高圧処理が動物性タンパク質のゲル形成機構に与える影響とその利用に関する研究

高圧処理が動物性タンパク質のゲル形成機構に

与える影響とその利用に関する研究

2016 年

小泉亮輔

第 1 節 ア ク ト ミオ シ ン 加 圧ゲ ル の 形成 機 構 に つ いて ··· 5 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) ア ク ト ミ オ シ ン の 調 製 ··· 5 (2) ア ク ト ミ オ シ ン 試 料 の 調 整 ··· 7 (3) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 ··· 9 (4) ゲ ル 強 度 お よ び ワ ー ク ダ ン 値 の 測 定 ··· 9 (5) ゲ ル 溶 解 試 験 ··· 9 (6) 統 計 処 理 ··· 10 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) KCl 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 16 (2) ア ク ト ミ オ シ ン 濃 度 と 圧 力 強 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 16 (3) ア ク ト ミ オ シ ン ゲ ル の 溶 解 性 ··· 19 第 2 節 ア ク ト ミオ シ ン ゲ ルの 微 細 構造 に つ い て ··· 23 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) ア ク ト ミ オ シ ン の 調 製 ··· 23 (2) ア ク ト ミ オ シ ン 試 料 の 調 整 ··· 23 (3) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 ··· 23 (4) 観 察 試 料 の 調 製 ··· 23 (5) 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 ··· 24 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) ア ク ト ミ オ シ ン ゲ ル の 微 細 構 造 ··· 26 第 3 節 要 約 ··· 33 第 2 章 超 高 圧 処 理 後 に 形 成 す る 卵 タ ン パ ク 質 ゲ ル の 形 成 機 構 に 関 す る 研 究 第 1 節 卵 黄 加 圧ゲ ル の 形 成機 構 に つい て ··· 34 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) 卵 黄 試 料 の 調 製 ··· 34

(2) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 ··· 34 (3) ゲ ル 強 度 お よ び ワ ー ク ダ ン 値 の 測 定 ··· 38 (4) NaCl 添 加 試 験 ··· 38 (5) N-Ethylmaleimide 添 加 試 験 ··· 38 (6) SDS-PAGE ··· 38 (7) ゲ ル 溶 解 試 験 ··· 39 (8) 統 計 処 理 ··· 39 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) 加 圧 処 理 時 の 温 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 40 (2) タ ン パ ク 質 濃 度 と 圧 力 強 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 40 (3) NaCl 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 43 (4) N-Ethylmaleimide 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 46 (5) 卵 黄 ゲ ル の 主 要 構 成 タ ン パ ク 質 の 探 索 ··· 46 (6) 卵 黄 ゲ ル の 溶 解 性 ··· 48 第 2 節 卵 黄 ゲ ルの 微 細 構 造に つ い て ··· 53 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) 卵 黄 試 料 の 調 製 ··· 53 (2) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 ··· 53 (3) 観 察 試 料 の 調 製 ··· 53 (4) 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 ··· 53 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) 卵 黄 ゲ ル の 微 細 構 造 ··· 55 第 3 節 要 約 ··· 59 第 3 章 高 圧 処 理 に よ り 形 成 す る 乳 タ ン パ ク 質 ゲ ル の 形 成 機 構 に 関 す る 研 究 第 1 節 β-ラ ク ト グ ロブ リ ン (β-lg) 加 圧 ゲル の 形 成 機 構に つ い て ··· 60 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) β-lg の 調 製 ··· 60 (2) β-lg 試 料 の 調 整 ··· 62 (3) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 ··· 62

(7) 尿 素 添 加 試 験 ··· 65 (8) 遊離 SH 基 の 測 定 ··· 65 (9) ゲ ル 溶 解 試 験 ··· 65 (10) SDS-PAGE ··· 66 (11) 統 計 処 理 ··· 66 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) β-lg 濃 度 と 加 圧 処 理 時 の 温 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 68 (2) 圧 力 強 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 68 (3) NaCl 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 72 (4) N-Ethylmaleimide 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 74 (5) 尿 素 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 74 (6) 加 圧 処 理 時 の 温 度 が β-lg の 遊 離 SH 基 量 に 与 え る 影 響 ··· 77 (7) β-lg ゲ ル の 溶 解 性 ··· 79 (8) 加 圧 処 理 時 の 温 度 が β-lg の 重 合 体 形 成 に 与 え る 影 響 ··· 81 第 2 節 β-lg ゲル の 微 細 構造 に つ い て ··· 84 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) β-lg の 調 製 ··· 84 (2) β-lg 試 料 の 調 整 ··· 84 (3) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 ··· 84 (4) 観 察 試 料 の 調 製 ··· 84 (5) 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察 ··· 84 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) β-lg ゲ ル の 微 細 構 造 ··· 85 第 3 節 要 約 ··· 91

第 4 章 高 圧 処 理 を 用 い た ソ ー セ ー ジ 様 食 品 の 開 発 に 関 す る 研 究 第 1 節 ソ ー セ ージ 様 食 品 の開 発 に 関す る 研 究 ··· 92 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) ソ ー セ ー ジ 生 地 の 調 製 ··· 92 (2) 加 圧 処 理 ··· 93 (3) 物 性 の 測 定 ··· 93 (4) 色 調 の 測 定 ··· 93 (5) 離 水 率 の 測 定 ··· 93 (6) 一 般 生 菌 数 の 測 定 ··· 94 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) ソ ー セ ー ジ 様 食 品 の 物 性 ··· 98 (2) ソ ー セ ー ジ 様 食 品 の 色 調 ··· 100 (3) ソ ー セ ー ジ の 離 水 率 ··· 102 (4) ソ ー セ ー ジ の 一 般 生 菌 数 ··· 104 第 2 節 要 約 ··· 106 総 括 第 1 章 高 圧 処 理に よ り 形 成す る 肉 タン パ ク 質 ゲ ルの 形 成 機 構に 関 す る研 究 － アク ト ミ オ シ ン加 圧 ゲ ル の形 成 機 構に 関 す る 研 究 － ··· 107 第 2 章 高 圧 処 理に よ り 形 成す る 卵 タン パ ク 質 ゲ ルの 形 成 機 構に 関 す る研 究 － 卵黄 加 圧 ゲ ル の形 成 機 構 に関 す る 研究 － ··· 108 第 3 章 高 圧 処 理に よ り 形 成す る 乳 タン パ ク 質 ゲ ルの 形 成 機 構に 関 す る研 究 －β-ラ ク トグ ロ ブ リ ン加 圧 ゲ ル の 形 成機 構 に 関 す る研 究 － ··· 109 第 4 章 高 圧 処 理を 用 い た ソー セ ー ジ様 食 品 の 開 発に 関 す る 研究 － ソー セ ー ジ 様 食品 の 開 発 に関 す る 研究 － ··· 109 参 考 文 献 ··· 112 Summary ··· 120 謝 辞 ··· 123

- 1 - お よ び 皮 革 な ど を 得 る こ と で あ る (唐 津 , 2012)。 古 来 , 人 類 は 狩 猟 に よ っ て 動 物 性 食 品 を 摂 取 し て き た が , 文 明 の 発 達 と と も に 農 耕 や 野 生動 物 の 家 畜 化 が す す み , 畜 産 が 始 ま っ た 。 畜 産の 始 ま り に よ っ て 人 類 は 一 部 の動 物 性 食 品 を 狩 猟 か ら で は な く , 畜 産 業 か ら 得 る こ と が で き る よ う に な っ た (足 立 , 1998)。 こ れ ら の 動 物 性 食 品 は 畜 産 物 の 一 部 で あ り , 畜 産 物 は 乳 , 肉 , 卵 な ど の 食 料 生 産 物 と 羽毛 や 皮 革 な どの 非 食 料 生産 物 に 大別 さ れ る 。食料 生 産 物 とし て の 畜産 物 は そ のま ま 利 用 さ れる こ と や 加工 さ れ 長期 間 保 存 後 , 利 用 さ れ てき た 。 今 日 , 畜 産 食 品 や 畜 産 加 工 食 品 は 日 本 人 の 食 卓 に あ が ら な い 日 は な い く ら い に 普及 し た 。 日 本国 内 で は 近年 の 食 の欧 米 化 に 伴 う肉 食 や 健 康志 向 に よる ヨ ー グ ルト に 代 表 さ れる よ う な 発酵 乳 製 品な ど の 消 費 量の 拡 大 に よっ て 昭 和 50 年 以 降 , 乳 , 肉 , 卵 な ど の 畜 産 食 品 の 需 要 量 は 毎 年 増 加 し て い る ( 農 林 水 産 省 , 2016)。 さ ら に , 厚 生 労 働 省 に よ る 2013 年 の 国 民 健 康 ・ 栄 養 調 査 (厚 生 労 働 省 , 2015) で は 国 民 の 全 年 齢 で 魚 介 類 の 消 費 量 を 肉 類 が 上 回 り , 一 人 一 日 当 た り の 肉 類摂 取 量 は 90g に な っ た 。 畜 産 食 品 の 肉 類 , 牛 乳 , 鶏 卵 に 含 ま れ る タ ン パ ク 質 は 何 れ も タ ン パ ク 質 中 の 必 須 ア ミ ノ 酸 の 構 成 バ ラ ン ス を 示 す , ア ミ ノ 酸 ス コ ア が 「 100」 で あ り (根 岸 , 2011), 畜 産 食 品 は タ ン パ ク 質 供 給 源 と し て 非 常 に 優 れ た 食 品 で あ る 。畜 産 食 品 の 摂取 量 の 増 大 は日 本 人 の 体格 の 向 上や 平 均 寿 命 の延 長 と 高 い相 関 が ある と さ れ てい る (柴 田, 2004)。一 方, 畜 産 物 の摂 取 は し ば しば 肥 満 , 動脈 硬 化 およ び 心 疾 患 な ど の 原 因 と さ れ る が , そ れ ら の 情 報 は 何 れ も 科 学 的 根 拠 が 乏 し い 。 近 年 で は畜 産 食 品 に 含ま れ る イ ミダ ゾ ー ルジ ペ プ チ ド やラ ク ト フ ェリ ン 等 の機 能 性 物 質 (西 村, 2008) が 注 目 さ れ, 様 々 な加 工 食 品 が 開発 さ れ , その 消 費 が拡 大 し て いる 。 食 品 の 加 工 に は こ れ ま で 一 般 的 に 「 熱 」 が 用 い ら れ て き た が , 自 然 界 に は も う 一 つ の 状 態 因 子 で あ る 「 圧 力 」 が 存 在 す る 。 近 年 , 液 体 を 圧 縮 す る こ と に よ っ て 得 ら れ る 数 千 気 圧 以 上 (100 MPa 以 上 ) の 高 い 静 水 圧 (High Hydrostatic Pressure) (Fig.1, 2) (Bridgman, 1912) を 食 品 加 工 に 用 い る 高 圧 処 理 (加 圧 処 理 )

- 2 - が 提 案 さ れ (林 , 1991), こ れ ま で に 様 々 な 研 究 が 報 告 さ れ て き た (林 ら , 1989, 1990, 1991, 1993; 功 刀 ら , 1994; 鈴 木 ら , 1997; 菅 野 ら , 2000; 山 本 ら , 2003)。 食 品 に高 圧 処 理 を 行う と 加 熱 処理 と は 異な る メ カ ニ ズム で 食 品 に影 響 を 与え る こ と が 報告 さ れ て い る (林ら , 1989)。 高 圧処 理 は 非 加 熱 で食 品 の 加 工 が 出 来る た め , 非 加 熱 殺 菌 が 可 能 と な り , 原 料 中 の ビ タ ミ ン , 色 素 や フ レ ー バ ー な ど を 変 化 させ る こ と な く 食 品 を 加 工す る こ とが 可 能 で あ る (林 , 1991) (Fig.3, 4)。 ま た , 高 圧 処 理 中 の 化 学 反 応 は 加 熱 処 理 に 比 べ 穏 や か で あ り , 低 温 で 高 圧 処 理 し た 場 合 は 共 有 結 合 の 開 裂 が 起 こ ら ず , 毒 性 物 質 の 生 成 が ほ と ん ど な く , 異 臭 な ど の 発 生 を 抑 え る こ と が で き る (林 , 1991)。 さ ら に , 高 圧 処 理 は 加 熱 処 理 に 比 べ , 運 転 経 費 や エ ネ ル ギ ー 消 費 が 少 な い 利 点 が あ る (岸 , 2008)。 こ れ ら の 有 用 な 点か ら 国 内 で はジ ャ ム や フレ ッ シ ュジ ュ ー ス な どの 農 産 加 工品 へ の 高圧 処 理 の 応用 が 報 告 さ れ (木 村, 2000; 弓 削 ら, 1993), 海 外 で は加 熱 後 包 装 の 食肉 製 品 の 二 次 汚 染 の 抑 制 や 賞 味 期 限 の 延 長 , 野 菜 ペ ー ス ト な ど の 加 工 に 利 用 さ れ て い る (Balasubramaniam ら , 2008)。 一 方 , 高 圧 処 理 に よ る タ ン パ ク 質 の 変 性 メ カ ニ ズ ム は こ れ ま で も 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て お り , 単 純 タ ン パ ク 質 の 高 圧 変 性 の 基 礎 的 研 究 の 報 告 (Tedford ら , 1999; Smith ら , 2000; Plancken ら , 2005; Broersen ら , 2006; Hoppe ら , 2013) は 多 い が , 線 維 状 タ ン パ ク 質 や 複 合 タ ン パ ク 質 の 高 圧 変 性 に 関 す る メ カ ニ ズ ム は 不 明 な 点 が 多 い 。 ま た , 高 圧 処 理 に よ る タ ン パ ク 質 の ゲ ル 形 成 に 関 す る 研 究 は 少 な く , そ れ ら を 応 用 し た 加 工 品 は 現 在 に お い て も 開 発 さ れ て い な い 。 そ こ で 本 研 究 で は 畜 産 食 品 中 の 動 物 性 タ ン パ ク 質 の 高 圧 変 性 に 着 目 し , 高 圧 処 理 に お け る タ ン パ ク 質 の ゲ ル 形 成 条 件 , ゲ ル 形 成 機 構 お よ び そ の 知 見 を 応 用 し た 高 圧 処 理 を用 い た 畜 産 食品 の 開 発 につ い て 詳細 な 研 究 を 行っ た 。

- 3 -

0

5

10

0

200

400

600

800

V

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Pressure ( MPa )

Fig.1 The change of volume of water at 22ºC

- 4 -

Fig.4 High pressure processed whole egg at 650 MPa ( a) and boiled whole egg at 100ºC (b)

Fig.3 High pressure processed whole eggs

These showed from left to right 400, 500 and 600 MPa.

- 5 - 肉 は タ ン パ ク 質 , 脂 肪 お よ び ビ タ ミ ン 類 な ど の 栄 養 素 を 含 み , 特 に タ ン パ ク 質 は 必須 ア ミ ノ 酸 をバ ラ ン ス よく 含 み アミ ノ 酸 ス コ アの 高 い タ ンパ ク 質 供給 源 で あ る (喜 多 野 , 2010)。 食 肉 タン パ ク 質 の大 部 分 を 占 め る筋 原 線 維 タ ン パ ク質 の 太 い フ ィ ラ メ ン ト で あ る ミ オ シ ン と 細 い フ ィ ラ メ ン ト で あ る ア ク チ ン (Person ら , 1989) (Table 1) は塩 可 溶 性 タ ン パク 質 で あ る (高 橋 , 1983)。 通 常, 食 肉 で は 死 後 硬 直 時 に ミ オ シ ン と ア ク チ ン は 結 合 し , ア ク ト ミ オ シ ン と し て 存 在 す る (樋 口 , 2011)。ア ク ト ミ オ シ ン は 0.4 mol/L 以 上 の 塩 濃 度 に な る と 溶 解 し , こ の 状 態 で加 熱 す る こ とに よ り 三 次元 的 網 目構 造 を 形 成 する ゲ ル 形 成能 を 有 して い る (Yasui ら , 1980; Yasui ら , 1982)。し か し , 加 圧 処 理 に よ る ア ク ト ミ オ シ ン の ゲ ル 形 成機 構 は 明 ら かに な っ て いな い 。 そ こ で , 本 章 で は ア ク ト ミ オ シ ン 加 圧 ゲ ル の 形 成 条 件 , ゲ ル 形 成 機 構 , ゲ ル を 維 持す る タ ン パ ク質 間 相 互 作用 お よ びそ の 微 細 構 造に つ い て 明ら か に する こ と を 目的 と し , 研 究を 行 っ た 。 第 1 節 ア ク ト ミ オ シ ン 加 圧 ゲ ル の 形 成 機 構 に つ い て 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) ア ク ト ミ オ シ ン の 調 製 ア クト ミ オ シ ン は Fig. 5 に 示し た Szent-Györyi (1951) の 方法 に 従 い, 国 産 豚 の 胸 最 長 筋 よ り 抽 出 ・ 精製 を 行 っ た 。す な わ ち , 脂 身 を 除去 し た 胸 最 長 筋を 3 mm 目 の プ レー ト を 用 い て ミー ト チ ョ ッ パー で 3 回 肉挽 き を 行っ た 。 挽 き 肉 に 対 し 5 倍 容 の Weber-Edsall 溶 液 (0.6 mol/L 塩 化 カ リ ウ ム (KCl), 10 mmol/L 炭 酸 ナ ト リ ウ ム , 40 mmol/L 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム , 1 mmol/L エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 二 ナ ト リ ウ ム ) を 加 え , 保 冷 庫 (4ºC) 中 で 24 時 間攪 拌 抽 出 し た。次 に 試 料 に対 し て 4 倍 容の 0.6 mol/L KCl 溶液 を 加 え、保 冷庫 内 に て 1 時 間 穏や か に 攪 拌後 、遠心 分 離 (900×g, 3ºC, 15 分) を 行 い 、得 られ た 上 清 をさ ら し を 用 い て濾 過 し 、次 に 、こ の 濾液 の KCl 濃 度

- 6 - Protein Ratio in the

myofibril ( % ) Localization

Contractile protein

Myosin 50 Myofilament

Actin 20 F-actin filament

Modulating protein

Tropomyosin 3 F-actin filament Troponin 4.5 F-actin filament

α-actinin 1 Z-line

Cytoskeletal protein

Titin 5 ~ 8 sarcomere

Nebulin 3 F-actin filament

C-protein 1.5 Myofilament

Table 1 Rate of individual protein in the myofibril

from Pearson, A. M., and Young, R. B., Ed: Muscle and Meat Biochemistry, Tokyo Academic Press, San Diego (1989)

- 7 - KCl 溶 液 を 加 え て 30 分 間 穏 や か に 攪 拌 し 、 遠 心 分 離 (900×g, 3ºC, 15 分) を 行い 、 上 清 を 得た 。 こ の 上清 の KCl 濃 度が 0.2 mol/L に な る よ う に 、再 び 上清 に 対 して 2 倍 容 の 純 水を 加 え 30 分 間攪 拌 後 、遠 心 分 離 (900×g, 3ºC, 15 分 ) を 行 い 、沈 殿 を 得 た 。こ の 後 、KCl 濃 度 が 0.6 mol/L に な る よ う 1/6 倍 容の 3 mol/L KCl 溶 液 を 加 え、30 分 間穏 や か に 攪 拌後 、KCl 濃度 0.6 mol/L 溶 液の 2 倍 容 の 純水 を 加 え KCl 濃 度が 0.2 mol/L に な る よ う に 塩 濃 度 を調 整 した 。 次 に 2 倍 容 の 0.2 mol/L KCl 溶 液 を 加え 10 分 間 穏 や か に攪 拌 後, 遠 心 分 離 (900×g, 3ºC, 15 分) を行い、沈殿を得た。この沈殿の KCl 濃度が 0.6 mol/L に な る よ う に 、沈 殿 物 に 対 し て 1/6 倍 容 の 3 mol/L KCl 溶 液 を 加 え て 30 分 間 攪 拌 後 、 遠 心 分 離 (34,480×g, 3ºC, 60 分) を行い、上部 2/3 を天然 ア クト ミ オ シ ン とし た 。 得 られ た ア クト ミ オ シ ン の KCl 濃 度 は 0.6 mol/L な の で 、 透 析 チ ュ ー ブ (ヴ ィ ス ク ン グ チ ュ ー ブ 36/32 in, 日 本 メ デ ィ カ ル サ イエ ン ス 製) を 用 い て 純 水を 外 液 とし , 48 時 間透 析 を 行 い脱 塩 し た もの を 試 験 に 供 し た 。 (2) ア ク ト ミ オ シ ン 試 料 の 調 整 ア ク ト ミ オ シ ン の タ ン パ ク 質 濃 度 は ビ ュ ー レ ッ ト 法 (菅 原 ら , 1990) を 用 いて 測 定 し た 後 , Fig.6 に示 す 方 法 でゲ ル を 調 製 した 。 す な わち , 各 試験 に 用い る ア ク ト ミオ シ ン 試 料 は KCl 溶 液 と混 合 す る こ とで 調 製 し た 。す な わ ち , 予 め 最 終 目標 値 よ り 濃い ア ク トミ オ シ ン 溶 液と KCl 溶液 を 調 製 し混 合 した 。 KCl 添 加 試 験で は 最 終 タ ン パク 質 濃 度 が 20 mg/g, 最 終 KCl 濃 度 が 0 ~ 0.6 mol/kg。圧 力 強 度 の 試験 で は最 終 タ ン パ ク質 濃 度が 20, 25 お よび 30 mg/g, 最 終 KCl 濃 度 が 0.2 mol/kg。 溶 解 性 試 験 で は 加 圧 ゲ ル は 最 終 タン パ ク質 濃 度 が 25 mg/g, KCl 濃 度 0.2 mol/kg , ま た, 加 熱 ゲ ル は最 終 タ ンパ ク 質濃 度 が 25 mg/g, KCl 濃 度 0.6 mol/kg に な るよ う に 調 整し , そ れ ぞ れ混 合 撹拌 し た 後 ,保 冷 庫で 8 ~ 16 時 間 静 置し た 。pH は 0.1 mol/L HCl を 用 いて

- 8 -

Ground meat

Extraction with 5 volume of Weber-Edsall solution for 24 hr with gentle stirring

Four volume of 0.6 mol/L KCl

Centrifugation (900×g, 3ºC, 15 min)

Filtration of supernatant with cotton cloth Precipitate

Distilled water (dilution 0.1 mol/L KCl) Centrifugation (900×g, 3ºC, 20 min)

Supernatant 3 mol/L KCl solution (adjustment 0.6 mol/L KCl)

Stirring gentry for 30 min Stirring gentry for 30 min

Centrifugation (900×g, 3ºC, 15 min)

Distilled water (dilution 0.2 mol/L KCl)

Stirring gentry for 30 min

Collection supernatant of upper two-thirds Centrifugation (34,880×g, 3ºC, 60 min)

dialysis in distilled water (4ºC, 48 hr)

Natural actomyosin Precipitate Supernatant Precipitate Precipitate Precipitate Precipitate Centrifugation (900×g, 3ºC, 15 min) Supernatant

3 mol/L KCl (adjustment 0.6 mol/L KCl)

Distilled water (dilution 0.2 mol/L KCl)

Stirring gentry for 30 min

Centrifugation (900×g, 3ºC, 15 min)

Stirring gentry for 30 min

Supernatant

Stirring gentry for 30 min

Centrifugation (900×g, 3ºC, 15 min)

Supernatant

0.2 mo/L KCl (wash by double volume)

3 mol/L KCl (adjustment 0.6 mol/L KCl)

Fig. 5 Extraction of Actomyosin from raw meat

Web er- Edsal l s olu t i on : 0.6 m ol / L p otass iu m ch l or id e , 10 mm ol / L s od iu m ca r b on at e , 4 0 mm ol / L s od iu m h yd r og en ca rb ona t e, 1 m m ol / L d is od iu m eth yl en ed iam in ot et raa cetat e

- 9 - 各 試料 は プ ラ ス チッ ク 容 器 (内 径 14 mm 高さ 31 mm) に 気 泡 が入 ら な い よう 充 填 し 密 封し た 後 , Fig.7 に 示 す食 品 用 高 圧 処理 装 置 (Dr. CHEF, 神 戸 製鋼 所 製 ) を用 い , 加 圧 処理 を 行 った 。すな わ ち , 0ºC で 200 か ら 50 MPa 間 隔 で 650 MPa ま で の 条 件で , ア ク トミ オ シ ン に 15 分 間 の 加圧 処 理 を行 っ た。 ま た , 大 気圧 下 (0.1 MPa), 70ºC の 恒温 水 槽 中で 30 分間 の 加 熱 処理 (芳 賀 , 1985) を 行 い , 流 水 中 で 15 分 間 冷 却 し た 加 熱 ゲ ル を 対 照 区 と し た 。 加 圧ゲ ル と 加 熱 ゲ ル は 保 冷 庫で 8 ~ 16 時 間 静 置 した 後 に 各 試験 に 供 し た。 た だ し , KCl 添 加試 験 で は 高圧 ポ ン プ (AIR 駆 動 式 DSXHF-452, HASKEL 製 ) を 用 い, 0ºC, 200 MPa, 15 分 間 の 加圧 処 理 を 行 った 。 (4) ゲ ル 強 度 お よ び ワ ー ク ダ ン 値 の 測 定 保 冷後 の 試 料 は プラ ス チ ッ ク容 器 に 入れ た ま ま 室 温 (約 25ºC) に 戻 し た 後 , 物 性 測 定 機 (5543 型 , Instron 社 製) を 用 い て Fig.8 に 示 すよ う に ゲル 強 度 (GS) お よび ワ ー ク ダン 値 (WD) の 測 定 を 行っ た 。 す なわ ち , ± 50 N の ロ ード セ ル を 使 用し , 直径 6.5 mm の円 柱 状 プ ラン ジ ャ ー を 用い て 圧 縮速 度 50 mm/min, 挿 入率 50%の条 件 で 測定 し た 。 な お , GS と WD の 解 析 は解 析 ソフ ト (Bluehill 2, Instron 社製 ) を 用 い て行 っ た 。 (5) ゲ ル 溶 解 試 験 ア クト ミ オ シ ン ゲル の 溶 解 性を 調 べ るた め に 0.6 mol/L 塩 化 ナト リ ウ ム (NaCl) 溶 液 (S1), 0.6 mol/L NaCl + 1.5 mol/L 尿 素 溶 液 (S2), 0.6 mol/L NaCl + 8 mol/L 尿 素 溶 液 (S3), 0.6 mol/L NaCl + 8 mol/L 尿 素 + 0.5 mol/L 2-Mercaptoethanol (2-ME) 溶 液 (S4) の 4 種 類 の ゲ ル 溶 解 液 (Matsumoto, 1980) を 調 製 し た (Table 2)。な お , そ れ ぞ れ の 溶 液 は 0.1 mol/L HCl あ る い は NaOH を 用 いて pH 7.0 に 調 整 し た。 溶 解 試 験 には 加 圧 ゲ ル (200 ~ 600 MPa), お よ び 加 熱 ゲ ル を 用 い た 。 試 験 は Pérez-Mateos ら (1997) の 方 法 に 準 じ , Fig. 9 に 示 す方 法 で 行 っ た 。す なわ ち , ゲル 5 g に 純 水 を 20 mL 加 え ,

- 10 - 均 質化 (9,000 rpm, 1 分) (ヒ スコ ト ロン NS-50, マ イ ク ロテ ッ ク ニ チ オン 製 ) し た 。次に 4ºC で 1 時 間振 盪 攪 拌し た 後 , 遠 心分 離 (34,780×g, 4ºC, 15 分 ) を 行 い , 上 清 を 回 収 し , こ れ を 一 連 の 操 作 と し た 。 さ ら に 沈 殿 に 対 し S1 を 加 え て 上 記 の 一 連 の 操 作 を 行 い , 上 清 を 回 収 し た 。 以 後 , 得 ら れ る 沈 殿 に対 し 同 様 の 操作 を S2, S3 お よび S4 を 加 えて 行 い, 最終 的 な 沈 殿物 を 不 溶性 画 分 と し た。 た だ し , S1 と S3 で 溶 解 操 作 を二 度 行 っ た。 タ ンパ ク 質 濃度 の 測 定は Bradford 法 (Bradford, 1976) に より 測 定 し, 検 量 線 は ウシ γ-グ ロ ブ リ ン を 標 準 物 質 と し て 作 成 し た 。 各 ゲ ル 溶 解 液 へ の 溶 解 率 は 各 溶 液 に溶 解 し た ゲ ルの タ ン パ ク質 量 よ り算 出 し た 。 (6) 統 計 処 理 ゲ ル溶 解 性 の 統 計処 理 は 表 計算 ソ フ ト (Excel, Microsoft 製 ) お よ び 統 計 ソ フト (エ ク セル 統 計 2015, 社 会 情 報サ ー ビ ス 社 製) を 用 いて Tukey の 多 重 比較 検 定 (有意 水 準 : P < 0.05) を 行っ た 。

- 11 -

Fig. 6 Preparation of actomyosin gels Actomyosin

Distilled water and KCl

(adjustment protein and KCl concentration) Store for 8 ~ 16 hr at 4ºC

0.1 mol/L HCl

(adjustment pH 6.0) Filling in plastic case

Cooling by running water for 15 min Store for 8 ~ 16 hr at 4ºC Returning to room temperature

Each experiment Pressurization

(200 ~ 650 MPa, 0ºC, 15 min)

Heating

- 12 -

Fig.7 High pressure processing device (Dr. CHEF, Kobe Steel, Ltd.)

- 13 -

Fig.8 Measuring method of “Gel strength” and “Work Done”

Gel

Plastic case

Compress 50%

Plunger

Time

Area: Work Done ( mJ )

Force

Height:

- 14 - T a b le 2 E ff e c t o f e a c h s o lu ti o n o n p ro te in -p ro te in i n te ra c ti o n × : p ro te in -p ro te in i n te ra c ti o n c le a v a g e Gel so lubil isati on so luti on Protei n -prote in int era ct ion Ionic bon d Hy drogen _bond Hy dropho bic int era ct ion Dis ulfide bond S1 0.6 m ol /L sodium c hloride × S2 0. 6 m ol /L sodium chl oride + 1.5 m ol /L ure a × × S3 0.6 m ol /L sodium c hloride + 8.0 m ol /L urea × × × S4 0. 6 m ol /L sodium chl oride + 8.0 m ol /L ure a + 0.5 m ol /L 2 -m el ca ptoet hanol × × × ×

- 15 -

Fig.9 Method of gel solubilizing

Supernatant (water soluble fraction)

Centrifugation (34,780×g, 4ºC, 20min) Precipitate S1 Homogenization (9,000 rpm, 1min) Shaking (4ºC, 60min) Centrifugation (34,780×g, 4ºC, 20min) Supernatant (S1 fraction) Precipitate Precipitate S2 Homogenization (9,000 rpm, 1min) Shaking (4ºC, 60min) Centrifugation (34,780×g, 4ºC, 20min) Supernatant (S2 fraction) Precipitate S3 Homogenization (9,000 rpm, 1min) Shaking (4ºC, 60min) Centrifugation (34,780×g, 4ºC, 20min) Supernatant (S3 fraction) Precipitate S4 Homogenization (9,000 rpm, 1min) Shaking (4ºC, 60min) Centrifugation (34,780×g, 4ºC, 20min) Supernatant (S4 fraction) Precipitate ( Insoluble fraction)

- 16 - 2. 結 果 お よ び 考 察

(1) KCl 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響

KCl の 添 加 が 加 圧 ゲ ル お よ び 加 熱 ゲ ル の GS お よ び WD に 与 え る 影 響 を Fig.10 (a), (b),加 圧 ゲ ル の 外 観 を Fig. 11 に そ れ ぞ れ 示 し た 。加 圧 ゲ ル は KCl 濃 度 0, 0.1 mol/kg で は ゲ ル を形 成 し なか っ た が , KCl 濃 度 0.2, 0.3 mol/kg で は ゲル を 形 成 し , GS お よ び WD と も に値 が 増 加 し, 加 圧 処 理 の効 果 が 認め ら れた 。特に KCl 濃度 0.2 mol/kg に おい て GS: 0.04 N, WD: 0.44 mJ と 最も 高 い値 を 示 し た 。 一 方 , 加 熱ゲ ル は KCl 濃 度 0.5 mol/kg ま では ゲ ル を 形成 せ ず , 0.6 mol/kg か ら ゲル を 形 成 し , GS: 0.18 N, WD: 1.64 mJ を 示 した 。 上 述 の 結 果 は, KCl 濃 度 0 mol/kg で は, ア ク ト ミ オシ ン の 大 半を 構 成 し て いる ミ オ シ ン が KCl 濃 度 0.4 mol/kg 以 上 では 塩 可 溶 性 であ る ア ク ト ミオ シ ン (樋 口 , 2011) 中 の ミ オ シ ン が 単 分 子 と し て 存 在 し , ミ オ シ ン が 低 塩 濃 度時 に 形 成 す るフ ィ ラ メ ント (Trinick ら , 1980) を 形 成 しな か っ た こと に 起因 す る と 考 えら れ た 。 以 上の 結 果 , ア クト ミ オ シ ンは 0.2 mol/kg KCl, 0ºC の 温 度 で加 圧 処 理 を 行 う こ と に よ り 自 重 に 耐 え う る , 自 立 可 能 な ゲ ル (自 立 ゲ ル ) を 形 成 す る こ とが 明 ら か と なっ た 。畜肉 タ ン パ ク質 の 加 圧 処 理に よ る ゲ ル形 成 の 報告 (Suzuki ら , 1983; 鈴 木 ら , 1991; Yamamoto ら , 1990; 2002) で は い ず れ も 低 塩 濃度 で の ゲ ル 形成 が 報 告 され て い る。本 報 告 の結 果 で も 同様 に 低 塩 濃度 で ゲ ル を 形 成 し た こ と か ら , 低 塩 濃 度 に お け る ア ク ト ミ オ シ ン ゲ ル の 形 成 に は 前 処 理 と し て ミ オ シ ン フ ィ ラ メ ン ト を 形 成 さ せ る 必 要 が あ る こ と が 示 唆さ れ た 。 (2) ア ク ト ミ オ シ ン 濃 度 と 圧 力 強 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 圧力 強 度 と ア クト ミ オ シ ン濃 度 が GS と WD に 与え る 影 響を Fig.12 (a), (b) に 示 し た 。加 圧 ゲ ル は 200 MPa で ゲ ル を 形 成 し , 300 MPa で GS お よ び WD は と も に 最 も 高 い 値 を 示 し た 。300 MPa に お け る GS お よ び WD は , タ ン パク 質 濃 度 20 mg/g で は GS: 0.05 N, WD: 0.46 mJ, 25 mg/g で は GS: 0.10 N, WD: 1.07 mJ, 30 mg/g で は GS: 0.17 N, WD: 1.90 mJ を そ れ ぞ れ 示 し た 。 ま た , 全 て の ア ク トミ オ シ ン 濃度 に お いて 300 ~ 400 MPa の 加圧 処 理 で GS

- 17 - 0.00 0.05 0.10 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 G el S tr en gth ( N )

Potassium choloride ( mol/kg )

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 W o rk D o n e ( m J )

Potassium choloride ( mol/kg )

Fig.10 Effect of potassium chloride on Gel Strength (a) and Work Done (b) of pressure-induced gel (●) and heat-induced gel (□)

The bars indicate standard error (n 



- 18 -

0.1 mol/kg

0.2 mol/kg

0.3 mol/kg

0.4 mol/kg

0.5 mol/kg

0.6 mol/kg

- 19 - っ てい た 。 圧 力 強 度 を 変 化 さ せ る こ と は , 加 熱 処 理 に お い て 加 熱 温 度 を 変 化 さ せ る こ と と 同 義 で あ り , 谷 口 は (1989) タ ン パ ク 質 は 受 け た 圧 力 強 度 に よ っ て 変 化 が 生 じ る と 報 告 し て い る 。 上 記 の 結 果 (Fig.12) よ り , 0ºC, KCl 濃 度 0.2 M, pH 6.0 の 条 件 で は 300 MPa 付 近 が ア ク ト ミ オ シ ン の 加 圧 ゲ ル 形 成 の 至 適圧 力 強 度 で ある と 推 察 され た 。ミオ シ ン 単 独の 加 圧 ゲ ルに 関 す る 報告 (Iwasaki ら , 2005) で は 300 MPa か ら 初 期 弾 性 率 が 急 激 に 増 加 し て い き , 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 加 圧 ゲ ル の GS も 圧 力 強 度 に 比 例 し , 増 加 し て い た (Yamamoto ら , 2002)。 し か し , 本 研 究 で は 300 ~ 400 MPa の 圧 力 強 度 で GS お よび WD が 減少 し て い た。 こ の 原 因と し て , 加 圧処 理 時 の 温度 の 影 響が 考 えら れ , Yamamoto ら (1990, 2002) や Iwasaki ら (2005) は 室 温 で 加圧 処 理を 行 っ て い るの に 対 し , 本 研 究 では 0ºC で 加圧 処 理 を 行っ て い る こと か らタ ン パ ク 質 の変 性 状 態 が異 な る ため と 推 察 さ れる 。温 度と 圧 力 に よる タ ン パ ク 質 変 性 の 関 係 は 古 く か ら 研 究 さ れ て お り , タ ン パ ク 質 の 種 類 に よ っ て 変 性 状 態 を 示 す 変 性 自 由 エ ネ ル ギ ー の P-T 曲 線 は 変 化 す る (Hawley, 1971) と さ れ て い る 。 す な わ ち , 300 ~ 400 MPa で 起 こ る GS お よ び WD の 変 化 は ア ク ト ミ オ シ ン の 変 性 状 態 が 異 な る こ と や ゲ ル を 形 成 す る タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 の 状 態 や , 後 述 の ゲ ル 微 細 構 造 が 異 な っ た た め に 起 こ っ た と 推察 さ れ た 。 (3) ア ク ト ミ オ シ ン ゲ ル の 溶 解 性 各 ゲル 溶 解 液 へ のア ク ト ミ オシ ン ゲ ルの 溶 解 率を Table 3 に 示 し た 。200 お よび 300 MPa の 加圧 処 理 で 形 成 し たゲ ル は S1 へ の 溶 解 率 が最 も 高 く , 約 50%と 約 43%を 示し , 次 に S3 へ の 溶解 率 が 高 く, 約 33%と 約 35%を 示し た が , どち ら も 有 意 差は 認 め ら れ な かっ た 。一 方 , 400, 500 お よ び 600 MPa の 加圧 処 理 で 形 成し た ゲ ル は S3 へ の溶 解 性 が 最 も高 く 約 41 ~ 43%を 示し , 次 に S1 へ の 溶 解 率が 高 く, 約 28 ~ 33%を 示 した が , ど ち らも 有 意 差 は 認め

- 20 - 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.1 100 200 300 400 500 600 G el S tr en gth ( N ) Pressure ( MPa ) 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0.1 100 200 300 400 500 600 W o rk D o n e ( m J ) Pressure ( MPa )

Fig. 12 Effect of pressure and protein concentrate on Gel Strength (a) and Work Done (b) of pressure-induced gel 20 mg/g ( ●), 25 mg/g (■) and 30 mg/g (▲)

The bars indicate standard error (n 



(a)

- 21 - 率 と不 溶 性 画 分 の割 合 は約 2 ~ 5%と 約 5 ~ 6%程度 で 加 圧 ゲ ルの 間 に 有意 差 は認 め ら れ な かっ た 。 加 熱ゲ ル は S3 へ の 溶 解 率が 最 も 高 く 約 72%を示 し , 次 に S4 へ の 溶 解率 が 高 く 約 9%を 示 し , い ず れ の 溶 解 率 も 加 圧 ゲ ル と は 有 意 差 は 認 め ら れ な か った 。S2 へ は約 5%, S1 へ は約 3%, 水 溶 性画 分 と 不 溶 性画 分 の 割 合 はそ れ ぞれ 約 3%と約 7%で あっ た 。 Table 2 に 示 し た 各 ゲ ル 溶 解 液 は 各 タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 を 切 断 ま た は 脆 弱 化 さ せ る こ と か ら , ゲ ル の 各 溶 解 液 へ の 溶 解 率 は 各 タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用の 割 合 と 推 定す る こ と がで き る 。す な わ ち S1 へ の 溶 解率 は イ オ ン結 合 , S2 へ の 溶解 率 は 水 素結 合 , S3 へ の溶 解 率 は 疎 水性 相 互 作 用 , S4 へ の溶 解 率は ジ ス ル フ ィド (S-S) 結合 の 割 合と 推 定 で き る。こ の こと か ら, 加 圧 ゲ ル は イ オ ン 結 合 と 疎 水 性 相 互 作 用 の 割 合 が 高 い こ と が 推 察 さ れ , こ れ ら が 加 圧 ゲ ル 形 成 の 主 要 な タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た。ま た , 加 圧 ゲ ルは 300 MPa と 400 MPa の間 で イ オ ン結 合 の 割 合 は有 意 に 減 少 し , 疎 水 性 相 互 作 用 の 割 合 は 有 意 に 増 加 す る こ と か ら , 加 圧 ゲ ル の 主要 な タ ン パ ク質 間 相 互 作用 は 200, 300 MPa で はイ オ ン 結 合が , 400 ~ 600 MPa で は 疎 水 性 相 互 作 用 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 この 主 要 な タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 が 変 化 す る こ と は タ ン パ ク 質 の 疎 水 性 相 互 作 用 に よ る 変性 が 300 MPa 以 上 の 圧 力強 度 で起 こ る (林ら , 1989) こと に 起 因す る と 考え ら れ た 。ま た , Cao ら (2012) は 400 MPa 以 上 の加 圧 処 理 によ り ミオ シ ン の 凝 集 を 報 告 し て い る 。 一 方 , 加 熱 ゲ ル は イ オ ン 結 合 や 水 素 結 合 の 割 合 は少 な く , 疎 水性 相 互 作 用と 結 合 力の 強 い 共 有 結合 の S-S 結 合 に よ って 強 固な ゲ ル を 形 成し て い た 。 以 上 の 結 果 か ら , 加 圧 ゲ ル は 加 熱 ゲ ル と は 異 な る 化 学 結 合 の 様 相 を 示 し , 400 MPa 以 上 の 加 圧 処 理 に よ っ て イ オ ン 結 合 の 開 裂 や 疎 水 性 相 互 作 用 の 増 加 に伴 い GS お よ び WD が変 化 し , 後述 の 微 細 構 造に 変 化 を 与え た と 推察 さ れた 。

- 22 - M e a n ± st a n d a rd e rr o r (n  3) V a lu e s in t h e s a m e r o w t h a t a re f o ll o w e d b y d if fe re n t le tt e rs we re s ig n if ic a n tl y d if fe re n t a t p < 0 .0 5 . T a b le 3 G e l so lu b il it y o f p re ss u re -i n d u c e d g e ls ( 2 0 0 , 3 0 0 , 4 0 0 , 5 0 0 a n d 6 0 0 M P a , 0 ºC ) a n d h e a t-in d u c e d g e l (0 .1 M P a , 7 0 ºC )

- 23 - (1) ア ク ト ミ オ シ ン の 調 製 第 1 章 第 1 節 1. (1) と 同様 に 行 っ た。 (2) ア ク ト ミ オ シ ン 試 料 の 調 整 第 1 章 第 1 節 1. (2) と 同 様 にタ ン パク 質 濃 度 は 25mg/g, KCl は 終 濃 度 が 加圧 ゲ ル で 0.2 mol/kg, 加 熱ゲ ルで 0.6 mol/kg, pH は 6.0 に な る よ うに 調 整 した 。 (3) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 第 1 章 第 1 節 1. (3) と 同様 に 行 っ た。 (4) 観 察 試 料 の 調 製 観 察試 料 は Fig.13 に 示し た 志 村 ら (2007) の 方 法に 従 い 調 製 した 。 す な わ ち , 各ア ク ト ミ オ シン ゲ ル を か み そり で 10 × 5 × 5 mm 程 度 の 棒 状 に切 り 出 し た 後 , 2% グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド に て 前 固 定 , 2% 四 酸 化 オ ス ミ ウ ム にて 後 固 定 し た。 次 に , 0.2 mol/L リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) に て 洗 浄 を行 っ た後 , 50 ~ 99.5%エ タ ノ ール に て 脱水 を 行 い , プロ ピ レ ン オキ シ ド , プ ロ ピ レン オ キ シ ド ・ Epon812 (1:1 v/v) 溶 液 およ び Epon812 の 順に 浸 漬 して , 樹 脂 置 換 し た 。 次 い で , 液 体 窒 素 を 用 い て 試 料 を 凍 結 後 , メ ス を 用 い て 試 料 を 割 断 し , プ ロ ピ レ ン オ キ シ ド を 用 い て Epon812 を 溶 解 し た 。 溶 解 後 , 試 料 は 酢 酸 イ ソ ア ミ ル に 置 換 し , 臨 界 点 乾 燥 を 行 っ た 。 次 に , 試 料 の 割 断 面 を 観 察 面 と し , 試 料 台 に カ ー ボ ン テ ー プ で 固 定 し , オ ス ミ ウ ム コ ー テ ィ ン グを 行 っ た 後 , 観 察 試 料 に供 し た 。

- 24 - (5) 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観 察

走 査型 電 子 顕 微 鏡 (SEM) (電 界 放 出 形走 査 電 子 顕 微 鏡 S-4800 日立 ハ イ テ クノ ロ ジ ー ズ 製 ) を 用 い て, 加 速 電圧 2.0 kV にて ゲ ル の 微細 構 造 を 観察 し た。

- 25 - Pre-fix 2 % glutaraldehyde for 12 hr

Post-fix 2 % osmium tetroxide for 5 hr

0.2 mol/L phosphate buffer (wash)

Dehydration

50% ethanol for 15 min 70% ethanol for 15 min 80% ethanol for 15 min 90% ethanol for 15 min

95% ethanol for 15 min 99.5% ethanol for 15 min twice

Immersion to propylene oxide for 15 min

Immersion to

propylene oxide and Epon812 ( 1:1 v / v ) for 15 min

Immersion to Epon812 for 15 min

Freezing with liquid nitrogen

Crushing with knife

Wash with propylene oxide for 15 min twice

Immersion to isoamyl acetate for 15 min

Critical point drying

Sample

0.2 mol/L phosphate buffer (wash)

- 26 - 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) ア ク ト ミ オ シ ン ゲ ル の 微 細 構 造 Fig.14 ~ 19 に SEM で 観 察 し た 加 圧 ゲ ル お よ び 加 熱 ゲ ル の 微 細 構 造 を 示 し た 。1 万倍 で 観 察 し た加 圧 ゲ ル, 加 熱 ゲ ルと も に (Fig.14 ~ 19) は い ずれ も 線 維 状 構 造 で あ っ た が , 5 万 倍 で 観 察 し た と こ ろ 加 熱 ゲ ル {Fig.19 (b)} は 球 状 凝 集 体 が 連 な っ た 微 細 構 造 で あ っ た 。 一 方 , 5 万 倍 の 加 圧 ゲ ル {Fig.14 (b) ~ 18 (b)} は 会 合 部 が 丸 く , 架 橋 部 が 細 く 長 い , 線 維 状 構 造 が 観 察 さ れ た 。 ま た , 加 圧 ゲ ル は 処 理 圧 力 強 度 が 高 く な る に 従 い , 架 橋 部 の 線 維 は 太 く な り , ネ ッ ト ワ ー ク 間 の 距 離 が 縮 み , ネ ッ ト ワ ー ク が 密 に な る 様 子 が観 察 さ れ た 。

1 万 倍 で 観 察 さ れ た 300 MPa (Fig.15) と 400 MPa (Fig.16) の 微 細 構 造 で は 300 MPa に 比べ 400 MPa で 大 き な空 孔 が 観 察 され た 。 前 述の 300 MPa と 400 MPa の 間 で ゲ ルの GS お よ び WD が減 少 し た (Fig.12) の はこ の 構造 変 化 に 起 因す る と 考 え ら れ た 。 ま た , こ の 変化 は 前 述 の タ ン パ ク 質 間 相互 作 用 の 変 化 (Table 3) も 起 因 し て い る と 考 え ら れ た 。 藤 田 ら (2006) は ゲ ル の 物 理 的 特 性 と 微 細 構 造 の 関 連 は 明 白 で あ る と 報 告 し て お り , 通 常 , ゲ ル の ネ ッ トワ ー ク 密 度 が 高 く な れ ば , ゲ ル の物 性 も 増 加 す る と 考 え ら れ る。 こ のこ と か ら 400 MPa でネ ッ ト ワ ー ク密 度 が 低 下 した こ と に よ り GS お よ び WD は 減少 し , 500 MPa 以 上 で ネ ッ トワ ー ク 密 度 が上 昇 し , GS お よ び WD は 増加 し た と 考 えら れ た 。 以 上 の こ と か ら 加 圧 ゲ ル は 圧 力 強 度 の 違 い に よ っ て ゲ ル を 維 持 す る タ ン パ ク 質 間相 互 作 用 の 変 化 に よ り , ア ク ト ミ オ シ ン や ミ オシ ン の 構 造 変 化 が 起 こ り , こ の 構 造 変 化 に よ っ て , ゲ ル の ネ ッ ト ワ ー ク 密 度 が 変 化 し GS お よび WD に 変 化 を 与 えた こ と が 明 らか と な っ た 。

- 27 -

1 µm

(b)

Fig.14 Microstructure of pressure-induced actomyosin gel (250 MPa, 0ºC, 15 min)

- 28 -

(a)

(b)

1 µm

Fig.15 Microstructure of pressure-induced actomyosin gel (300 MPa, 0ºC, 15 min)

- 29 -

1 µm

200 nm

(b)

Fig.16 Microstructure of pressure-induced actomyosin gel (400 MPa, 0ºC, 15 min)

- 30 -

1 µm

200 nm

(a)

(b)

Fig.17 Microstructure of pressure-induced actomyosin gel (500 MPa, 0ºC, 15 min)

- 31 -

1 µm

200 nm

(600 MPa, 0ºC, 15 min)

a: magnified at 10,000×; b: magnified at 50,000×.

- 32 -

1 µm

200 nm

(0.1 MPa, 70ºC, 30 min)

a: magnified at 10,000×; b: magnified at 50,000×.

(a)

- 33 - を 構成 す る ア ク トミ オ シ ン の高 圧 処 理に よ る ゲ ル 形成 機 構 を 明ら か に する こ と を 目的 に 研 究 を 行っ た 。 ア クト ミ オ シ ン は 塩 化 溶 性 タン パ ク 質で あ る た め , 0.6 mol/kg KCl の 塩 濃度 下 で は ア ク ト ミ オ シ ン の 大 半 を 構 成 し て い る ミ オ シ ン が 単 量 体 と し て 存 在 し , 加 熱 処 理 す る こ と に よ り ゲ ル を 形 成 し た 。 一 方 , ア ク ト ミ オ シ ン の 塩 濃 度 を 0.2 mol/kg KCl 程 度 の 低 塩 濃 度 (1.2% 相 当 )に す る こ と に よ り ミ オ シ ン は フ ィ ラ メ ン ト を 形 成 し , その 状 態で 200 MPa, 0ºC, 15 分 間の 加 圧 処 理を 行 う と ゲル を 形 成 し た 。 ア ク ト ミオ シ ン は , 処 理 圧 力強 度 の 違 い によ り GS お よ び WD が変 化 し , 200 ~ 300 MPa で GS お よび WD は 増 加 し, 300 MPa で 最も 高 い GS およ び WD を 示 し , 良 好 な ゲ ル を 形 成 し た が , 350 ~ 400 MPa の 加 圧 処 理 に お い て GS お よ び WD は減 少 し た 。 この こ と か ら , ア ク ト ミ オ シン は 300 MPa で 加 圧処 理 す る こ と に よ り 良 好 な ゲ ル を 形 成 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 次 に , ア ク ト ミ オ シ ン ゲ ル の 形 成 に 関 与 す る タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 を 調 べ た と こ ろ , 加 圧 ゲ ル に お いて は イ オ ン 結合 と 疎 水 性相 互 作 用が 大 半 を 構 成し て い た が , 300 MPa 以 下 の 圧力 強 度 で 形 成 さ れ た 加 圧ゲ ル は イオ ン 結 合 が , 400 MPa 以上 の 圧 力強 度 で 形 成 さ れ た 加 圧 ゲル で は 疎 水性 相 互 作用 が 主 た る タン パ ク 質 間相 互 作 用 で あ っ た 。 上 述 の 結 果 から , ア ク トミ オ シ ンは 300 MPa 以 下と 400 MPa 以 上 の圧 力 強 度 で形 成 さ れ た 加圧 ゲ ル は 物性 や タ ンパ ク 質 間 相 互作 用 が 異 なっ て い るこ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た , ゲ ル 形 成 に 関 与 す る タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 の 様 相 は 加 圧 ゲル と 加 熱 ゲ ルで 明 ら か に 異 な っ てい た 。 ま た, 微 細 構 造 観察 か ら 加 圧ゲ ル は, 300 ~ 400 MPa 間 で 加 圧 ゲル の ネ ット ワ ー ク密 度 が 減 少 して お り , この こ と が加 圧 ゲ ル の GS お よ び WD に 影 響を 与 え た と考 え ら れ た 。 以 上 の 結 果 よ り , ア ク ト ミ オ シ ン は 加 圧 処 理 に よ り 加 熱 処 理 で は ゲ ル 形 成 困 難 な 低 塩 濃 度 に お い て も イ オ ン 結 合 と 疎 水 性 相 互 作 用 に よ っ て ゲ ル を 形 成 し , 加 圧処 理 と 加 熱 処理 で ゲ ル の物 理 化 学的 特 性 も 異 なっ て い る こと を 明 らか に し た 。

- 34 - 第 2 章 超 高 圧 処 理 後 に 形 成 す る 卵 タ ン パ ク 質 ゲ ル の 形 成 機 構 に 関 す る 研 究 鶏 卵 は ほ ぼ す べ て の 栄 養 素 を バ ラ ン ス よ く 含 ん だ 完 全 栄 養 食 品 と 言 わ れ (加 藤 , 1998), 世 界 で 広く 食 さ れ, 日 本 にお い て も 古 来よ り 食 さ れ (水 間, 2015) 高 い 栄 養 を 摂 取 で き る 食 品 と し て 知 ら れ て い る 。 特 に 卵 黄 は ア ミ ノ 酸 ス コ ア が 「 100」 を 示 し ( 科 学 技 術 庁 資 源 調 査 会 , 1986) 栄 養 価 が 高 く , タ ン パ ク 質 を 16.5%, 脂 肪 を 33.5% 含 み , 脂 質 の 大 部 分 は タ ン パ ク 質 と 結 合 し た リ ポ タ ン パ ク 質 を 形 成 し て い る (峯 木 , 2008)。 リ ポ タ ン パ ク 質 は 高 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質 (HDL), 低 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質 (LDL) お よ び 超 低 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質 (VLDL) に 分類 さ れ る (石 川 , 2008) (Table 4)。こ れ ら の リポ タ ン パ ク 質は 高 い ゲル 形 成 能 と乳 化 性 を 有 する (峯 木, 2008) こ とか ら , 鶏 卵 黄は 加 工 食 品な ど に 広く 利 用 さ れて い る 。 そ こ で , 本 章 で は 卵 黄 加 圧 ゲ ル の 形 成 条 件 , ゲ ル 形 成 機 構 , ゲ ル を 維 持 す る タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 お よ び そ の 微 細 構 造 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し , 研 究 を行 っ た 。 第 1 節 卵 黄 タ ン パ ク 質 加 圧 ゲ ル の 形 成 機 構 に つ い て 1. 試 料 の 調 製 お よ び 実 験 方 法 (1) 卵 黄 試 料 の 調 製 卵 黄試 料 は Fig.20 に 示す 方 法 で 調 製 した 。す な わ ち , 市 販 鶏 卵を 割 卵 し , 卵 黄 部 と 卵 白 部 に 分 離 し た 後 , ろ 紙 を 用 い て 卵 黄 膜 に つ い た 卵 白 お よ び カ ラ ザ を 除 去 し た 。 卵 黄 膜 を メ ス で 破 り , 卵 黄 液 の み を 回 収 し , 攪 拌 し た も の を 試 料 と し た 。 卵 黄 試 料 の タ ン パ ク 質 濃 度 は マ ク ロ 改 良 ケ ル ダ ー ル 法 (安 本 ら , 2006) を 用 い て 測 定 し , タ ン パ ク 質 濃 度 が 100, 125 お よ び 150 mg/g に な る よ う に 純 水 を 用 い て 調 整 し た 。 (2) 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 卵 黄 試 料 は 第 1 章 第 1 節 1. (3) と 同 様 に , 食 品 用 高 圧 処 理 装 置 (Dr.CHEF, 神 戸 製 鋼 所 製 ) を 用 い , 加 圧 処 理 を 行 っ た 。す な わ ち , 圧 力 強度

- 35 -

Plasma 76

Ratio in the plasma (%) Low density lipoprotein

(LDL) 87

Livetin 13

Granule 24

Ratio in the granule (%) High density lipoprotein

(HDL) 67

Phosvitin 17

LDL 8 ~ 16

- 36 -

Chicken egg

Breaking egg shell

Egg whites

Yolk liquid

Separation

Removal of egg whites

with filter paper

Stirring gentry for 15 min

Cut-open vitelline membranes

Vitelline membranes

Egg yolk

- 37 -

Yolk liquid

Distilled water

(adjustment protein concentration)

Store for 8~16 hr at 4ºC

* NaCl or N-Ethylmaleimide

Filling in a plastic case

Pressurization

(200 ~ 650 MPa, 0 ~ 20ºC, 15 min)

Cooling by running water for 15 min

Store for 8 ~ 16 hr at 4ºC

Returning to room temperature

Each experiment

Heating

(0.1 MPa, 80ºC, 30 min)

Fig.21 Preparation of yolk gels

- 38 -

は 200 MPa か ら 50 MPa 間 隔 で 650 MPa ま で, 加圧 処 理 時 の 温度 は 0, 5, 10, 15 お よ び 20ºC の 条 件 で , 卵 黄 に 15 分 間 の 加 圧 処 理 を 行 っ た 試 料 を 試 験 区 と し て 試 験 に 供 した 。 ま た , 無 加 圧 下 (0.1 MPa の 大 気圧 下 ), 80ºC の 恒温 水 槽 中 で 30 分間 加 熱 処 理を 行 っ た 試料 を 対 照 区 とし た 。 加 圧処 理 お よび 加 熱処 理 後 の 試 料は 流 水 中で 15 分 間 冷却 し , さ ら に保 冷 庫 (4ºC) で 8 ~ 16 時 間静 置 し た 後 に各 試 験 に 供し た 。 (3) ゲ ル 強 度 お よ び ワ ー ク ダ ン 値 の 測 定 第 1 章 第 １ 節 1. (4) と 同 様 に 行っ た 。 (4) NaCl 添 加 試 験 タ ンパ ク 質 濃 度を 125 mg/g に 調 整し た 卵 黄 溶 液に 対 し , Fig.21 に 示す よ う に NaCl を 0.1 ~ 0.6 mol/kg (0.1 mol/kg 間 隔) で添 加 し, 攪拌 混 合 後, 一 晩 保 冷庫 で 静 置 し , 加 圧 処 理 (650 MPa, 20ºC, 15 分) を 行 い, 得ら れ た ゲル の GS およ び WD を 測 定 した 。ま た, 対 照 区 と し て同 様 に NaCl を 添 加し た 加 熱ゲ ル も 調 製 した 。

(5) N-Ethylmaleimide 添 加 試 験

タ ンパ ク 質 濃 度 を 125 mg/g に 調 整 し た卵 黄 溶 液 に 対し , ス ル フヒ ド リ ル 基 (SH 基 ) 保 護 剤 で ある N-Ethylmaleimide (NEM) を Fig.21 に示 す よ うに 2 ~ 10, 20 mmol/kg (10 mmol/kg ま で 2 mmol/kg 間隔 ) 添 加 し , 攪 拌 混 合 後 , 一 晩保 冷 庫 で 静 置し , 加 圧 処理 (650 MPa, 20ºC, 15 分) を 行 い, 得 ら れた ゲ ルの GS お よ び WD を 測定 し た 。ま た , 対 照区 と し て 同様 に NEM を 添加 し た加 熱 ゲ ル も 調製 し た 。 (6) SDS-PAGE 加 圧 ゲ ル の 形 成 に 関 与 す る タ ン パ ク 質 の 特 定 を 行 う た め 卵 黄 , プ ラ ズ マ お よ び グ ラ ニ ュ ー ル を 試 料 と し , 還 元 (ME+) お よ び 非 還 元 (ME-) 状 態 で SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) に よ る 分 析 (Laemmli, 1970) を 行 っ た 。 す な わ ち , 各 試 料 に 600 MPa で 0, 5, 10, 15 お よ び 20ºC

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0.1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 溶 液 に 溶 解 し た も の を 還 元 試 料 と し た 。ゲ ル は ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド 濃 度 5 ~ 20%の グ ラ ジ エ ン ト ゲ ル (E-T520L, ア ト ー 製 ) を 用 い , 分 子 量 マ ー カ ー (Precision Plus Protein Unstained Standards, BIO-RAD 製 ) と 各 試 料 を ゲ ル 1 枚 あ た り 20 mA で 泳 動 し た 。 染 色 は CBB 染 色 液 (ア プ ロ サ イ エ ン ス 製 ) を 用 い て 行 っ た 。 ゲ ル の 撮 影 は ゲ ル 撮 影 装 置 (E-Graph AE-9000, ア ト ー 製) を 用 い, 分 子 量 お よ び 染 色 強度 の 解 析 は 解 析ソ フ ト (CS Analyzer 3.0, ア ト ー 製) を 用 い て行 っ た 。ま た , プ ラ ズマ と グラ ニ ュ ー ル は Raju ら (1974) の 方 法 に従 い , 分 画 した 。 す な わ ち, 卵 黄 に等 量 の 純 水 を加 え 攪 拌 後 , 遠 心 分離 (27,000×g, 4ºC, 60 分) し, 上清を プ ラズ マ , 沈 殿 をグ ラ ニ ュ ール と し た。 (7) ゲ ル 溶 解 試 験 卵 黄ゲ ル の 溶 解 試験 は 第 1 章 第 1 節 1. (5) と 同様 に 行 っ た。 た だし , 試 料に は タ ン パ ク質 濃 度 150 mg/g の 加 圧ゲ ル (650 MPa, 20ºC, 15 分) と 加 熱ゲ ル (0.1 MPa, 80ºC, 30 分) を それ ぞ れ 3 g 用 い た。 ま た, 各 溶 液は 10 mL 添 加 し , S3 と S4 で は 溶 解 操 作 を 二 回 繰 り 返 し 行 っ た 。各 溶 解 液 は 透 析 チュ ー ブ (Spectra/Por Dialysis membrane MWCO:6 ,000 - 8,000, Spectrum Laboratories 製 ) を 用 い て , 純 水 を 外 液 と し 48 時 間 透 析 を 行 っ た 。 そ の 後 , マ ク ロ 改 良 ケ ル ダ ー ル 法 (安 木 ら , 2006) に て タ ン パ ク 質 濃 度 を 測 定 し , 各 溶液 へ の ゲ ル の溶 解 率 を 算出 し た 。 (8) 統 計 処 理 統 計処 理 は 第 1 章 第 1 節 1. (5) と 同 様 に, GS お よび WD に つ い て は Tukey の 多 重 比 較 検 定 (有 意 水 準 : p < 0.05), ゲ ル の 溶 解 性 に つ い て は t-検 定 (有 意 水 準 : p < 0.05) を 行 った 。

- 40 - 2. 結 果 お よ び 考 察 (1) 加 圧 処 理 時 の 温 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 加圧 処 理 時 の 温度 が 加 圧 ゲル の 形 成に 与 え る 影 響を Table 5 に 示 し, 加 圧 処理 し た 卵 黄 の外 観 を Fig. 22 に 示し た 。加 圧 処理 時 の 温度 5ºC 以 下で は 600 MPa の 加 圧 処 理 を 行 っ て も 卵 黄 は ゲ ル を 形 成 せ ず , 粘 性 が 増 す 程 度 で あ り , GS お よ び WD は 他 の温 度 帯 よ り有 意 に 低 か った 。 し か し , 加 圧 処理 時 の温 度 10ºC に お い て卵 黄 の GS お よ び WD は 5ºC 以 下 に 比べ 有 意 に 増加 し, 脆 弱 で は あ る が ゲ ル を 形 成 し た 。 さ ら に 加 圧 処 理 時 の 温 度 の 上 昇 と と も に GS お よ び WD は 有 意に 高 く な る傾 向 を 示 し , 20°C に お いて 最 も 強固 な ゲル を 形 成 し た。 同 じ 圧 力 強 度 で の 加 圧 処 理 に お い て も 加 圧 処 理 時 の 温 度 が 異 な れ ば 試 料 に 与 え る エ ネ ル ギ ー 量 は 変 化 す る こ と が 知 ら れ て お り , こ れ に 伴 い , タ ン パ ク 質 の 変 性は 圧 力 と 温 度 の 双 方 が 関 係 す る こと が 報 告 さ れ て い る (月 向, 1990; 大 井, 1994)。ま た, 同じ 圧 力強 度 に お い て加 圧 処 理 時の 温 度が 10 ~ 50ºC の 各 温 度 で は 温 度 の 上 昇 に 伴 い , ゲ ル の 硬 さ が 増 加 す る こ と も 報 告 さ れて い る (Dumoulin ら, 1998)。本 研究 の 卵 黄 の 加圧 ゲ ル 形 成試 験 に おい て も , 加 圧 ゲ ル の 形 成 に は 圧 力 強 度 だ け で は な く , 加 圧 処 理 時 の 温 度 が 大 き く 関 与 す る こ と が 明 ら か と な っ た た め , 本 章 で は 以 降 の 試 験 で の 加 圧 処 理 時の 温 度 は 20ºC に 設 定 す るこ と とし た 。 (2) タ ン パ ク 質 濃 度 と 圧 力 強 度 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 20ºC で の 加 圧 処 理 に お け る 圧 力 強 度 と タ ン パ ク 質 濃 度 が 加 圧 ゲ ル の 形 成 に与 え る 影 響を Fig.23 (a), (b) に 示し た 。 タ ン パク 質 濃度 100 mg/g で は 450 MPa 以 下 の 加 圧 処 理 に お い て は GS お よ び WD の 増 加 は み ら れ ず , 500 MPa か ら 僅 か な 値 の 増 加 が み ら れ 粘 性 が 高 ま り 始 め , 650 MPa に お い て 非 常 に脆 弱 な ゲ ル を形 成 し た。一 方 , タ ン パ ク質 濃 度 125 mg/g で は 450 MPa か ら GS お よび WD は 増 加 し始 め , 脆 弱 な ゲル を 形 成 し, 650 MPa に お いて 自 立ゲ ル を 形 成 した 。タ ン パ ク質 濃度 150 mg/g で は , 400 MPa にお いて GS お よび WD が 増 加 し 始 め, 450 MPa で自 立 ゲ ル を形 成 し た 。 さら に 450 か ら 550 MPa ま で 急 激に GS お よ び WD は 増 加 し, 強 固 な 自 立ゲ ル を 形 成し

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Table 5 Effect of temperature at the high-pressure processing (600MPa, 15 min) on chicken egg yolk

Mean ± Standard error (n = 6). Protein concentration of egg yolk was 150 mg/g . Value in the same row that are followed by different letters were significant at p < 0.05.

Pressure ( MPa ) 600

Temperature ( ºC ) 0 5 10 15 20

Gel Strength ( N ) 0.01 ± 0.00d 0.03 ± 0.00d 1.67 ± 0.09c 5.09 ± 0.20b 6.34 ± 0.40a

- 42 -

0ºC

5ºC

10ºC

15ºC

20ºC

Fig.22 Pressurized chicken egg yolk with 600 MPa at each temperature Protein concentration was 150 mg/g.

- 43 - 5 倍 , 150 mg/g は 約 35 倍 高 い 値 を 示 し た 。 タ ンパ ク 質 は 圧 力強 度 や タ ンパ ク 質 量の 増 加 に 伴 い変 性 が 促 進 さ れ る こ と (Balny ら , 1993), 410 MPa の 加 圧処 理 で 三 次 元的 網 目 構 造の 形 成 や 示 差 走査 熱 量 測 定 によ る 吸 熱 ピー ク の 消失 , 500 MPa の 加 圧処 理 に よ り 卵黄 の 流動 性 が 失 わ れる こ と (Aguilar ら, 2007; 小 谷ら , 2000) が 報告 さ れ てい る 。 吸 熱 ピ ー ク およ び 流 動 性 の 消 失 は 凝 集 体 や ゲ ル の 形 成 と 考 え ら れ る 。 本 研究 に お い て も 圧 力 強 度 とタ ン パ ク質 濃 度 の 増 加に 伴 い GS お よ び WD の 増加 が み ら れ , 卵 黄 の 加 圧ゲ ル 形 成に は 450 MPa 以上 の 圧 力 強 度 と 125 mg/g 以 上 の タ ン パ ク 質 濃 度 が 必 要 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 (3) NaCl 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響 タ ンパ ク 質 の 電 荷や 静 電 的 反発 に 影 響を 与 え る NaCl の 添 加 が 加圧 ゲ ル の 形成 に 与 え る 影響 を Fig.24 (a), (b) に 示 した 。 加 圧 ゲ ルお よ び 加 熱 ゲル は NaCl を 添 加 す るこ と に より GS お よ び WD は 増 加し た 。 加 圧ゲ ル では NaCl 濃度 0.2 mol/kg ま で GS お よ び WD は 増 加 し , NaCl 濃 度 0.3 mol/kg 以 上 では GS お よ び WD は 減少 し た が, NaCl 無 添 加 と 比較 す る と 高 い 値 を示 し , 添 加 量 が 増 して も 値 に ほと ん ど 変化 は み ら れ なか っ た 。 また , 加 熱ゲ ル にお い て も NaCl 濃 度 0.2 mol/kg ま では GS お よ び WD は 著 しく 増 加し , 0.3 mol/kg 以 上 で は 添 加 量 の 増 加 に 伴 い , 緩 や か に 値 は 増 加 し た 。 以 上の 結 果 , 加 圧ゲ ル に お いて NaCl 0.2 mol/kg の 添 加に よ り, ゲル 形 成 が 促進 さ れ た こ とか ら , 1%程度 の NaCl の 添加 は タ ン パク 質 の 静 電 的 反発 力 やイ オ ン 結 合 を促 進 す る と考 え ら れた 。 ま た , NaCl の 添 加に よ り グ ラニ ュ ール が 溶 解 し (小 林 , 2008) プ ラ ズ マと の 相 互 作 用が 変 化 し たも の と 推 察 され た 。

- 44 - 0 1 2 3 4 5 6 7 8 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 G el S tr en gth ( N ) Pressure ( MPa ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 W o rk D o n e ( m J ) Pressure ( MPa )

Fig.23 Effect of pressure intensity and protein concentration on the Gel Strength (a) and Work Done (b) of chicken egg yolk 100 mg/g (●), 125 mg/g (■) and 150 mg/g (▲)

Temperature at the high -pressure processing: 20ºC

The bars indicate standard error (n 



(a)

- 45 - 0 1 2 3 4 5 6 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 G el S tr en gth ( N

Sodium chloride ( mol/kg )

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 W o rk D o n e ( m J )

Sodium chloride ( mol/kg )

Fig.24 Effect of sodium chloride on the Gel Strength (a) and Work Done (b) of pressure-induced (■) and heat-induced (□) gels of chicken egg yolk

Pressure processed at 650 MPa, 20ºC, 15 min; heat processed at 0.1 MPa, 80ºC, 30 min. The bars indicate standard error (n 



- 46 -

(4) N-Ethylmaleimide 添 加 が ゲ ル 形 成 に 与 え る 影 響

SH 基 の架 橋 を 阻 害 する NEM の 添 加が 卵 黄 加 圧 ゲル の 形 成 に与 え る 影響 を Fig.25 (a), (b) に 示 した 。加 圧 ゲ ルは NEM 濃 度 6 mmol/kg ま で 添 加量 の 増 加 に 伴 い GS お よ び WD は 減 少 し , 著 し く ゲ ル 形 成 が 阻 害 さ れ た 。 8 mmol/kg 以 上 で は 6 mmol/kg 添 加 時 の GS お よ び WD と ほ と ん ど 変 化 は み ら れな か っ た 。ま た , 対 照 区 の加 熱 ゲル は NEM 無 添 加で は 加 圧 ゲ ル を約 3 倍 上回 る GS お よ び WD を 示 し た が, 加 圧 ゲ ル と 同様 に NEM 濃 度 の 増 加に 伴 い , GS およ び WD は 急 激 に 減少 し た。 し か し , 10 mmol/kg 以 上 の 添 加で も 加熱 ゲ ル は 加 圧ゲ ル を 上 回る GS お よ び WD を 示 した 。 以 上 の 結 果 , 卵 黄 に NEM を 添 加 す る と , 加 圧 処 理 お よ び 加 熱 処 理 と も に ゲ ル 形 成 が 著 し く 阻 害 さ れ た こ と か ら , 卵 黄 の 加 圧 ゲ ル お よ び 加 熱 ゲ ル の 形成 に は S-S 結 合 が 大 き く関 与 し てい る こ と が 示唆 さ れ た 。こ れ は Yan ら (2010) お よ び Lai ら (2010) の 鶏 卵お よ び ア ヒ ル卵 の 卵 黄 の加 圧 処 理に よ る不 溶 化 が S-S 結 合 に よる 凝 集 で ある と の 推 察 を支 持 す る もの で あ った 。 (5) 卵 黄 ゲ ル の 主 要 構 成 タ ン パ ク 質 の 探 索 加圧 ゲ ル の 形 成に は S-S 結 合 が 大 きく 関 与 し て いる こ と が 推察 さ れ たた め, 加 圧 ゲ ル お よ び 加 熱 ゲ ル の ゲ ル 形 成 に 関 与 す る タ ン パ ク 質 の 特 定 を 行 っ た。 Fig.26 に 卵 黄 の SDS-PAGE (ME+, ME-) の 結 果を Fig.27 に プ ラ ズマ お よび グ ラ ニ ュ ール の SDS-PAGE (ME+, ME-) の 結 果 を示 し た 。 還 元 状態 で の卵 黄 は 未 処 理 (0.1 MPa, 4ºC), 加 圧 処 理 (600 MPa, 0 ~ 20ºC) お よ び加 熱 処 理 (0.1 MPa, 80ºC) の 条 件 の 違 い に 関 わ ら ず, す べ て の 卵 黄 で 同 様 の 泳 動結 果 を 得 た {Fig.26 (a) 1 ~ 7}。 一 方, 非 還 元 状 態で は , 未 処理 の 試料 {Fig.26 (b) 1} は 還 元 状 態 と ほ ぼ 同 様 の 泳 動 結 果 を 示 し た が , 600 MPa, 0ºC の 処理 を 行 っ た 試料 {Fig. 26 (b) 2} は 200 kDa 付近 の バ ン ドお よ び 100 kDa 付 近 の バ ン ド の 染 色 強 度 の 低 下 が 観 察 さ れ た 。 加 圧 処 理 時 の 温 度 を 上 昇 させ る こ と に より , 600 MPa, 20ºC の 処 理 {Fig.26 (b) 6} では 200 kDa 付 近 のバ ン ド は 消 失し , 100 kDa 付 近 のバ ン ド は 未 処理 の 試 料 に比 べ 染 色強 度 が 80%程度 低 下 し た。 ま た, 75kDa 付 近 のバ ン ド も 染色 強 度 の 低 下 が認 め られ た 。次 に , プ ラ ズ マ およ び グ ラニ ュ ー ル (Fig.27) に おい て は プラ ズ

- 47 - 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 20 W o rk D o n e ( m J ) N-Ethylmaleimide ( mmol/kg ) 0 1 2 3 4 0 2 4 6 8 10 20 G el S tr en gth ( N N-Ethylmaleimide ( mmol/kg )

Fig.25 Effect of N-Ethylmaleimide on the Gel Strength (a) and Work Done (b) of pressure-induced (■) and heat-induced (□) gels of chicken egg yolk

Pressure processed at 650 MPa, 20ºC, 15 min; heat processed at 0.1 MPa, 80ºC, 30 min. The bars indicate standard error (n 



- 48 -

マ に 見 ら れ る 75 お よび 200 kDa 付 近の バ ン ド は それ ぞ れ apo-LDL 70 お よ び apo-LDL 175 と 推 定さ れ (Laca ら, 2010), グ ラ ニ ュ ール に 見 ら れ る 100 kDa 付 近 の バ ン ド (Fig.27) は apo-LDL 137 と apo-HDL 105 と 推 定 さ れ る (Laca ら , 2010) 。 加 熱 処 理 し た 卵 黄 , プ ラ ズ マ お よ び グ ラ ニ ュ ー ル は {Fig.26 (b) 7; Fig.27 (d) 3, 6} 600 MPa, 20ºC の 加 圧 処 理 {Fig.26 (b) 6; Fig.27 (d) 2, 5} と 同 様 な 泳 動 結 果 を 示 し , 上 記 の apo-LD L や apo-HDL の バ ン ド の 染 色強 度 の 低 下 が観 察 さ れ た。

卵 黄 加 熱 ゲ ル の 形 成 に は apo-LDL が 関 与 し て い る こ と が こ れ ま で に 報 告 さ れ て お り (Nakamura ら , 1982; Anton ら , 2001), プ ラ ズ マ 由 来 の apo-LDL と グ ラ ニ ュ ー ル 由 来 の apo-HDL と apo-LDL が 卵 黄 の ゲ ル 形 成 の 主 要な タ ン パ ク 質と さ れ て いる 。 ま た , SDS-PAGE (ME-) {Fig.26 (b) 1 ~ 7} の 結 果 から , 加 圧 ゲ ル は 加 熱ゲ ル と 同 様 にこ れ ら の タ ン パ ク 質に よ る 分 子 内 また は 分 子 間 S-S 結合 が 起 こ り , 高分 子 量 の 凝 集体 と な っ たた め , バ ン ド の 染 色 強 度 の 低 下 ま た は バ ン ド の 消 失 が 起 こ っ た と 考 え ら れ た 。 apo-LDL や apo-HDL の 会 合 に は 15ºC 以 上 で 高 い 圧 力 強 度 に よ る 加 圧 処 理 {Fig.26 (b) 5, 6} を 必 要 と し , そ れ ら に よ っ て 加 圧 ゲ ル の 形 成 が 起 き て い る も の と推 察 さ れ た 。 さ ら に , 強 固 な 加 熱ゲ ル を 形 成 す る に はプ ラ ズ マ と グ ラ ニ ュ ー ル 間 の 相 互 作 用 が 重 要 と さ れ て お り (Kisseoglou ら , 2005) 加 圧 ゲ ル に お い て も 加 熱 ゲ ル と 同 様 の こ と が 起 こ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た。 (6) 卵 黄 ゲ ル の 溶 解 性 各ゲ ル 溶 解 液 への 卵 黄 ゲ ルの 溶 解 率を Fig. 28 に 示し た 。加 圧ゲ ル お よ び 加熱 ゲ ル は S4 への 溶 解 率 が最 も 高く , い ず れ も 約 80%を示 し , 両 ゲル の 間に 有 意 差 は 認め ら れ な かっ た 。 次に S3 へ の溶 解 率 が 高 くそ れ ぞ れ 約 10%程度 , 水 溶 性画 分 は そ れぞ れ 3%程 度, S2 への 溶 解 率は 1%程 度 を 示 し , 各 画 分 と も有 意 差 は 認め ら れ なか っ た 。 一 方, S1 へ の 溶解 率 は 加 圧 ゲル が 約 9%, 加 熱 ゲル が 約 5%と なり , 有 意 に 高く な っ て いた 。 不 溶 性 画 分 は 加 圧 ゲ ル が 1%未 満 , 加 熱 ゲル が 約 2%と な り, 有 意 に 低 い 結果 を 示し た 。 以 上 の結 果 か ら , 卵 黄 ゲ ルの 溶 解 性 は 加圧 ゲ ル と 加熱 ゲ ル で

- 49 -

Fig.26 SDS-PAGE analysis of pressure or heat processed chicken egg yolk in reducing (a) and non-reducing (b)

M: molecular-weight marker; 1: 0.1 MPa, 4ºC; 2: 600 MPa, 0ºC; 3: 600 MPa, 5ºC; 4: 600 MPa, 10ºC; 5: 600 MPa, 15ºC; 6: 600 MPa, 20ºC; 7: 0.1 MPa, 80ºC.

M

1

2

3

4

5

6 7

1

2

3

4

5

6 7

( kDa )

250-

100-

50-

37-

150-

75-

25-

20-

15-

- 50 -

( kDa )

250-

100-

50-

37-

150-

75-

25-

20-

15-

10-M

1

2

3

1

2 3

4

5

6

4

5 6

( c )

( d )

( c )

( d )

Fig.27 SDS-PAGE analysis of pressure or heat processed chicken egg yolk plasma (1-3) and granule (4-6) in reducing (c) and non-reducing (d) M: molecular-weight marker; 1: Plasma, 0.1 MPa, 4ºC; 2: Plasma, 600 MPa, 20ºC; 3: Plasma, 0.1 MPa, 80ºC; 4: Granule, 0.1 MPa, 4ºC; 5: Granule, 600 MPa, 20ºC; 6: Granule, 0.1 MPa, 80ºC.