糖鎖複合糖鎖糖鎖複合糖鎖各種単糖類 ( グルコース, ガラクトース, マンノース, N- アセチルグルコサミン, フコース, シアル酸など ) がグルコシド結合で連なった一群の化合物結合様式, 重合度, 構成糖による構造多様性に起因する機能性, 分子認識性を有するタンパク質や脂質などに糖鎖

(1)

新潟大学新潟大学新潟大学新潟大学農学部農学部農学部農学部応用生物化学科応用生物化学科応用生物化学科応用生物化学科特定研究員特定研究員特定研究員特定研究員仁平仁平仁平仁平高則高則高則高則 N型糖タンパク質糖鎖のコア構造の型糖タンパク質糖鎖のコア構造の型糖タンパク質糖鎖のコア構造の型糖タンパク質糖鎖のコア構造の効率的生産技術の開発効率的生産技術の開発効率的生産技術の開発効率的生産技術の開発

(2)

糖鎖・複合糖鎖糖鎖・複合糖鎖糖鎖・複合糖鎖糖鎖・複合糖鎖糖糖糖糖鎖鎖鎖鎖複合糖鎖複合糖鎖複合糖鎖複合糖鎖細胞分化、老化、免疫応答など生命現象病原体による宿主認識、癌転移、炎症などの疾患に深く関与結合様式，重合度，構成糖による構造多様性に起因する機能性，分子認識性を有する。各種単糖類（グルコース，ガラクトース，マンノース， N-アセチルグルコサミン，フコース，シアル酸など）がグルコシド結合で連なった一群の化合物。タンパク質や脂質などに糖鎖が結合した化合物で，それぞれ糖タンパク質や糖脂質などと呼ばれる。 N _{型糖鎖，O 型糖鎖，糖脂質，GPIアンカー，プロテ} オグリカン，ペプチドグリカン，リポ多糖，S層糖タンパク質，莢膜多糖など

(3)

62,000 円 / 10 μg （ProZyme Inc.） β-1,4-Mannosyl-N,N’-diacetylchitobiose O O O H O H O H O H O H O O NHAc O H O H O O H NHAc O H アスパラギン結合型糖鎖アスパラギン結合型糖鎖アスパラギン結合型糖鎖アスパラギン結合型糖鎖細胞接着免疫調整シグナル伝達糖タンパク質の安定性・溶解性アスパラギン結合型糖鎖 β β コア構造マンノース _GlcNAc ガラクトースシアル酸 N _{型糖鎖の構造} 糖鎖およびそのコア構造を安価に生産できれば，医薬品素材として有効

(4)

×β-マンノシドなど合成困難 ○多様な構造に対応（1）有機合成保護合成脱保護 ×酵素，糖ヌクレオチドが不安定（2）糖転移酵素 NDP NDP ○重合度制御 ○厳密な位置選択性（３）加リン酸分解酵素（ホスホリラーゼ） ×多段階反応従来技術とその問題点従来技術とその問題点従来技術とその問題点従来技術とその問題点

(5)

オリゴ糖生産に有効厳密な位置選択性可逆反応ホスホリラーゼ P ＋＋糖1リン酸リン酸オリゴ糖単糖 P ホスホリラーゼによる高純度のオリゴ糖生産還元末端側の糖の変更によるオリゴ糖の多様性増大ホスホリラーゼホスホリラーゼホスホリラーゼホスホリラーゼ

(6)

BT_1033 R. albus 1,4-β-Man_n P R. albus ManGlcP B. fragilis ManGlcP 56% 58% 18% 322AA 390AA 335AA 386AA β-マンノシドホスホリラーゼの探索マンノシドホスホリラーゼの探索マンノシドホスホリラーゼの探索マンノシドホスホリラーゼの探索 B. thetaiotaomicron 1032 1033 1034 1035 1036 1037

phoA mfsT nahA nanH

1038 susC susD 1040 1039 pufA amn： α-Mannosidase pho： GH130 Phosphorylase

mfsT： Major facilitator superfamily transporter nah： β-N-Acetylhexosaminidase

nanH： α-Sialidase

enh： Endo-β-N-Acetyl-glucosaminidase

sus： Sus(Starch utilization system)-like system

amnA enhA マンノース _GlcNAc ガラクトースシアル酸 1 0 3 2 1 0 3 5 1 0 3 6 1 0 3 8 1 0 3 3 ?

ManGlcP: Mannosylglucose phosphorylase

(7)

ββββ-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase

ManGlcNAc Pi α-Mannosyl

1-phosphate GlcNAc

β-マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見

NMR

Nihira et al., J. Biol. Chem., 288, 27366 (2013).

Activity of BT_1033 ROH Km (mM) k_cat (s-1) k_cat/K_m (mM-1s-1) GlcNAc 3.8 37 9.6 GlcNAc₂ 27 22 0.8 GlcNAc 反応生成物 O HO HO HO O H O P O -O O -Man1P + R OH O HO HO HO OH O R HO P O -O O -+

(8)

β β β β---1,4-1,41,41,4---マンノシル-マンノシルNマンノシルマンノシルNNN--- -アセチルグルコサミンアセチルグルコサミンアセチルグルコサミンアセチルグルコサミンリン酸 αマンノース1-リン酸 N-アセチルグルコサミン Synthesis

新規酵素4-O-β-D-mannosyl-N-acetyl-D-glucosamine phosphorylaseの発見

β-1,4-マンノシル- N,N’ -ジアセチルキトビオースリン酸 O O OH O HO H OH O H O O NHAc OH O H O OH NHAc OH αマンノース1-リン酸 N,N’-ジアセチルキトビオース Synthesis standard0 min 10 min 60 min N,N’-diacetylchitobiose Retention time（min） β-1,4-Mannosyl-N,N’-diacetylchitobiose

Core trisacchride of N-linked sugar chain

1 g・・・

¥620,000,000

ＮＮＮ

(9)

ββββ-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase ManGlcNAc Pi α-Man1P GlcNAc

+

ホスホリラーゼによる生産法の問題点ホスホリラーゼによる生産法の問題点ホスホリラーゼによる生産法の問題点ホスホリラーゼによる生産法の問題点糖1リン酸が高価（αMan1P : 834,000円/g）安価な天然糖質からホスホリラーゼおよび各種酵素を用いて糖1リン酸を獲得する

(10)

糖1リン酸をつくるオリゴ糖をつくる安価な糖質オリゴ糖 P_i ホスホリラーゼホスホリラーゼ糖1リン酸リン酸糖受容体変換 P_i P_i ホスホリラーゼによるオリゴ糖生産システムホスホリラーゼによるオリゴ糖生産システムホスホリラーゼによるオリゴ糖生産システムホスホリラーゼによるオリゴ糖生産システム可能ならば変換・利用

(11)

GP α-PGM β-PGM G6PI M6PI PMM GalT GalE SP MP αGlc1P β-グルコシドの合成 Glc6P αMan1P β-マンノシドの合成 αGal1P β-ガラクトシドの合成麦芽糖 βGlc1P α-グルコシドの合成ショ糖澱粉

MP: maltose phosphorylase, SP: sucrose phosphorylase, GP: glycogen phosphorylase, PGM: phosphoglucomutase, G6PI: glucose 6-phosphate isomerase, M6PI: mannose 6-phosphate isomerase, PMM: phosphomannomutase

糖糖糖

(12)

ホスホマンノムターゼ Man6P イソメラーゼ Glc6P イソメラーゼ α-ホスホグルコムターゼスクロースホスホリラーゼショ糖ショ糖ショ糖ショ糖

*ManGlcNAcP: β-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase

αGlc1 αGlc1 αGlc1 αGlc1PPPP αMan1 αMan1 αMan1

αMan1PPPP Man6Man6Man6Man6PPPP Fru6 Fru6Fru6 Fru6PPPP Glc6 Glc6 Glc6 Glc6PPPP ManGlcNAc ManGlcNAcManGlcNAc ManGlcNAc GlcNAc GlcNAc GlcNAc GlcNAc P P P P P P P P P P P P P PP P P P P P P P P P ManGlcNAc P Fru Fru Fru Fru

*ManGlcNAc: β-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine ManGlcNAc

ManGlcNAc ManGlcNAc

(13)

ショ糖 N_{-アセチルグルコサミン} MgCl₂ リン酸ナトリウムグルコース1,6-ビスリン酸スクロースホスホリラーゼ α-ホスホグルコムターゼグルコース6-リン酸イソメラーゼマンノース6-リン酸イソメラーゼホスホマンノムターゼ ManGlcNAc ホスホリラーゼ 30℃ 250 mM 250 mM 10 mM 100 mM 20 μg/mL 33 μg/mL 340 μg/mL 370 μg/mL 230 μg/mL 2.4 mg/mL 83 μg/mL ManGlcNAc ManGlcNAcManGlcNAc ManGlcNAcの調製（ショ糖出発）の調製（ショ糖出発）の調製（ショ糖出発）の調製（ショ糖出発） ManGlcNAc Sucrose Fructose Suc Time (day) Fru MGN 0 12 34 567 8 収率42％で合成

(14)

•従来技術では合成困難なβ-マンノシドを，簡便に生産することに成功した。 •従来の合成法では，有機溶媒の使用やスケールアップの点で生成糖の用途が限られていたが， One-pot酵素合成法により安全性を担保した大量生産が可能となった。新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較新技術の特徴・従来技術との比較

(15)

•安全性の高い医薬品の原材料としての用途をはじめ，医療分野全般，食品分野，化粧品分野などへの利用が想定される。 •具体的には，疾病用のマーカー，iPSやES細胞の分化後の識別用マーカー，癌細胞や病原菌の除去フィルター，ドラッグデリバリーシステム，免疫寛容を組み込んだ糖タンパク質製剤としての利用など。想定される用途想定される用途想定される用途想定される用途

(16)

•出発材料にショ糖を用いた生産システムを開発したが，廃糖蜜などの廃棄物を利用した更なる低コスト化が可能か検討する必要がある。 •水酸基を修飾した糖を使用した実験データを取得し，有機合成法と連携をとる場合の条件設定を行なっていく。 •食品利用の場合，微生物汚染防止の観点から 60℃程度の高温反応が望まれるため，耐熱性酵素の探索が必要である。実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題

(17)

企業への期待企業への期待企業への期待企業への期待 •有機合成法，糖転移酵素による合成法など，従来の技術をもつ医薬品分野の企業で，本技術で生産されるマンノシドを材料とできる企業 •食品分野の企業で廃棄物（廃糖蜜など）利用を展開を考えている企業 •キチンオリゴ糖生産技術をもつ水産加工系企業で，糖鎖合成分野への展開を考えている企業などで，本技術が有効と考えられ，共同研究・開発を希望する。

(18)

•発明の名称： •出願番号： •出願人： •発明者：オリゴ糖合成酵素およびアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法特開2014-045704 新潟大学，農研機構食品総合研究所中井博之，仁平高則，鈴木絵里香，大坪研一，北岡本光本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権他，未公開特許1件

(19)

新潟大学産学地域連携推進機構産学地域連携推進センターＴＥＬ０２５－２６２－７５５４ＦＡＸ０２５－２６２－７５１３ e-mail [email protected] お問い合わせ先お問い合わせ先お問い合わせ先お問い合わせ先