成人呼吸器感染症患者から分離されたインフルエンザ菌の 薬剤耐性と耐性遺伝子変異の経年的検討
神奈川県立循環器呼吸器病センター呼吸器科
萩原 恵里 綿貫 祐司 椎原 淳 松嶋 敦 榎本 崇宏 関根 朗雅 土屋 典子 馬場 智尚 篠原 岳 遠藤 高広 十河 容子 西平 隆一 小松 茂 加藤 晃史 小倉 高志 高橋 宏
（平成 20 年 12 月 11 日受付）
（平成 21 年 4 月 9 日受理）
Key words : Haemophilus influenzae, β -lactamase, β -lactamase non-producing ampicillin resistance（BLNAR）, penicillin birding protein 3（PBP3）,drug resistance
要 旨
呼吸器感染症の主要な起炎菌の一つであるインフルエンザ菌の薬剤耐性化と遺伝子変異について，呼吸器 検査材料から分離された同菌を経年的に比較検討した．2007 年 1 月から 12 月までの 1 年間に当院で成人呼 吸器感染症患者の呼吸器臨床検査材料から分離されたインフルエンザ菌 122 株について，TEM-1 型 β-ラク タマーゼ遺伝子とペニシリン結合蛋白（PBP3）遺伝子変異の出現状況を解析し，薬剤感受性試験結果と照 合して 2002 年と 2005 年の同データ と 比 較 し た．122 株 の う ち ABPC の MIC が 1 µ g ! mL 以 下 の 感 性 株
（BLNAS）は 71.0％，MIC が≧2 µ g ! mL で β -ラクタマーゼ活性のない ABPC 耐性株（BLNAR）は 25.3％， β - ラクタマーゼ産生株（BLP）は 3.7％ であった．BLNAS の比率は 2002 年・2005 年と比して大きな変化は 認めず，経年的に減少している BLP の比率は 2007 年もさらに減少していた．遺伝子変異の解析では，耐性 遺伝子をもたない gBLNAS は 2002 年・2005 年と比して徐々に増加していた．PBP3 遺伝子の変異を有する gBLNAR と gLow-BLNAR の合計は 2002 年から 2007 年の間ほぼ横ばいであったが，変異を 1 カ所のみに 生じた gLow-BLNAR が 2002 年に比して減少しているのに対し 2 カ所に変異を生じた gBLNAR が増加して いた．LVFX に対する感受性はすべての遺伝子型群で引き続き概ね良好であり，β-ラクタム系の中では注射 剤では CTRX，内服剤では CDTR-PI の MIC
90が最も低かった．ABPC や CDTR-PI における MIC 分布では gBLNAR による新たなピークが形成されつつあったが，いずれのピークも MIC 値は低値であり，ABPC と CDTR-PI は適正に用いれば引き続き同菌に有効である．
〔感染症誌 83：355〜362，2009〕
序 文
インフルエンザ菌は呼吸器感染症の主要な起炎菌の 一つであるが，近年本菌の薬剤耐性においては，β-ラ クタマーゼ陰性のアンピシ リ ン 耐 性 菌，す な わ ち BLNAR（β-lactamase non-producing ampicillin resis- tance）の増加が問題となっている
１）．BLNAR におけ る耐性機構は，細胞壁合成に必要なペニシリン結合蛋 白（PBP）をコードする ftsI 遺伝子上にみられる変異
による PBP3 のアミノ酸置換によるもので
２），一カ所 のみアミノ酸置 換 し て い る 株 は 軽 度 耐 性 の gLow- BLNAR，アミノ酸置換が二カ所にみられる高度耐性 株は gBLNAR と区別されている
３）．また， β-ラクタマー ゼ と PBP3 変 異 の 両 方 を 有 す る 株 gBLPACR（β- lactamase producing amoxicillin ! clavulanic acid re- sistance）も検出されるようになってきており，イン フルエンザ菌の β-ラクタム系薬剤耐性化の機序は複 雑化している
４）．
当院での同菌の耐性状況を経年的に解析すること は，我が国の動向を推測しうるものではないものの，
原 著
別刷請求先：（〒236―0051）横浜市金沢区富岡東 6―16―1 神奈川県立循環器呼吸器病センター呼吸器科
萩原 恵里
Fig. 1 Annualchangesin ABPC-susceptibility phenotype.
ABPC susceptibility wasassessed by micro-broth dilution and allstrainswere classified into BLNAS or BLNAR based on the CLSI standard.β-lactamase activity was tested with acidometry.
多数の慢性呼吸器疾患患者を有する呼吸器専門病院と して報告する価値があると考える．今回我々は，当院 呼吸器疾患患者の呼吸器検査材料から分離されたイン フルエンザ菌の薬剤耐性化の状況を薬剤耐性遺伝子変 異と共に解析することにより，薬剤耐性がどの遺伝子 変異で起こっているものかを明らかにし，その経年的 変化を検討し傾向を分析したので報告する．
対象と方法
1．対象
2007 年 1 月から同年 12 月の 1 年間に当院呼吸器科 で診療を受けた成人呼吸器感染症患者の呼吸器臨床検 査材料から分離されたインフルエンザ菌 122 株を対象 とした．122 株のうち喀痰からの分離は 113 株，気管 支洗浄液からは 7 株，気管痰からは 2 株であった．
2．薬剤感受性測定
各種抗菌薬に対する MIC 測定は，当院臨床検査部 において保険診療範囲内で通常行われている Clinical and Laboratory Standard Institute（CLSI）基準に準 じた微量液体希釈法により行った．すなわち，チョコ レート培地にて培養の後，シーメンスの HTM ブロス に能書どおりの菌量に調節して接種し，シーメンス MICroFAST パネル 4J プレートに自動イノキュレー ターにて分注，37℃ で 18 時間培養の後当院検査技師 が目視で判定した．ただし，2005 年までの MIC 測定 は，当院独自の注文プレートを用い長瀬産業の MIC 2000 で自動測定していた．
感受性有無の判定も，同様に CLSI 基準に基づいて 行った．β-ラクタマーゼ産生の有無はアシドメトリー 法により行った．
3．耐性遺伝子解析
分離したインフルエンザ菌株は凍結保存し，107 株 について，（1）TEM-1 型 β-ラクタマーゼ遺伝子，（2）
ftsI 遺 伝 子 に 1 カ 所 の 変 異 を も つ い わ ゆ る pbp3-1
（gLow-BLNAR），（3）ftsI 遺伝子に 2 カ所の変異をも ついわゆる pbp3-2（gBLNAR）の遺伝子変異・出現 の有無を，生方らの開発した PCR 法
２）を用いて明治製 菓医薬総合研究所にて検討した．菌種同定のための P6 蛋白遺伝子の検索も同時に行った．
結 果
1．薬剤感受性試験
2007 年 に 分 離 さ れ た イ ン フ ル エ ン ザ 菌 122 株 の ABPC に対する感受性の結果から，ABPC の MIC が 1µg! mL 以下の感性株（BLNAS）は 71.0％，MIC が≧
2µg! mL で β-ラクタマーゼ活性のない ABPC 耐性株
（BLNAR）は 25.3％，β-ラクタマーゼ産生株（BLP）
は 3.7％ であった．
1997 年からの ABPC 感受性の経年変化をグラフ化
し Fig. 1に 示 し た．感 性 菌 で あ る BLNAS の 比 率 は
2000 年までは減少し続けていたが，2000 年以降急激
に比率が 70％ 以上に回復し 2007 年もそれを維持して
いた．また，BLP は 1998 年をピークに減少し続けて
おり，2007 年もさらに減少していた．この 2 つの群
Table 1 β-lactam antibioticMIC50and MIC90
MIC90(μg/mL) MIC50(μg/mL)
Antibiotic
4 0.5
ABPC
256＜
1 CTM
1 0.12
CTX
0.25 0.12
CTRX
2 0.25
CFPM
8 0.5
CZOP
32 2
CCL
256＜
0.25 CFIX
0.5 0.12
CDTR-PI
1 0.12
MEPM
8 1
CVA/AMPC
4 0.5
SBT/ABPC
Fig. 2 Changesin geneticβ-lactam resistance patterns.
PBP3 ftsIgene mutationsand TEM-1 β-lactamase gene existence were studied using polymerase chain reac- tion (PCR).Note changesfrom 2002 to 2007.
以外のいわゆるフェノタイプから推定される BLNAR は，2002 年から 2007 年までは微増していた．
Table 1に 2007 年分離同菌 122 株に対する β-ラクタ ム系薬の MIC
50と MIC
90を示す．注射薬では CTRX，
内服薬では CDTR-PI の感受性が最も維持されてい た．
2．耐性遺伝子変異
Fig. 2に 2002 年以降の耐性遺伝子変異に基づく経 年変化を示す．β-ラクタム剤に対する耐性遺伝子をも たない gBLNAS は，2002 年の 43％ から 2007 年 50％
へと近年 5 年間で徐々に増加しており，薬剤感性株の 比率が回復傾向にあることが示された．TEM-1 型 β- ラクタマーゼ遺伝子陽性株 gBLP は，2002 年の 10％
から減少し 2005 年以降は 4％ 以下の低値となってい た．PBP3 遺 伝 子 変 異 を も つ gBLNAR と gLow- BLNAR の 合 計 は，全 体 で は 2002 年 47％，2005 年 51％，2007 年 46％ と増加傾向にはなかったが，内訳 をみると変異 1 箇所のみの gLow-BLNAR が減少しつ つあり，2 箇所の変異をもつ gBLNAR が増加しつつ あった．しかし，2005 年よりはその比率も回復して おり，全体としては耐性遺伝子の出現は 2005 年より も減少していることがうかがわれた．
3．代表的薬剤の MIC 分布と耐性遺伝子変異 ABPC の MIC 分布と耐性遺伝子の関係を Fig. 3に 示す．CLSI 基準である MIC が 2µg! mL 以上のもの を耐性とすると，耐性化率は 2002 年の 30％ から 2007 年の 33％ と著増はなく，gLow-BLNAR の感受性も 改善している様子がみられるが，gBLNAR による新 たなピークが 1 µ g ! mL の部位に形成されつつあり，二 峰性化が進みつつあるものと思われた．しかし，新た なピークは 2005 年の 2µg! mL に対して 2007 年では 1 µg! mL と改善していた．また，2002 年と 2005 年に 1〜
数株認めた BLPACR は 2007 年には検出されなかっ た．
β-ラ ク タ ム 系 内 服 薬 で 最 も MIC
90の 低 か っ た
CDTR-PI の MIC 分布と耐性遺伝子の関係を Fig. 4に
示す．CLSI 基準である 2 µ g ! mL 以上の耐性株は 2007
年も 5％ 以下であったが，ABPC と同様に gBLNAR
による新たなピークが形成されつつあり，2007 年に
Fig. 3 ABPC MIC distribution and geneticβ-lactam resistance patterns. MIC ofABPC and the geneticpattern ofβ-lactam resistance wasillustrated in the figure.
The x-axisindicatesthe value ofthe MIC,and the y-axisindicatesthe numberofstrains. The dotted line indicatesthe breakpointforresistance in the CLSIguidelines.
はそれがより鮮明になっていた．2005 年までと 2007 年の MIC 測定プレートが異なるため新たなピークの MIC 値が異なるように見えるが，これは ABPC のよ うに改善したものか，元々 2005 年時にも 0.25µg! mL
だったものかは不明であった．
Fig. 5に LVFX の MIC 分布と耐性遺伝子の関係を
示す．2005 年にはみられなかった，MIC が 2 µ g ! mL
と 4µg! mL の gBLNAR を 1 株 ず つ 認 め た が，MIC
90Fig. 4 CDTR-PIMIC distribution and geneticβ-lactam resistance patterns. Note CDTR-PIMIC and geneticβ-lactam resistance patterns.The dotted line isthe resis- tance breakpointin CLSIguidelines.
は 0.12 未満と低値に保持されていた．
考 察
インフルエンザ菌は呼吸器感染症の主要な起炎菌の
一つであり，エンピリック治療のターゲット菌種とし
て想定される機会が多い
５）．同菌の耐性状況を知るこ
とは，抗菌薬を適正に使用するためにも重要である．
Fig. 5 LVFX MIC distribution and geneticβ-lactam resistance patterns.
Note LVFX MIC and geneticβ-lactam resistance patterns.The dotted line isthe resistance breakpointin CLSIguidelines.
今回我々は，当院成人呼吸器検査材料から分離された 同菌の薬剤感受性を，薬剤耐性遺伝子変異とともに解 析し，経年的に比較検討した．今回の結果は当院の抗 菌薬使用状況を反映するものであると思われるが，当 院の経口抗菌薬の処方は，呼吸器科医の数が多く全員 が抗菌薬の処方に対し一定の知識を持っているため偏 りは比較的少ないものと思われる．ただし，他院と比 較して慢性気道感染症患者が多いためキノロン剤の処 方比率が他院より多い可能性はある．
CLSI 基準でみる ABPC 感受性は，2000 年までは 耐性化が進む一途であったが，2002 年からは感受性 が回復しその後耐性化は進んでいなかった．この原因 は明らかではないが，2002 年以降は抗菌薬の適正使 用がより浸透したことが一因ではないかと考えられ る．2002 年以降，MIC が 1 µ g ! mL 以下の ABPC 感性 株は実に 7 割を占めており，慢性呼吸器疾患を多く有 する呼吸器専門病院であることを考えると好ましい結 果と思われる．
分離された 122 株のうち 107 株について薬剤耐性遺 伝子出現状況を検討したところ，TEM-1 型 β -ラクタ マーゼを有する gBLP は 2002 年から減少していたが，
これは全国的な状況とほぼ同じであった
６）７）．耐性遺伝 子をもたない gBLNAS は経年的に増加しており，薬 剤 感 受 性 の 回 復 傾 向 と 一 致 す る 結 果 で あ っ た．
BLNAR の中では，2005 年までは gLow-BLNAR が減 少し高度耐性株 gBLNAR の割合が増加していたが，
gBLNAR も 2007 年にはやや減少しており，全体とし てインフルエンザ菌の薬剤耐性遺伝子出現はここ数年 増加が止まっているとみられる．これを裏付けるよう に，PBP3 遺伝子変異と TEM-1 型 β-ラクタマーゼ遺 伝子の両方を有する gBLPACR は 2002 年と 2005 年 には数株ずつみられていたが，2007 年には 1 株も認 められなかった．当院に限らず全国的に成人から分離 される同菌の耐性化が回復してきているのは，成人で はキノロン剤の選択肢もあり抗菌薬使用が元々セフェ ム系に偏りすぎていないことや，呼吸器科では特に適 正な抗菌薬使用法が広く普及してきていることなどに よるものと考えられる．
β-ラクタム系薬のうち，注射剤では CTRX，経口剤 で は CDTR-PI に お い て 最 も MIC
90が 低 か っ た
８）． CDTR-PI の作用はインフルエンザ菌の PBP3 変異の 影響を受けにくいことが知られており
９），他のセフェ ム系薬に比して優れた抗 BLNAR 活性を示すことは 以前にも報告されている
１０）１１）．また，CDTR-PI 以外の 多くの経口 β-ラクタム剤では BLNAR の示す MIC を はるかに下回る血中濃度しか得られないこともあり，
安易な β -ラクタム剤使用がさらに BLNAR を増加さ せる原因にもなりうることを示唆している．今回の検
討では CDTR-PI の MIC が 4µg! mL 以上の株が数株 あるとの結果にみえるが，この点については解釈に注 意が必要と思われる．2007 年の結果ではすべての β- ラクタム系薬において MIC が 4µg! mL 以上あるいは 16µg! mL 以上の株が認められたが，微量液体希釈法 による同菌の感受性測定が目視で行われており接種菌 量などにより判定がばらつくことが不正確な結果を生 ん で い る こ と は 否 定 し き れ な い．い ず れ に し ろ，
CDTR-PI は最大量である 6 錠! 日が呼吸器科領域で処 方されることも多くなってきており，今回の結果から は最大量を用いればほとんどの場合臨床的に有効と考 えられ，また今後最大量を必要とする場面が増えるこ とも予想される．
薬剤別に MIC 分布と耐性遺伝子変異との関係を分 析すると，ABPC と CDTR-PI の MIC 分布にお い て gBLNAR による新たなピークが形成されていること が明らかとなった．BLNAR の割合は増加していない にもかかわらず，BLNAR の中で gLow-BLNAR が減 少し gBLNAR が増加したためと考えられるが，この ピークには今後も注意が必要である．一方，2005 年 までと 2007 年では MIC 測定に用いたプレートが異な るため CDTR-PI での新たなピーク値の単純比較は困 難であるが，ABPC のピーク MIC は 2µg! mL から 1 µg! mL へと改善されており，gLow-BLNAR の感受性 は 2007 年には改善していることもみてとれる．ABPC と CDTR-PI で形成されている新たなピーク値は，ま だそれぞれの薬剤を十分量適正に用いれば対処可能な 範囲であり，引き続きこれらの薬剤は十分臨床効果が 期待できるものと思われる．LVFX においては，MIC 分布は 95％ 以上が 0.12µg! mL 未満であり，インフル エンザ菌に対して依然強い抗菌力を保っていることが 示されている．同菌に対するキノロン剤の位置付けの 重要性
１２）を再認識させる結果である．しかし，今まで みられなかった MIC が 4 µ g ! mL の耐性株が 1 株検出 されており，この結果の解釈にも慎重を要するものの，
新たな LVFX 耐性出現については今後も慎重に観察 していく必要がある．
文 献
1
）綿貫祐司，小田切繁樹，高橋 宏，小倉高志，富 岡敏昭：喀痰より分離された β -ラクタム系薬耐 性インフルエンザ菌の起炎性に関する臨床的検 討．感染症誌 2004；78：873―8.
2
）Ubukata K, Shibasaki Y, Yamamoto K, Chiba N, Hasegawa K, Takeuchi Y, et al.：Association of amino acid substitutions in penicillin-binding protein 3 with beta-lactam resistance in beta- lactamase-negative ampicillin-resistant Haemo- philus influenzae. Antimicrob Agents Chemother 2001；45：1693―9.
3
）生方公子，千葉菜穂子，小林玲子，長谷川恵子，
紺野昌俊：本邦において 1998 年から 2000 年の 間に分離された Haemophilus influenzae の分子疫 学解析．日化療会誌 2002；50：794―804.
4
）Ohkoshi Y, Yokota S, Sato K, Hayashi T, Mat- suda K, Kuwahara O, et al.：Antibiotic suscepti- bility of Haemophilus influenzae strains isolated from various clinical sources in Hokkaido Pre- fecture, Japan. J Infect Chemother 2008；14：
93―8.
5
）後 藤 元，武 田 英 紀，河 合 伸，芦 野 有 悟，渡 邊 卓，岡崎充宏，他：呼吸器感染症患者分離 菌の薬剤感受性について（2005 年）．Jpn J Antibi- otics 2008；61：209―40.
6
）Niki Y, Hanaki H, Yagisawa M, Kohno S, Aoki N, Watanabe A, et al.：The first nationwide sur- veillance of bacterial respiratory pathogens con- ducted by the Japanese Society of Chemother- apy. Part 1 : a general view of antibacterial sus- ceptibility. J Infect Chemother 2008；14：279―
90.
7
）帰山 誠，松川洋子，浅野裕子，松原茂規，澤
村治樹，宮部高典，他：岐阜県下で分離された イ ン フ ル エ ン ザ 菌 の 感 受 性 サ ー ベ イ ラ ン ス
（2006）．Jpn J Antibiotics 2008；61：195―208.
8
）Ohno A, Isii Y, Kobayashi I, Yamaguchi K：An- tibacterial activity and PK! PD of ceftriaxone
against penicillin-resistant Streptococcus pneumo- niae and beta-lactamase-negative ampicillin- resistant Haemophilus influenzae isolates from pa- tients with community-acquired pneumonia. J Infect Chemother 2007；13：296―301.
9
）三本木祐美子，大崎有美，前田久美子，鈴木貴
久，片岡裕史，井田孝志，他：インフルエンザ 菌のペニシリン結合蛋白 3 変異と β-ラクタム系 薬のクラスタリング．日化療会誌 2005；53：
121―7.
10
）Seral C, Suárez L, Rubio-Calvo C, Gómez-Lus R, Gimeno M, Coronel P, et al.：In vitro activity of cefditoren and other antimicrobial agents against 288 Streptococcus pneumoniae and 220 Haemophilus influenzae clinical strains isolated in Zaragoza, Spain. Diagn Microbiol Infect Dis 2008；62：210―5.
11
）Biedenbach DJ, Jones RN, Fritsche TR：Antim- icrobial activity of cefditoren tested against con- temporary (2004-2006) isolates of Haemophilus in- fluenzae and Moraxella catarrhalis responsible for community-acquired respiratory tract infections in the United States. Diagn Microbiol Infect Dis 2008；61：240―4.
12
