルに共通して存在し、アラ

イメントされたものは青色で表示さ

れます。

アライメント条件が厳しいと、

Frequencyが低いEntityが増えます。

結果を見ながら必要に応じてBack

ボタンで前画面に戻り、アライメント

条件やFilter条件を修正します。

(25)

MS Experiment Creation Wizard (10/11)

(26)

MS Experiment Creation Wizard (11/11)

化合物強度の正規化を行ないます。次ページから詳しく説明しますが、サンプル間の変動の絶対値で比較したい場合はBaseline to (median / mean) of (all / control) across samples、

サンプル間の変動の比率で比較したい場合はZ-Transformを選択してください。

(27)

0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000

sample A sample B sample C

compound 1 compound 2

sample A

0 900000

sample B

1000

1000000

sample C

1100

970000

正規化 (1) None

各正規化法による化合物強度の差をプロットする例として、

左下テーブルの様な実験データが得られたとします。

Baselining optionsでNoneを選択すると、正規化は行われません。

よって、全てraw data abundanceで比較することになるので、直観的には理解しやすいのですが、

正規化を行うと、Normalized abundance = 0は必ずしも

raw data abundance = 0を意味しなくなります。

他に存在量の多い化合物が存在すると(ここでは、compound 2)、存在量の少ない化合物の変動が

相対的に小さなものとされてしまいます。

(28)

正規化 (2) Baseline to (median / mean) of (all / control)

across samples

compound 1 compound 2

sample A

0 900000

sample B

1000

1000000

sample C

1100

970000

正規化

前ページで示された化合物強度を中央値か平均値で正規化します。

下記は、各化合物の中央値との間の差に変換する場合の説明です。

(eg. Compound 1: 中央値=1000, Normalized abundance of A = 0-1000 = -1000)

中央値をNormalized abundance = 0とするため、

絶対値の変動の大きい化合物が強調されますが、

化合物間で広いダイナミックレンジを持つサンプルでは、変動比率が大きくても強度変動の

絶対値が小さい化合物は全く変動していないかの様に見えてしまいます。

compound 1 compound 2

sample A

-1000

-70000

sample B

0 30000

sample C

100

0

-80000 -60000 -40000 -20000 0 20000 40000

sample A sample B sample C _{compound 1} compound 2

(29)

正規化 (3) Z-Transform

compound 1 compound 2

sample A

0 900000

sample B

1000

1000000

sample C

1100

970000

正規化

Z-Transformは強度変動の比率を考慮した正規化方法です。

Baselining optionsでZ-Transformを選択すると、各化合物強度は

前ページで求めた、各化合物の中央値との差をそれぞれの化合物強度の

標本分散で割った値に変換されます。

生体由来などの様に存在量の多い化合物、微量な化合物が混在しているサンプルでは

有効な手法ですが、Quality Controlを行い、信頼性の低い(サンプル群内の繰り返し再現性を

チェックすることで除去することが出来ます)entityを除かなければ

相対強度0.1%から1.0%に増加したノイズを10倍に変動した化合物とみなしてしまうことになります。

compound 1 compound 2

sample A

-0.004054054 -3.98734E-05

sample B

0 1.70886E-05

sample C

0.000405405

0

-0.0045 -0.004 -0.0035 -0.003 -0.0025 -0.002 -0.0015 -0.001 -0.0005 0 0.0005 0.001

sample A sample B sample C

compound 1 compound 2

(30)

MS Experiment Creation (正規化None)

全く同一データですが、縦軸の

正規化の違いだけで大きく見え方が

異なることに注意が必要です

(31)

MS Experiment Creation (正規化Z-transform)

全く同一データですが、縦軸の

正規化の違いだけで大きく見え方が

異なることに注意が必要です

(32)

(33)

仮にn=4で測定した場合、その4つのファイルが同一の群であることを宣言しなければなりません。群を表すパラメーターは複数設定することができます。（例：男性or女性、20代or30代or40代、、日本人orアメリカ人or中国人）

サンプル群の定義

“Experiment Grouping”を

選択し、グループを示す

パラメーターを与えます。

p.21で設定済みの場合は不要です。

(34)

同じパラメーターを繰り返し入力するのは面倒なのですが、

どうにかなりませんか？？

指定したいサンプルをドラッグで選択後、”Assign Values”を選択すると、一括でパラメーターを入力することができます。

(35)

Replicateはどの様に用意したら良いのでしょうか？

また、１つのサンプル群当たりどのくらいのreplicateが必要なのでしょうか？

T I M E

0 wks 2 wks 6 wks

n=3

_n=3

n=3

×3 injection ×1 injection ×1 injection ×1 injection

Technical replicate

_{Biological replicate}

Technical replicateから得られることが出来るのは測定誤差のみです。個体差を考慮することは出来ません。また、Aを3回分析した結果を平均化することは厳密にはサンプル群 0wks, Treated を代表していることにはなりません。例えreplicateの数を増やしていったとしても、それは個体A を代表した値になります。 Biological replicateはreplicate数を増やすことで、サンプル群(例：2wks, Treated)の真値に近づくことが出来ます。 Replicateの適正数ですが、Biological replicateであればn=10はほしいところです。実験のコスト(時間的なコスト含め)を考えた上で設定してください。本マニュアルで使用しているデータは Technical replicate, n=3の実験系になっています。 A B C D E F

(36)

Interpretations (Categorical, Non-averaged)

“Create Interpretation”を選択し、”Categorical”と

”Non-Averaged”では、ばらつきを評価しやすい

表示です。

(37)

Interpretations (Categorical, Averaged)

“Create Interpretation”を選択し、”Categorical”と

”Averaged”では各Condition毎の平均表示です。

4 n x 6 group = 24 群という扱われ方だったのですが、4回測定を平均化し、 1 x 6group = 6群の比較にまとめました。

(38)

Interpretations (Numerical, Averaged)

“Create Interpretation”を選択し、”Numerical”と

”Averaged”では各Condition毎の平均表示です。

各Condition内での再現性が良好で計時変化を視覚化したい場合等に有効です。

(39)

サンプル群の表示順を並び替えたいのですが、

どうすればいいでしょうか？

Profile plot、もしくはMatrix plotの画面上で右クリックをし、 “Properties”を選択してください。 Columnsタブ上で移動させたいサンプル群を選択し、上下に移動させてください。表示順の入れ替えは、平均化の前後どちらでも行うことが出来ます。

(40)

100%

66%

QC: Filterを使ってEntity中から再現性の悪いデータポイントを除きます。

“Filter by Frequency”を選択し、サンプル群内でシグナルが現れる頻度によってフィルターをかけることができます。具体的にはn=3測定中、2回以上現れるデータポイントを採用するのであれば、この値は66.6%となります。次ページ参照。 FilterをかけることでEntity数が絞り込まれていることを確認してください。

(41)

Filter by Frequencyの例

at least 100% of all samples at least 66% of samples within each condition

● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

● ● ○ ● ● ● ● ● ●

at least 100% of samples in only one condition ● ● ● ● ● ○ ● ● ●

● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ● ● ○

○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ○ ● ● ○ ● ● ●

● ● ○ ● ● ● ● ● ○

○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ● ● ○ ● ● ○

● ● ○ ● ● ○ ● ● ○

at least 100% of samples in at least one condition

● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○

○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ _{at least 66% of samples}_{in at least one condition}

○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ●

at least 66% of samples in only one condition

● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ○ ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ○ ● ● ○ ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ● ● ○ ● ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ （以下この組合せは省略） ● ● ● ● ● ○ ● ● ● ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ （以下この組合せは省略） ● ● ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ● ● ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 凡例 ● ：検出される ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ：検出されない

(42)

QC: Filterを使ってEntity中から再現性の悪いデータポイントを除きます。（２）

“Filter by Sample Variability”を選択し、

サンプル群内の

シグナル強度のCV値で

フィルターをかけることができます。

この項目は、全サンプル群中の何群で上記の再現性条件を満たしたかでEntityをフィルターすることを示しています。例では at least 8 out of 8 conditions となっていますので、8群全てで CV値が30%以下である化合物を残すことを意味しています。

< 40%

< 20%

< 30%

6

8

(43)

(44)

2群比較



Ｔ検定

；2つのサンプル群について有意差があるかどうかを検定



Fold解析

；2つのサンプル群のデータから、何倍の差があるかでフィルターをかける機能



Volcano Plot

; t検定とFold解析の結果を視覚化したもの

3群以上比較



ANOVA（分散分析）

;

3群以上のデータからの有意差があるかどうかを検定

表現方法

主成分(PCA)分析

；大まかな傾向を視覚化するツール



クラスタリング

；差のある化合物どうしをまとめるツール



判別分析

；未知試料がどの母集団に属するかを調べるツール

統計解析のためのツール

t検定 _A群 _B群 95%以上の確率でここに入る

(45)

T検定の限界

 2群間比較のみ

実験デザインが３群以上の場合、ANOVAが必須

 分散 (Variance) が小さい場合、平均差が殆どなくても ”統計的に差がある”

という結果が生じてしまう

→Fold解析との組合せが有効

→ Volcano Plot (→

page 95

)

 T検定だけでは、統計的に偽陽性を排除できない

多重検定補正が必要 (→

page 71

)

(46)

PRINCIPAL COMPONENTS ANALYSIS

(PCA, 主成分分析)

(47)

3D表示

2D表示

(48)

主成分分析 (PCA)

主成分分析は、一般的に、多くの変量の値をできるだけ情報の損失なしに，1個または少

数個の総合的指標(スコア)で代表させる方法です。サンプル間の違いを、LC/MSデータ

のクロマトグラムピークの情報を元にして、以下の式でスコア（得点）で表します。

サンプルのスコア（得点）＝

Σ （各EntityのLoading ｘ各ピークのピーク強度）

ここで、クロマトグラム中の

各ピークの重みつけであるLoading

は、サンプル間のスコア

が最もばらつくように計算された、各ピーク固有の係数です

[1]

_。

スコアは理論上、サンプルに含まれるピークの数だけ計算できますが、PCAの目的は

「

少数個のスコアでサンプル間の違いを解釈する」

ことですので、通常は1～3個のスコア

を求めて、スコアとLoadingの解析を行います。

サンプルの違いを表す情報量を最も表しているスコアから順番に第1主成分（

Component 1）、第2主成分（Component 2）・・・と呼びます。

[2]

サンプルごとの各主成分のスコアを表した図が「スコアプロット」、クロマトグラムピークの

各主成分のLoadingを表した図がLoading Plotになります。

[1]_{詳しい計算方法は、ケモメトリクスや統計解析の書籍を参照ください。ここでは、PCAをMPPで行う際、スコアを求めるためのLoading計算は、ソフト} ウェアで自動的に行われることのみ、ご紹介させていただきます。 [2]_{この章で扱う「主成分」という言葉は”サンプル間の違い”という情報量に対する言葉です。}

(49)

PCA(主成分分析)の基本的な考え方

試料A

試料B

試料C

ピーク① ピーク② ピーク③ 10 15 4 10 4 15 7 15 5

試料A～試料Cの特徴が分かるように、各ピークの

面積を元にして試料の総合得点(スコア)を付けるこ

とを考える。

ピーク

係数

試料

①

a

②

b

③

c

スコア(u)

試料A

10 15 4

10a+15b+4c

試料B

10 4

15 10a+4b+15c

試料C

7 15 5

7a+15b+5c

分散 (ばらつき)

s

1

s

2

s

3

s

u

すなわち、

u= ax

₁

+bx

₂

+cx

₃

となるスコアuを考える。(x

_1,

x

_2,

x

₃

はピーク①～③の面積値)

uの分散s

_u

が最も大きくなるような係数a, b, cを計算することで、試料A~試料Cのスコア

が最も離れて、特徴が区別できるようになります。

この計算は、MPPで自動的に計算されます。

(50)

PCAの計算結果(第1主成分)

試料A

試料B

試料C

ピーク① ピーク② ピーク③ 10 15 4 10 4 15 7 15 5

試料A～試料Cの各ピークの計算結果

ピーク

係数

試料

①

0.00 ②

-0.63

③

0.78 スコア(u)

試料A

10

15

4 -6.30

試料B

10

4

15

9.17 試料C

7

15

5 -5.52

s

1

s

2

s

3

s

_u

スコア(u)

-6.30

-5.52

9.17

結果から分かること 1.ピーク①は試料間の違いにあまり関与しない（係数が0) 2.ピーク②は試料間の違いを表すスコアuに“負の影響”を与える 3.ピーク③は試料間の違いを表すスコアuに“正の影響”を与える

(51)

PCAの計算 (第2主成分)

試料A

試料B

試料C

ピーク① ピーク② ピーク③ 10 15 4 10 4 15 7 15 5

試料A～試料Cの各ピークの第2主成分の計算

ピーク

係数

試料

①

d

②

e

③

f

スコア(v)

試料A

10*(1-0.00) 15*(1+0.63) 4*(1-0.78) 10d+ 24.42e+0.89f

試料B

10*(1-0.00) 4*(1+0.63) 15*(1-0.78) 10d+ 6.51e+3.33f

試料C

7*(1-0.00) 15*(1+0.63) 5*(1-0.78) 10d+ 24.42e+1.11f 分散 (ばらつき) s₄ s₅ s₆

_s

v

v= dx

₁

(1-a)+ex

₂

(1-b)+fx

₃

(1-c)

となるスコアvを考える。(x

_1,

x

_2,

x

₃

はピーク①～③の面積値)

vの分散s

_v

が最も大きくなるような係数d, e, fを計算することで、試料A~試料Cのスコア

が最も離れて、特徴が区別できるようになります。

この計算は、MPPで自動的に計算されます。

(52)

PCAの計算結果(第2主成分)

試料A

試料B

試料C

ピーク① ピーク② ピーク③ 10 15 4 10 4 15 7 15 5

試料A～試料Cの各ピークの計算結果(第2主成分)

ピーク

係数

試料

①

0.00 ②

0.82 ③

0.57 スコア(v)

試料A

10

15

4

20.56 試料B

10

4

15

7.25 試料C

7

15

5

20.69 s

1

s

2

s

3

s

_v

スコア(u)

-6.30

20.56

9.17

7.25 -5.52

20.69

結果から分かること 1.ピーク①は試料間の違いにあまり関与しない（係数が0) 2.ピーク②は試料間の違いを表すスコアvに“正の影響”を与える 3.ピーク③は試料間の違いを表すスコアvに“正の影響”を与える

スコア(v)

(53)

PCAのLoadingとScore

試料A

試料B

試料C

ピーク① ピーク② ピーク③ 10 15 4 10 4 15 7 15 5

スコア(u)

-6.30 20.56 9.17 7.25 -5.52 20.69

スコア(v)

ピーク

スコア

①

②

③

u

0.00 -0.63 0.78

v

0.00 0.82 0.57

各試料のスコアの係数をLoadingといい、スコアに与

える影響度を表す。

スコア(u) スコア(v) ① ② ③

Loading Plot

Score Plot

各試料の情報(属性など)からScore Plotのスコアu,vの意味付けを行い、その意味付けについて、クロマトグラム中の各ピークの影響度をLoading Plotから理解します。

(54)

主成分分析 (PCA, Score plot)

Next

各サンプルの傾向を視覚化するには、Score plotが便利です。

各サンプルの傾向を表示するためには、平均化していない Interpretationを選択する必要があります。また、ここで指定するentity listを再現性や統計的有意差によって絞り込むことで、各サンプル群のPCA結果が各々の特徴を反映していきます。

(55)

主成分分析 (PCA, Score plot)

Eigenvalues は各主成分の寄与率（情報量全体のうちその主成分が説明できる割合）を示しています。赤のプロットは各主成分の寄与率を、青のプロットは寄与率の累積値を示します。一般的に、この寄与率が70～80％以上であれば、よく説明されていると言われます。また、少ない主成分で多くの寄与率があるほど、よいモデルであると言われます。 3次元空間上でCtrlキーを押しながらマウスカーソルをドラッグさせると、軸を回転させることができます。また、Shiftキーを押しながらマウスカーソルを上下にドラッグさせるとズームイン・アウトができます。

(56)

(57)

データ処理によるPCA(主成分解析)の変化

PCA of the data

All entities (19786)

PCA of the data

Entities filtered by frequency (3744)

品種 A

品種 B

品種 C

FILTRATION FILTRATION

PCA of the data

Entites after ANOVA (p≤0.05) & Fold Change (≥2.0) (93)

各種、統計的フィルターを使って有意に差のある化合物を絞り込んでいくことで、サンプル群の傾向がはっきりしてくることがわかります。

後述する判別分析 (Page 121)ではこの様に特徴付けが明白なentity list

を用いることで、精度の高い判別結果が得られます。 Page 25参照

(58)

主成分分析 (PCA, Loading Plot)

PCAはサンプル群を三次元空間に表示するScore Plotだけでなく、各化合物を二次元上にLoading Plotで表示させることも可能です。

(59)

使用可能な統計の検定

2-Way

3-Way

T-Test

ANOVA

Time 24 hr

Time 0 hr

Time 24 hr

Time 48 hr

Time

0 hr

24hr

Treatment

Control

Drug A

Genotype

WT

KO

X

Time

0 hr

24hr

Treatment

Control

Drug A

X

One-way Tests: 一つのパラメータでサンプルグループを比較する。

N-way Tests: 2つ以上のパラメータでサンプルグループを比較する。

(60)

2つのサンプルグループを比較するOne-way Tests

パラメトリック検定:

• T-test unpaired

• T-test paired

• T-test unpaired unequal

variance

ノンパラメトリック検定

• Mann-Whitney unpaired

• Mann-Whitney paired

(61)

Paired T-tests

もっとも一般的な組み合わせの例としては、

例えば右の表のように、変数として各個人を

表し、もう一つの変数として、コーヒーを“飲

む前”と“飲んだ後”の器用さといったような、

ものがあります。

もし、各個人の個人差が大きく、“コーヒーの

効果” が小さい場合は、t-testでコーヒーの

差を検出するには非常に多くの個人の情報

（Biological replicates）を集めないといけま

せん。

paired t-testを使用することで、グループ間

の変動が、グループ自身の変動より小さい

場合でも、統計検出力をt-testよりも高める

ことができます。

Dexterity

Before

Coffee

Dexterity

After

1 Cup of

Coffee

Dan

5.4

3.9 Kelly

5.9

4.5 Tom

7.6

6.3 Janet

8.2

7.9 David

4.7

5.0

(62)

Parametric Test (パラメトリック検定)

正規分布は上記の図のように釣鐘型の形をしており、平均値に対して左右対称の形をして

います。平均値から両側

1σ(標準偏差)までの面積が全体の 68.26% 、2σまでの面積が全

体の95.44%、3σまでが全体の97.5%の面積を占めます。

MPPのパラメトリック統計検定(Parametric statistical tests)では、各化合物ピークのアバン

ダンスが正規分布の母集団からサンプリングされたと仮定して検定を行います。

パラメトリック統計検定(Parametric statistical test)の不等分散(unequal variances)では、

比較するサンプルグループの分散(

σ

2

_{)が等しくないという前提で検定を行います。}

Expression of Gene X

頻度

µ = 母集団平均 σ = 母集団標準偏差

(63)

Non-parametric Tests (ノンパラメトリック検定)

Non-parametric Testsは正規分布を前提としません。

サンプルグループ間の分散が等しくないと想定します。

測定サンプルデータの標準化データ(Normalized Data)の順番に番号をつけ、標準化デ

ータ逸脱値の影響を減らします。

サンプルグループ間の繰り返し回数（replicates）が少ないと、同じサンプルグル

ープでパラメトリック検定（parametric tests）を行った場合に比べて、統計的検出

力は少ないです。

Gene X Untreated Normalized Intensity Treated Normalized Intensity Untreated Rank Treated Rank Replicate 1 4.5 1.3 6 2 Replicate 2 .7 1.7 1 3 Replicate 3 2.3 3.5 4 5

(64)

3つ以上のサンプルグループを比較するOne-way Tests

パラメトリック検定

• ANOVA

• ANOVA unequal variance (Welch

ANOVA)

• Repeated measures

ノンパラメトリック検定

• Kruskal Walis

• Friedman

(65)

Repeated Measures ANOVA

もし、各個人の差が大きく、、“コー

ヒーの効果” が小さい場合は、

ANOVAでコーヒーの差を検出する

には非常に多くの個人の情報

(Biological replicates)を集めないと

いけません。

Repeated Measures ANOVA を

使用することで、グループ間の変動

が、グループ自身の変動より小さい

場合でも、統計検出力を高めること

ができます。

Paired t-testと同様に、各個人の個

人差による変動を効率よく除去する

にはいくつかの段階を経る必要があ

ります。

Dexterity

Before

Coffee

Dexterity

After

1 Cup of

Coffee

Dexterity

After 2

Cups of

Coffee

Dan

5.4

3.9

3.7 Kelly

5.9

4.5

4.6 Tom

7.6

6.3

6.0 Janet

8.2

7.9

5.8 David

4.7

5.0

3.2

(66)

(67)

P-value の計算方法

Asymptotic Method(漸近法)

• 算出の前提として、化合物ピークのアバンダンスが正規分布をして各分布の分

散が等しいとします。

• よって、検定で使用されるパラメータ (t-ratio, f-ratio) も同様に正規分布すると仮

定し、計算します。

• これらの前提をしないで計算する場合は、以下のPermutation

Methodでp-valueを計算します。

Permutation Method(並べ替え法)

• 潜在的に存在する分布を想定しません。

• サンプルを並べ替えて、調査のためのテスト評価基準の分布を作成します。（

Permute samples and build distribution of test metrics for probe）

• P-value は順番に並べられた計算値が実測値よりも大きくなる割合です。（the

fraction of permutations in which the test metric computed is larger than the

actual test metric for that sample)

(68)

Permutation testとは

ある観測で、

A集団の平均＞B集団の平均

という結果が得られたとする。その平均値の差をxとする。

ここで帰無仮説：

A集団の平均=B集団の平均

として、AとBのサンプルを１つにまとめ、サンプルサイズ=nからなる母集団からランダムに

とってきた集団とみなす。

この集団をランダムな２つの集団に分け直す。この場合、サンプルの組み合わせは全部で

（n）C（1/2n）通り。

もしA,Bの属する母集団が同じであって平均値の違いはたまたま生じた差だとすれば、全

ての組み合わせの中でも、xより大きな差は頻繁に見られるはず。

そこで、「全ての組み合わせについて平均値の差を計算して」、xより大きい組み合わせが

いくつあるか数える。それが、全ての組み合わせのうち5％を越えていたら「たまたま生

じた差」とみなす。

(69)

What p-value Cut-off to Use?

Depends on what type of error

you are more comfortable with

• Type I の誤り (false positive): 有意差が

ないのにあると判定されてしまった

• Type II 誤り (false negative): 有意差が

あるのにないと判定されてしまった。

P-ValueのCut-offはtype I の誤りと

type IIの誤りのトレードオフとなる。

5HT1c 0.002364 NFL 0.002649 NMDA2C 0.017181 aFGF 0.027544 GRa3 0.041179 actin 0.045342 nAChRd 0.046372 EGFR 0.0468 bFGF 0.087842 5HT2 0.106591 Brm 0.137903 SOD 0.147089 mGluR2 0.174708 IGF.I 0.223558 SC2 0.274809 trkC 0.288776 mGluR1 0.313801 SC6 0.343059 CNTFR 0.354717 pre-GAD67 0.366955 BDNF.rat 0.417615 GDNF 0.421125 IP3R2 0.421308 L1 0.443525 GAD67 0.462416 H2AZ 0.561907 IP3R1 0.573717 MK2 0.630177 CCO2 0.640797 mGluR3 0.654866 PDGFa 0.659352 IGF.II 0.683554 CNTF 0.690512 nAChRe 0.701041 IGFR2 0.728141 GAP43 0.732078 ODC 0.745628 SC1 0.74575 NT3 0.78811 PTN 0.795557 trk 0.82403 mGluR5 0.8305 cjun 0.839991 Ins2 0.841945 MAP2 0.851833 neno 0.879299 GRb1 0.888485 TCP 0.892361 GRb2 0.900601 S100beta 0.930265 本当は有意差があるサンプル。本当は有意差がないサンプル。 p-value=0.05

検定で有意差が

あると判定

検定で有意差が

ないと判定

(70)

Ｔ-検定、およびANOVAによるentityの絞り込み

Next Next Next 3群以上の比較にはANOVA を選択してください。 ANOVAにより、entityがp値で絞り込まれました。 P値はデフォルトで0.05 (棄却域5%) になっていますが、この数値を小さくすると、より化合物数が絞られます。

(71)

(72)

統計の多重検定の問題点

• 統計計算を多くの化合物ピークで行うため、5%のp-valueでも、ちりも積もれば

かなりの量となる。

– 10000 peaks = 10000 回、個別に統計検定を実施

– p-value = 0.05 として10000 のピークに対して検定を行うと・・・

• 500 peaks (0.05 x 10000) でType Iの誤りが発生する可能性がある。

• 統計検定の回数を増やせば増やすほど、それに比例してfalse positiveも増加してしまう。

• 統計解析を行う前に、データのQuality Controlを行うことで、false positiveの数

を減らすことができる。

• 多重検定補正(

m

ultiple

t

esting

c

orrection：MTC) を行うことで、更にfalse

positiveを減らすことができる。

(73)

MPPの

M

ultiple

T

esting

C

orrection (多重検定補正)

オプション

F

amily-

w

ise

e

rror

r

ate (FWER)

– Bonferroni

– Bonferroni Holm

F

alse

D

iscovery

R

ate (FDR)

– Benjamini Hochberg

Individual (genewise) error rate (p-value cut-off)

(Probability of false positive for each test)

(74)

Multiple Testing Correction の例

以下の通り変数を定義します。

• N = MTCを行う前にANOVAを通過したピーク数

• P

_i

= MTCを行わない、ピークiのp-value

• 

= ユーザーが設定したp-cutoff値

• P

post i

= MTCを行った後の、ピークiの p-value

計算を行うために、以下の値を代入します。

• N = 100

• 

= 0.05

(75)

Family-wise Error Rate MTC: Bonferroni

FWER = 0.05で100個の化合物ピークを検定した時に

• P

₁

= 0.0002

• P

₂

= 0.0004

• P

₃

= 0.0006 ….. P

₁₀₀

という値であったとすると、

• P

post₁

= (0.0002)*(100) = 0.02

• P

post₂

= (0.0004)*(100)

= 0.04

• P

post₃

= (0.0006)*(100)

= 0.06

となります。結果としては

• 0.02 < 0.05



化合物強度に

有意差があると認められる

• 0.04 < 0.05



化合物強度に有意差があると認められる

• 0.06 > 0.05



化合物強度に有意差があるとは認められない

複数回繰り返された検定全体において帰無仮説が棄却される可能性を、

family-wise error rateと呼びます。

(76)

Family-wise error rate MTCの問題点と解決方法

Family-wise error rateの調整は、「何回検定を繰り返しても、全体

の

_{αレベル(family-wise error rate)は0.05を超えないようにするぞ}

！」という非常に保守的な方法です。したがって、本当は有意差が

あるのに、帰無仮説が棄却されないというType II (false

negative)の誤りが問題になります。

そこで、ある程度Type I (false positive)を許容して、Type IIを起こ

す可能性を小さくする方法の一つとして、false discovery rateを

調整するという方法が開発されました。false discovery rateは、

簡単に言うと、「棄却された全ての帰無仮説のうち、Type Iが含ま

れている確率」です。

(77)

False Discovery Rate MTC: Benjamini & Hochberg

統計検定の結果(ANOVA, two-sample t-tests etc.)から得られた 100個のp-value

を降順に並べます

(P

₁

>P

₂

>…>P

_N

)

例

:

P

₁

= 0.0499….

P

₆₅

= 0.0339

P

₆₆

= 0.0333

P

₆₇

= 0.0311 ……P

₁₀₀

各P-valueに、100/(その番号)を掛けたものをP

post_i

とします。

P

post₆₅

=(100/65)* 0.0339 = 0.0522

- > 0.05



有意差は認められない

P

post₆₆

= (100/66)*0.0333 = 0.0505

- > 0.05



有意差は認められない

P

post₆₇

= (100/67)*0.0311 = 0.0464

- < 0.05



有意差が認められる

よって p

post

67

から p

post100

は有意差があるとして、その中に潜在的なfalse positive のピーク

(78)

More false

negatives

More false

positives

多重検定方法の使い分け

> Family-wise Error Rate

• 非常に保守的で一切のFalse Positiveを許さない。

> False Discovery Rate

• MTCで検出されたピークに、p-value分のFalse Positiveが存在する。

(False positive a percentage of called peaks)

> None

• 検定で用いたピークに、p-value分の割合でFalse Positiveが存在する。

(False positive a percentage of peaks being tested)

Bonferonni FWER

Bonferonni Holm FWER

Benjamini Hochberg FDR

(79)

MPPの統計

(80)

なぜ、post-hoc testが必要なのか? (1)

One-way ANOVA model

• 帰無仮説：

グループ間の平均値に有意差はない、と仮定。

• H

₀

: µ

₁

= µ

₂

= µ

₃

= µ

₄

= µ

₅

• ここでもし H

₀

が棄却されても、何が棄却されたか、といった情報は得られません

。

どの条件で棄却されたかを知るにはどうしたらいいでしょうか？

ここでは、1つの化合物ピークで5つの条件を仮定します。

(81)

なぜ、post-hoc testが必要なのか? (2)

可能な解決策：

各条件の組み合わせで、2群のt-testを実施する。

H

₀

: µ

₁

= µ

₂

= µ

₃

= µ

₄

= µ

₅

• この場合、5つの条件があるため、全部で10通りの組み合わせの検定を行う必要がある

。

• 複数回の検定→false positive の増加

その他の解決策:

post-hoc testの実施

• false positiveを減らすことができる。

(82)

Post-hoc Test

MPP post-hoc testオプション:

• Tukey’s Honestly Significant Difference (HSD) test

• Student-Newman-Keuls (SNK) test

Tukey’s と SNK の検定はいずれも正規化されて等しい分散であると仮定して実

施されます。

• One-way testで有意差があると認められた化合物ピークだけがPost-hoc testにかけら

れます。

• Post-hoc testは、正規化されて等しい分散であるという過程で選んだOne-way testで行

った場合に、妥当な結果が得られる。

有意差があると認められた化合物ピークについて、各条件のピークアバンダンス

の平均を、ペアで比較していきます。

Tukey の方がSNKよりもconservativeな結果になります。

(83)

Post-hoc Tukey Test

ANOVAで有意差が認められた化合物ピークXの5つの条件について、以下の帰無仮説を立てます。

H

₀

: µ

₁

= µ

₂

= µ

₃

= µ

₄

= µ

₅

ここで、各条件での化合物ピークのアバンダンス平均を以下の通りとします。

X

₁

= 32.1 X

₂

= 40.2 X

₃

= 41.1 X

₄

= 44.1 X

₅

= 58.3

それぞれのpairwise q to critical value q (for group)を計算し比較します。

– 5 vs. 1: significant (reject H₀: µ₅= µ₁)

– 5 vs. 2: significant – 5 vs. 3: significant – 5 vs. 4: significant – 4 vs. 1: significant

– 4 vs. 2: not significant (does not reject H₀: µ₄= µ₂)

– 4 vs. 3: not necessary – 3 vs. 1: significant – 3 vs. 2: not necessary – 2 vs. 1: significant

Final results:

32.1 40.2 41.1 44.1 58.3

or

µ1≠ µ2= µ3= µ4 ≠ µ5

(84)

Post-hoc Group サマリー結果

Box

をクリックした後に

Union

また

は

Intersection

いずれかをクリック

すると、ボックスに含まれる化合

物ピークの

Entity

リストを作成する

ことができます。

青いBoxは2つの条件で

有意差が認められた化合

物ピークの数になります。

オレンジ色のBoxは2つの条

件で有意差が認められなか

った化合物ピークの数になり

ます。

(85)

統計解析

(86)