アフィニティー分子マトリックス電気泳動

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(1)電気泳動第 58 巻第 2 号，pp. 27-29，2014 年 doi:10.2198/sbk.58.27. 〔特集：最新の電気泳動技術〕. アフィニティー分子マトリックス電気泳動松野裕樹・亀山昭彦＊産業技術総合研究所生物プロセス研究部門複合糖質応用研究グループ Affinity electrophoresis on supported molecular matrix electrophoresis Yu-ki Matsuno, Akihiko Kameyama* *Corresponding Author E-mail: [email protected]. （受付 2014 年 6 月 12 日，受理 2014 年 6 月 19 日）はじめに. タンパク定量により測定することで算出した. その結果,. アフィニティー電気泳動は, 生命科学研究において重要な役割を担ってきた分析手法である. これまで, ゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動など, 既存の電気泳動法をベースとしたアフィニティー電気泳動法が数多く報告されてきた. 疾患マーカーの分離検出, 弱い物質間相互作用の検出, 解離定数の算出など, その用途は幅広い 1). 分子マトリックス電気泳動（Supported Molecular Matrix Electrophoresis, SMME）は, 多孔質のポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜を支持体とし, その内部に吸着形成させたポリビニルアルコール（PVA）などの親水性ポリマーマトリックスを分離担体とする新しい膜電気泳動法である. ムチンなどの巨大糖タンパク質の分離解析法として開発し, その活用例や関連技術をこれまで報告してきた（本誌「分子マトリックス電気泳動」の項を参照）2‒6). 本稿では, レクチンを用いた糖タンパク質の分析を例として, SMME を利用する新しいアフィニティー電気泳動（Affinity-SMME）への試みを紹介する.. 上記の手順によって Con A を固定化した泳動膜を作製できることが分かった. しかし, 一度 PVDF 膜に吸着固定させた Con A の大部分が, 次の PVA 処理により剥離してしまうことも分かった. この剥離の程度, つまりレクチンの固定化効率は, レクチンの種類によって異なるだけでな. 図 1 Affinity-SMME 用泳動膜の作製手順. 泳動膜の作製. Affinity-SMME では, レクチンを PVDF 膜に疎水的に吸着固定させ, その後, PVA マトリックスを形成させるという手順により, レクチンを非動化させた泳動膜を作製できる（図 1）. この膜を相互作用解析に利用するには, レクチンの膜への固定化量を見積もる必要がある. そこで, コンカナバリン A（Con A）を用いて上記手順により泳動膜を作製し, レクチンの膜への固定化量を調べた（図 2）. Con A の固定化量は, PVDF 膜への吸着固定処理後, およびその後の PVA 処理後に得られる各溶液中の Con A 量を. 図 2 Con A の泳動膜への固定化量縦 6 cm 横 4 cm の PVDF 膜に対して 4 ml の Con A 溶液および PVA 溶液を使用. BCA 法により測定. 27. . 27.

(2) 電気泳動第 58 巻第 2 号，2014 年. く, ポリマーマトリックスとして使用する PVA の種類によっても異なることが分かってきている. Con A を用いた Affinity-SMME による α1-酸性糖タンパク質（AGP）の分離. 作製した Con A 固定化膜を用いて, AGP を泳動した結果を図3に示す. 通常1 本のバンドとして観察される AGP が, Con A を固定化した膜では 2 本のバンドに分離された. 下のバンドの移動度は, 固定化に使用した Con A の濃度に依存して遅れた. 従って, Con A 反応性の AGP グライコフォーム（糖鎖の違いにより区別されるサブポピュレーション）が, Con A との相互作用に基づく泳動の遅れによって分離検出されたと考えられ, 本法によるアフィニティー電気泳動が可能であることが実証された.. 図 4 a) セルロースアセテート膜（i）と SMME 膜（ii）におけるレクチンプローブ（Con A）の挙動（電圧印加後に Direct blue 71 により染色） b) Con A と AGP の解離定数の算出. 図 3 Con A を用いた Affinity-SMME による AGP の分離泳動緩衝液；0.1 M Tris-acetate buffer (pH 7.4)/1 mM calcium acetate, 泳動；0.5 mA/cm, 30 min, 検出；抗 AGP 抗体 → ECL. ンの濃度は一定に保たれる（図 4a, ii ） . この Affinity-SMME の特徴は, 膜電気泳動による解離定数の. . 算出に有効となる. 解離定数の算出には, 交差親和免疫電気泳動法において報告されている計算式の応用を解離定数の算出. 試みた 7). Bøg-Hansen らは, プローブやリガンドが完全に非動化されている場合, （1）式のように計算式を簡略化. 従来のセルロース系の膜電気泳動でもアフィニティー. できることを報告している.. 電気泳動は可能である. しかし, 解離定数の算出は簡単. 1/Rmi = 1/Rmo(1 + c/K) (1) ここで, Rmi はレクチン存在下での泳動距離, Rmo はレクチ. ではなく, 報告例はない. その理由として次のことが考えられる. レクチンなどを膜に含ませた状態で電気泳動を. ン非存在下での泳動距離, c はレクチンの濃度, K は解離. 行うと, レクチンは自身の電荷による移動に加えて蒸散. 定数を示している . Con A を用いた AGP の. 流や電気浸透流の影響を受けるため, 濃度を変化させ. Affinity-SMME の結果をもとに, 式（1）による解離定数の. ながら特定の位置にフォーカシングされてしまう（図 4a, i）.. 算出を行った. Con A の濃度は, 膜に吸着固定された. そのような状況下で行われるアフィニティー電気泳動で. Con A の量と, 重量から求めた膜中の水分量を用いて算. は, レクチンの濃度を定義できないため解離定数の算出. 出した. AGP の移動度の逆数（1/Rmi）を縦軸に, Con A の. は難しい. 一方, Affinity-SMME では, レクチンを膜に均. 濃度（c）を横軸にとってプロットした結果, ほぼ直線が得られた（図 4b）. 直線の横軸を切る点（1/Rmi = 0）が-K 値. 一に非動化させることができるため, 電気泳動中もレクチ 28. . 28.

(3) 電気泳動第 58 巻第 2 号，2014 年. を与えることから, 解離定数（K）として 18.2 × 10-5 M とい. 3) Matsuno YK, Dong W, Yokoyama S, et al. Improved. う値が得られた. この値は, 交差親和免疫電気泳動法で. method for immunostaining of mucin separated by. 報告されている値の約 10 分の 1 であった 7).. supported molecular matrix electrophoresis by optimizing the matrix composition and fixation. ゲル電気泳動とは異なり膜電気泳動では, 蒸散流が移動度に影響を及ぼすと考えられる. 蒸散流の強さは膜. procedure. Electrophoresis. 2011;32:1829–1836.. の位置によって異なるため, 膜電気泳動では観察された. 4) Dong W, Matsuno YK, Kameyama A. A novel. 移動度を補正する必要があるかも知れない（補正により K. procedure for Alcian blue staining of mucins on. 値は, 既報値に近づく可能性がある）. また, レクチンの PVDF 膜への疎水的な吸着固定が, 糖結合活性を低下. polyvinylidene difluoride membranes. Anal Chem. 2012;84:8461–8466. 5) Dong W, Matsuno YK, Kameyama A. Serum. させる可能性も否定はできない.. protein fractionation using supported molecular matrix electrophoresis. Electrophoresis. 2013;34:. おわりに. 2432–2439.. 本稿では, Con A による AGP の分離をモデルとして,. 6) Matsuno YK, Dong W, Yokoyama S, et al.. Affinity-SMME の概念実証と解離定数算出法への応用. Identification of mucins by using a method. について紹介した. PVDF 膜に疎水的に吸着固定できる物質ならば, 原理的にはここで示した方法によってアフィ. involving a combination of on-membrane chemical. ニティー電気泳動に利用できるため, 本法は応用面でも. Methods. 2013;394:125–130.. deglycosylation and immunostaining. J Immunol. 様々な展開が期待できる. また, 疎水吸着によりプロー. 7) Bøg-Hansen TC, Takeo K. Determination of. ブあるいはリガンドを簡単に非動化できる本法の特徴は,. dissociation constants by affinity electrophoresis:. それらの局所配置も可能にすることを強調しておきたい.. complexes between human serum proteins and concanavalin A. Electrophoresis. 1980;1:67–71.. 一方, PVDF 膜を電気泳動支持体に使用できることの利点は他にもある. これまでムチンの分離解析ツールと. 8) Matsuda A, Kuno A, Kawamoto T, et al. Wisteria. しての有用性を示してきたように, 分離後にムチンの O結合型糖鎖を膜上での化学処理により切り出し, 解析で. floribunda agglutinin-positive Mucin 1 is a. きることが本法の利点の１つである. 近年, 特定のレクチ. cholangiocarcinoma. Hepatology. 2010;52:174−182.. ンに反応性を示すムチンが, がんなどの疾患マーカー. 9) Tateno H, Matsushima A, Hiemori K, et al.. や iPS 細胞などの未分化細胞マーカーとしてみいだされ. Podocalyxin is a glycoprotein ligand of the human. ている. sensitive. . このようなムチンを分離し, その糖鎖構造を詳. 謝辞本研究は, 新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）「糖鎖機能活用技術開発プロジェクト」の一部および日本学術振興会（JSPS）科研費（23310154 および 23850019）の助成を受けたものである. 文献. NH.. Affinity. in. electrophoresis.. Electrophoresis. 2009;30:S229–S239. 2) Matsuno YK, Saito T, Gotoh M, et al. Supported molecular matrix electrophoresis: a new tool for characterization of glycolproteins. Anal Chem. 2009;81:3816–3823. 29. . for. Stem Cells Transl Med. 2013;2:265−273.. ると期待され, そのための技術開発が今後の課題となる.. Heegaard. marker. human. pluripotent stem cell-specific probe rBC2LCN.. 8, 9). 細に解析できるツールとして Affinity-SMME が活用でき. 1). biliary. 29.

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