Title
Basic studies on the alkaline phosphatase isoenzymes extracted
from various organs( 内容の要旨 )
Author(s)
和田, 博
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(農学) 甲第097号
Issue Date
1997-03-14
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/2438
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(国籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の 要件 研究科及 び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 貞 和 田 博 (岐阜県) 博士(農学) 農博甲第97号 平成9年3月14日 学位規則第4条第1項該当 連合農学研究科 生物資源科学専攻 岐阜大学
Basic studies on the alkaline phosphatase isoenzymes extracted from various organs
主査 岐 阜 大 学 教 授 柘 植 治 人 副査 静 岡 大 学 教 授 竹 内 久 直 副査 信 州 大学 教 授 黒 沢 辰 一 副査 岐 阜 大 学 助教授 早 川 亨 志 論 文 の 内 容 の 要 旨 アルカリホスファターゼ[1LP.orthophosphoric血OnOeSter phosphohydrolase(alka-1ineoptiDum)EC3.1.3.1]は生体内で重要な役割を果たしているといわれており､実験 動物における基礎的研究は重要である｡しかし､研究の基礎となるラットの血清中のALP アイソザイムの測定に関しては､各種条件によりそのアイソザイムの数が異なるといわれ､ 一定の結果が得られていない｡このことがALP研究の進展を遅らせている原因と考え､ ①血清ALPの測定法の確立を目的として､一定条件下においてポリアクリルアミドゲル電 気泳動(PAG即による血清ALPアイソザイムの分画と組織由来を検討し､血清ALPアイソ ザイムの測定法を確立した｡② ①において確立した方法が有益であることを立証するた め､いまだに十分解明されていない低栄養条件下におけるALPのアイソザイムパターンの 活性変動を検討した｡ 実験動物としては6過齢のSD系堆ラットを用い､1週間予備飼育の後､眼高静脈叢よ り採血し､血清を電気泳動に供した｡組織からのALPは肝臓､腎臓､小腸および骨より Saini&I)oneの方法により抽出し､電気泳動に供し､その分子量を測定した｡また､血清 ALPアイソザイムの分子量と比較し､組織由来を判定した｡さらに､血清ALPアイソザイ ムの各バンドのアミノ酸による阻害度を検討した｡電気泳動は､Ready GelsJ(5-10%)を
のアイソザイムの活性はⅠ血age Analyzer Vlにより定量した｡ALP活性はBessey-LoYry 法で､また､分子量はSDS-PIGE ProteinStandardsⅡighRangeを用いて測定した｡ その結果､1)血清から､PAGEにより3本のILP活性バンド(Sl,S2,S,)が検出 された｡それぞれの分子量は､188,157,137kDaであった｡各組織中のALPアイソザイ ムについても､それぞれの分子量を求め､血清の3本のバンドの分子量と比較したところ､ Slの分子量は回腸由来のバンド(Il)の分子量に一致した｡しかし､S2,S,の分 子量に一致する組織ALPアイソザイムは見出し得なかった｡また､レフェニールアラニン (L-Phe)はSlを､L-ホモアルギニン(L-Ⅱlrg)はS2,S,を阻害した｡これらのことか ら､血清ALPのS】は小腹由来であることが判明した｡しかし､S2,S,についてはさ らに検討する必要があった｡なお､血清ALPアイソザイムの分子量が組織ALPアイソザイ ムの分子量と必ずしも一致しなかったが､一般に血液中に分泌されるタンパク質は､糖鎖 で修飾されるのが通例であるから､そのためではないかと考察している｡ 次に､2)骨由来で血液中に出現するALPアイソザイムを特定する目的で､小麦胚芽レク チン(IGA)を用いて､血清ALPとの結合実験をおこなった｡すなわち､粗製のIGAを自家 精製し､これをラット血清に添加した後､37℃､30分間培養し､遠心分軌こて■上宿"､ `沈殿"に分け､`†GA添加前の血清'と共に電気泳動に供したところ､上清からは2本 のバンド(Sl,S2)が認められたが､沈殿には活性のバンドは認められなかった｡こ れは､ALP活性を有するタンパク質が､IGAと複合休を形成し､巨大分子化し､ゲル内に 入らなかったためと推察した｡そこで､回収した沈殿をN-aCetyl-D-glucosaJIine(GIc-NAc)-epOXy-aCtivated Sepharose6Bカラムにかけ､GIcNIcを溶出剤としてアフィニティ ークロマトグラフィーを行った｡そうして得た両分を､PAGEで調べるとS,の位置に活性 バンドが検出され､この結果から､S,は骨由来と断定された｡ さらに､3)SD系堆ラットの絶食期間中の血清ALPアイソザイムの変動を検討した｡絶食 前､絶食後16,24･40時間に採血し､各時点での血清ALP活性､L-PbeあるいはL一弘rg添 加時の活性の減少量を測定し､絶食により血清ALPの総括性が減少すること､及び､PA GE上ではSlの減少が顕著で､S2及びS3活性には変化が認められなかった｡ 以上の実験から､新しい骨由来ALPの同定法を提案すると共に､ラット血清中に観察さ れる3本のALPアイソザイムのうち､Slは小腸由来､S,は骨由来､S2はその他の組 織由来であろうと結論した｡また､絶食により低下する血清ALPはS,であり､S2, S3 は変動しないと結論した｡ (文 献) 1)Yada,臥,NiYa,N.,hyakaYa,T.and Tsuge,臥(1996)J.Nutr.Sci. Vitaninol.42,435-447. 2)Yada,1･,NiYa,N.,‡ayakaYa,T.andTsuge,且.(1997)Exp.Ami血. 46,89-92.
審 査 結 果 の 要 旨 本論文は､動物の殆どの組織･器官で認められるアルカリホスファクーゼ[EC3. 1.3.1‥ ALP]の､動物におけるアイソザイムパターンを､主としてポリアクリルアミ ドゲルを用いた電気泳動法で､活性染色および特異的な酵素阻害剤を組み合わせるこ とにより､詳細に検討したt)のである｡ALPは､アルカリ性領域に最適pHを有する リン酸エステルの加水分解反応を触媒する酵素であるが､未だに明確な生理作用が解 らない酵素の一群でもある｡そして､細胞膜に結合して存在する膜結合酵素のため､ 抽出の方法如何で､切り出される酵素の分子量が異なること､血清中に複数のALP活 性を有するタンパク質バンドが現れるが､その起源がどの臓器由来か不明である｡一 方､ある種の病気の時､また､種々の薬物摂取時､さらに種々の生理条件の変動に際 してその総活性およびアイソザイムパターンを変えることが知られているが､完全に
解明されていない｡そこで､ラットを用いて､ALPアイソザイムの性質を調べ､臨床
診断上のモデルを提供し､あるいは､薬物等の安全性評価の一環として利用するため の方法論を提供することを目的として行われたものである｡ すなわち､実験動物としてはSD系ラット堆を用い､一定条件下で､採血､各種臓器 を摘出しSainiとDoneの､`n-ブタノール抽出法一 により1LPを膜から抽出し､一 定条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後､活性染色に供した｡ その結果､1)血清には､通常､3本のバンド(SI,S2,S,と呼ぶ)が現れ､ それぞれの分子革は188,157,137kDaであった｡また､肝臓(2本)､腎臓(2本)､ 小腸(2本､部位によって分子量は異なる)および骨(1本:分子量は110kDa)か ら抽出されたアイソザイムパターンの分子量と比較して､Slは回腸由来のⅠ.であ る可能性が高いことを指摘した｡2)血清中に存在するILPのうち､小麦胚芽レクチン (IGA)と強固に結合し複合体を形成するS,は､骨からn-ブタノール抽出法で得られ総活性が変化する事実に注目し､どのアイソザイムが変動するかを､経時的に絶食さ せたラットから血液を採取しILPの侍異的阻害剤であるフェニールアラニン(L-Phe) およびホモアルギニン(L一月止g)を用いることによりSlの減少であることを証明した｡ 以上の成果は､日本栄養･食糧学会と日本ビタミン学会の共同編集になる英文誌､ 堕旦!_r.Sci.VitaJninol. 化435-447(1996)および日本実験動物学会の刊行する ′ヽ.′l′1′
