プ ロ ビ タ ミ ンAに
関 す る 研 究
蚕 フ ン の カ ロ チ ノ イ ド に つ い て 一一
1959年10月15日 受 付北
村
光
雄鰍
緒 言 植 物 色 素 カ ロ チ ソ が ビタ ミソAと 同 じ生 理 的 効 力 を も って い る こ とを 最 初 に発 表 した のはEulerで あ る。 そ の 後Mooreに よ っ て カ ロ チ ソが 動 物 体 内で ビタ ミソA に変 化 す る こ とを 証 明 した 。 化 学 構 造 が カ ロチ ソに似 て い る色 素 を カ ロチ ノ イ ドとLeっ て,広 く動 植物 界に 存 在 し,ビ タ ミソA効 果 を 有 す る もの は α,β,y一 カ ロチ ソ のほ か に ク リプ トキサ ソ チ ソお よび10数 種 の カ ロチ ソ 誘 導 体 が あ る。 これ ら の カ ロチ ノイ ド色素 は 人 参,柑 橘 類 を は じめ,ク ロ ロ フ ィル を 含 む 緑 葉 に は 必 らず 存 在 し, プ ロ ピタ ミソAの よい 給 源 で あ る。 人 参 お よび 柑 橘 類 の カ ロチ ノ イ ド色 素 や そ の 抽 出 につ い て は多 数 の報 告i)2)3)4)5)が あ り,ま た 緑 葉 か ら クロ ロ フ ィル お よび カ ロ チ ノ イ ドを 分 離6)7)8)9)す る こ とが 多 く行 わ れ てい る。 ク ロ ロ フ ィル お よび カ ロチ ソの製 造 原 料 と し て,ア メ リカで は アル フ ァル フ ァ とい う牧 草 が 用 い られ9),日 本 で は 安 価 に 得 られ る蚕 フ ソ10)や海藻 が 用 い られ て い る。 蚕 は 桑 葉 を 食 べ て 発 育 す るが,桑 葉 の ク ロ ロ フ ィル お よ び カ ロチ/イ ドの 大 部 分 が 吸 収 さ れず に 排 せ つ され ,る。 この 蚕 フ ソ中 に は 粗 ク ロ ロ フ ィル2.4°0を 含 み, そ の不 ケ ソ化 物 は3644/gI.U.の ビ タ ミソA効 力 を有 す る カ ロチ ノイ ドが 含 まれ て い る11)。桑葉 の ク ロ ロフ ィル お よび カ ロチ ソ,キ サ ソ トフ ィル の 含 有 量 に つ い ては 奥 12),吉 田13)の報 告 が あ り,奥 は さ らに桑 葉 か らル テ イ ソ を 分 離14)して い る。 稲 垣15)は蚕 フ ソ よ り得 た赤 橙 色 油 状 の不 ケ ソ化 物 が ビタ ミソA効 力 を 有 す る こ とを認 め,外 観 β一 カ ロチ ソに 類 似 した 新 カ ロ チ ノ イ ド(C33H5203), mp.144∼145°(結 晶 メ タ ノ ール 含 有)の 結 晶を 得 た と 報 告 して い る。小 原 等11)は乾 燥 蚕 フ ソの ア セ トソ抽 出物 よ りク ロ ロ フ ィル の 含 有 量 お よび そ の 不 ケ ソ化 物 か ら不 明 の カ ロチ ノイ ドmp.179∼180° の結 晶 とシ トス テ リ ソに つ い て 報 告 して い る。 以 上 蚕 フ ソ中 に は 元 来 桑 葉 中 に 存 在 す る β一 カ ロチ ソ StudiesonProvitaminA.(chieflyonCaro-tenoidofSilkwormFeces.) 艱MitsuoKitamura . 及 び ル テ イ ソや 少 量 存 在 す るa,y一 カ ロチ ソ,ク リプ ト キサ ソチ ソが 分 離 確 認 され た 報 告 が な い 。 この こ とは桑 葉 の カ ロチ ノイ ドが 蚕 児 の 消化 液,蚕 フ ソの発 酵 や 乾 燥 あ るい は 実 験 操 作 中 に酸 化 分解 ま た は異 性 化 した ので は な い か と考 え られ る 。著 者 は 以上 の こ とか ら十 分 注 意 し て実 験 を 行 ひ,乾 燥 蚕 フ ソの エ ー テ ル抽 出物 か ら β一 力 冒チ ソお よび タ ラキ サ ソチ ソを分 離 確 認 し,さ らに ル テ イ ソ,y ,一カ ロチ ソ の存 在 を 認 めた 。 サ キ ソ トフ ィル と して 蚕 フ ソ中 か らタ ラキ サ ソ チ ソ を得 た こ と は興 味 あ る 問 題 で あ る。 な ほ 乾 燥 蚕 フ ソIOkgよ り 粗 キサ ソ トフ ィル と して 540mg,粗 カ ロチ ソ と して380nzgの 結 晶 を 得 た 。 以 上 の よ うに蚕 フ ソ抽 出物 の不 ケ ソ化 物 の中 に は 酸 化 して い な い カ ロチ ソを 多量 に含 有 す る ので プ ロ ビ タ ミソA給 源 と して 有 望 で あ る。 実 験 の 郡 一 1.抽 出 お よ び ケ ン 化 乾 燥 粉砕 した 蚕 フ ゾIOkgに エ ー テ ルを 加 え て冷 浸 出 し,、浸 出液 は これ を ロ過 し,さ らに殘 分 に エ ー テ ルを 加 えて 冷 浸 出 す る こ とを 数 回 く りか え した 。 エ ー テ ル浸 出 液 は40°C以 下 で 二酸 化 炭 素 気 流 中で 滅 圧 濃 縮 し,エ ー テル 抽 出 物3718(3.7%)を 得 た 。 この 抽 出物 を エ ー テ ルに 溶 解 し,メ タ ノ ール 性 飽 和 水 酸 化 ナ ト リウム液 を 加 え て よ く振 り,2日 間 冷 ケ ソ化 す る 。 ケ ソ化 後水 を 加 え て,ク ロ ロ フ ィル お よび 油 脂 類 を 除 いた 。 エ ー テ ル 層 は さ らに メ タ ノ ール 性 飽 和 水 酸 化 ナ ト リウム液 を 加xて 再 ケ ソ化 し,完 全 に 加 水 分 解 す る。 エ ー テ ル 層 は永 で よ く洗 い,無 水 硫 酸 ナrリ ウ ムで 乾 燥 して か ら二 酸 化 炭 素 気 流 中 で エ ー テル を 留 去 し,濃 赤 色 油状 の 不 ケ ソ化 物1658(44.5%)を 得 た 。 2.キ サ ン トフ ィ ル の分 離 不 ケソ化 物 よ りキサ ソ トフ ィル の分 離 概 要 は 図1の 通 りで あ る。 不 ケ ソ化 物 に600ccの 石 油 工 一テ ル を 加 え て 振 れ ば多 量 の赤 褐 色 の沈 澱 と ス テ リソが 析 出す る。 一 夜 冷 蔵 庫 に放 置 した 後 これ を ロ別 し,こ れ を 少 量 の エ ー テ ル に溶 し,石 油 工 一 テ ルで 再 沈 澱 して ロ過 す る。 こ の結 晶を エ ーテ ル,メ タ ノ ール 混液(1:1)で 再 結 晶す る と, 一12北 村;プ ロ ビ タ ミ ソAに 関 す る 研 究 色 素 と ス テ リソ の混 合結 晶 を得 た 。 こ の結 晶を メ タ ノ ー ル にふ ゆ う し,か き まぜ て機 械 的 に 色 素 の結 晶 のみ を集 め る。 結 晶 は420sngで 〃ψ.182∼184° で あ る 。 これ を さ らに メ タ ノー ル,エ ー テ ル混 液(1:1)よ り再 結 し, mp.183∼185° の 結 晶 を 得 た 。 この結 晶 を ベ ソ ゾ ール に 溶 解 し,酸 化 ア ル ミナ を用 い,ク ロ マ トグ ラ フ ィを 行 い, 展 開 溶 媒 と して40%ア セ トソを 含 む 石 油 工 一 テル を用 い て展 開 す る と3層 に 分か れ る。 上 層 は 薄 い褐 色,中 層 は橙 赤 色 の濃 い 部分 で,下 層 は薄 い橙 黄 色 で あ る。 こ の 中 層 を と り出 し,メ タ ノー ル を含 む エ ー テ ルで 溶 出 し, mp.184∼186° の結 晶 を 得 た。 さ らに こ の結 晶を エ ー テ ル,メ タ ノ ール 混液(1:1)で 数 回 再 結 晶 を 行 い,mp. 185∼186° の 結 晶 を 得 た 。 この結 晶 は赤 褐 色 稜 柱 状 の結 晶 で次 の 呈 色 反 応 を 示 す 。 (1)検 体 の エ ーテ ル 溶液 に濃 硫 酸 を 加 え る と,は じめ は 緑 色 で あ る が や が て 酸 層 が青 色 とな る。 (2)検 体 の エ ーテ ル 溶液 に濃 硫酸 を 加 え る と緑 色 の リ ソ グを 生 じ,次 第 に 退 色 す る。 (3)検 体 の エ ー テル お よび メタ ノー ル溶 液 に25%以 上 の 塩 酸 を 加}て も青 色 とな らな い 。 この呈 色反 応 は ビオ ラキ サ ソチ ソ(C40H5604),フ コキサ ソチ ソ(C40H566) で は 青 色 を 呈 し,こ れ らの 色 素 と区別 され る15)16)。 (4)氷 酢 酸 に は 黄 金 色 に とけ る 。 ル テ イ ソ(C40H5602) は黄 色,ビ オ ラキ サ ソチ ソは黄 色 か ら緑 色 に 変 る。15)is) (5)検 体 の エ ーテ ル 溶液 に ピ ク リソ酸 の エ ー テ ル溶 液 を 加 えれ ぽ 黄 色 で 変 色 しな い 。 ビオ ラ キ サ ソ チ ソは2分 後 に オ リーブ 色,10分 後 に黄 緑 色 を呈 す る15)16)。 (6)検 体 を エ ーテ ル,ク ロ ロホ ル ム混 液 に 溶 解 し,ギ 酸 を 加xて 放 置 す れ ば 緑 色 か ら次 第 に濃 緑 色 とな る 。 ル テ イ ソは この 呈 色 反 応 を 示 さ な い。 また ビオ ラ キ サ ソチ ソは 緑 色 か ら次 第 に 濃 青 色 とな る。 (7)検 体 の ク ロ ロホ ル ム溶 液 に三 塩 化 ア ソチ モ ソ の ク ロ ロホ ル ム液 を 加 え る と強 い青 色 を示 す 。 以 上 の 呈 色 反 応 の うち で タ ラ キ サ ソチ ソ特 有 の反 応 は 一13一
立 正 学 園 女 子 短 大 研 究 紀 要 第3集(1959) 塩 酸 お よ び ギ 酸 に 対 す る 反 応 で あ る 。 し た が っ て こ の 結 晶 は ル テ イ ソ,ビ オ ラ キ サ ソ チ ソ,フ コ キ サ ソ チ ソ と 明 ら か に 区 別 さ れ る 。 こ の 結 晶 を ア ル コ ー ル に 溶 解 し,ベ ッ ク マ ソ型 分 光 光 度 計 で 測 定 し,そ の 最 大 吸 収 は409 m,u,443mｵ,472〃zμ で タ ラ キ サ ソ チ ソ に 一 致 す る 。 こ の 結 晶 を 元 素 分 析 し,そ こ結 果 は タ ラ キ サ ソ チ ソ に 一 致 し た 。 分 析 物 質(mg)CO2(mg)H20(〃 ￠σ)C(%)H(°0) 3.93511.5153.28379.819.27 計 算 値C40H564と して79.959.40 上 記 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィの 分 離 の うち で,下 層 の 吸 着 部 分 を メ タ ノ ー ル を 含 む エ ー テ ル で 抽 出 し,こ の 殘 留 物 を ベ ソ ゼ ソ,メ タ ノ ー ル 混 液(2:1)よ り再 結 し, mp.186∼188Qの 終 晶 を 得 た 。 こ の 結 晶 を 前 と 同 様 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィを 行 い,ベ ソ ゼ ソ,メ タ ノ ー ル 混 液 よ り再 結 を 試 み た が 結 晶 は 得 ら れ な か っ た 。 こ の 物 質 を と り前 述 の 呈 色 反 応 を 行 い,氷 酢 酸 お よ び ギ 酸 に 対 す る 反 応 は タ ラ キ サ ソ チ ソ と 異 な り,ル テ イ ソ な る こ と を 示 し た 。 キ サ ソ トフ ィル と ス テ リ ソ の 沈 澱 を 除 い た 石 油 工 一 テ ル 溶 液 は こ れ を90%メ タ ノ ー ル100ccを 加xて 振 り, 抽 出 す 為 こ と 黎 回 く りか え し た 。 最 後 の メ タ ノ ー ル 抽 出 液 は 僅 か に ・g色 を 示 した 。 メ タ ノ ー ル 抽 出 液 は こ れ を 合 せ 石 油 工 一 テ ル を 加 え て 振 り,メ タ ノ ー ル に 含 ま れ る カ ロ チ ソを 除 き,メ タ ノ ー ル 溶 液 は こ れ を 石 油 工 一 テ ル で お お い,50%メ タ ノ ー ル に な る よ うに 水 を 加 え て 振 り,2液 の さ か7i..に樹 脂 状 に 色 素 が 析 出 す る 。 し ぼ ら く 放 置 し た 後 吸 引 ロ 過 し,石 油 工 一 テ ル で 樹 脂 状 物 質 を 洗 い,完 全 に 乾 か な い うち に メ タ ノ ー ル,エ ー テ ル 混 液 (1:1)に 溶 解 し,注 意 し て エ ー テ ル を 蒸 発 し,温 時 結 晶 が 析 出 し た と き こ れ を 冷 所 に 放 置 す る 。 こ の 結 晶 はmp. 182∼1830に し て120mgを 得 た 。 こ の 結 晶 を さ ら に メ タ ノ ー ル,エ ー テ ル 混 液 よ り再 三 再 結 し,mp.184∼ 185° の 結 品 を 得 た 。 こ の 結 晶 を 前 述 と 同 様 カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィを 行 い,mp.185∼186° の 結 晶 を 得 た 。 こ の 結 晶 は 結isnn形,呈 色 反 応,ク ロ マ ト グ ラ フ ィ等 か ら上 述 の タ ラ キ サ ソ チ ソ の 結 晶 と 同 一 物 質 な る こ と を 認 め た 。 以 上 再 結 晶 に よ りそ の 母 液 を 集 め る と殘 留 物 が4.8g あ り,濃 赤 色 油 状 物 質 に し て,種 々 の 方 法 お よ び 溶 媒 に よ り再 結 晶 を 試 み た が 成 功 し な か っ た 。 こ れ は お そ ら く 大 部 分 が 酸 化 分 解 し た も の と考 え ら れ る 。50%メ タ ノ ー ル 可 溶 の 色 素 は エ ー テ ル で 回 収 した が 少 量 で そ れ 以 上 調 べ な か った 。 3.β 一 力 ロチ ンの 分 離 90%メ タ ノ ー ルで 抽 出 した 石 油 工 一テ ル溶 液 を水 洗, 脱 水 した 後,石 油 工 一 テ ル を 留 去 し,3倍 量 の無 水 アル コ ー ル を加xて 放 置 す る と多 量 の ス テ リソお よび ロ様 物 質 が 析 出す る。 これ を ロ別 し,5倍 量 の無 水 アル コー ル の溶 液 と し,冷蔵 庫 に放 置 す れ ぽ 多 量 の カ ロ チ ソが 析 出す る 。 こ の カ ロ チ ソを 石 油 工 一 テル か ら再 結 す れ ぽmp.174∼ 175'の 紫 赤 色 の金 属 光 沢 を 有 す る結 晶318mgを 得 た 。 この結 晶を 藤 田,青 山17)の酸 化 アル ミナ に よ る α,β一 カ ロチ ソ の分 別 を 行 った 。 結 晶を 石 油 工 一 テ ル に溶 解 し,酸 化 アル ミナに 吸 着 せ しめ,0.4°oア セ トソ を含 む 石 油 工 一 テ ルで 展 開 す る と3層 に分 離 した 。 α一 カ ロチ ソの吸 着 帯 が せ ま い薄 い 層 に あ らわ れ,そ の 上 層 に β一 カ ロチ ソの 巾 の広 い吸 着 帯 が あ り,最 上 部 に 巾 の せ ま い キ サ ソ トフ ィル と思 われ る 層が あ る。 これ らの 層 を それ ぞ れ エ タ ノー ル を含 む 石 油z一 テ ルで 溶 出 し,石 油 工 一 テ ル か ら再結 した 。mカ ロチ ソに相 当す る 部 分 か ら, 種 々工 夫 した が 結 晶 が 得 られず,β 一 カ ロ チ ソの 部分 よ りmp.174∼175° の結 晶を 得 た 。 この結 晶 を さ らに ベ ソゼ ソ,メ タ ノー ル 混 液(3:1)で 数 回 再結 し,mp.183° の 紫 赤 色 の 結 晶 を得 た 。 この 結 晶 の ク ロ ロホ ル ム溶 液 は 濃 硫 酸 で 青 色 を 呈 し,三 塩 化 ア ソチ モ ソの ク ロ ロホ ル ム 液 を 加 え る と濃 青 色 を 呈 す る。 また この結 晶 の エ ーテ ル 溶 液 に 塩 酸 を 加}て も変 色 しな い 。 こ の結 晶を 石 油 工 一 テル に 溶解 し,ベ ヅ クマ ソ型 分 光 光 度 計 で 測 定 し,そ の結 果 は 図3の 通 りで,そ の最 大 吸 収 は426m,u,,452mｵ,483mｵでmカ ロチ ソ の女 献 値 に 一致 す る 。 こ の結 晶を 元 素 分 析 した 結 果 は 次 の通 りで β一 カ ロチ ソ に一 致 す る。 、 分 析 物 質(mg)CUB(mのH20(mg)C(%) 3.30510.8273.05789.40 計 算 値C40Hss89・55
H(%)
10.35
1045
一 ↓4一北 村;プ ロ ビ タ ミ ソAに 関 す る 研 究 カ ロ チ ソを ロ別 した 濃 赤 色 の アル コ ール溶 液 は これ を 冷蔵 庫 に長 く放 置 す る と さ らに カ ロチ ソが 析 出 す る。 カ ロチ ソを 口別 した ア ル コー ル溶 液 は水 を 加}て アル コ ー ル を 除 き,水 洗,脱 水 してか ら こ の殘 留 物 を 少 量 のべ ソ ゼ ソに溶 解 し,メ タ ノー ル を加 え て放 置 す る と少 量 の カ ロチ ソが析 出す る 。 この母 液 は 濃赤 色 油 状 で 少 量 の カ ロ チ ソ とカ ロチ ソの酸 化 物 お よび液 体 不 ケソ化 物 が 含 まれ て い る と考 え られ る。 後 か ら得 られた 粗 カ ロチ ソの収 量 は62mgで あ った 。
