C A N C E R 11 (2002), p. 35-40
甲殻類幼生の走査型電子顕微鏡観察の
ための試料作製法
上 野
正 樹
甲殻類幼生を生きた状態に近い形態で走査型電 ものと考え ，種々の試料作製条件を検討した ． 子顕微鏡で観察するための固定法を開発した ．固 定には電子レンジによるマイクロウェープ照射を 加 え，固定剤もホルマリンではなくグルタルアル デヒドを用い ，高濃度で長時間の固定を行 った． さらに四酸化オスミウムによる後固定を付加する ことで体表面にほとんど変形のない試料作製に成 功 した ． は じ め に 甲 殻 類 を 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 (S E M) で 観 察 す ることは電子顕微鏡の普及とともに広く行なわれ る よ うにな った．成体， 特にクチクラ層が厚く発 達した種においては試料作製時に これといった変 形もおこさず，試料の乾燥と適切なコーティング さえ行えば一応の観察像は得られる ． しかし幼生 の観察となると状況は一変する ．全身を毅うクチ クラ層は固定液の侵入を妨げ，固定液中で長時 間 平気で泳いでいるとい った事態も珍しい事ではな い．動物が大型である場合は体を各部分にあらか じめ解剖して固定を行うことができるが，体長が 1 m m以下の個 体全体 をその まま 固定する場合に は困難が伴う ． たとえ固定がなされたとしても ， 体表の最外層を覆うクチクラは非常に薄く ， クチ クラ下の上皮も薄いため脱水や乾燥中の変形は免 れず，その結果触角をはじめとして 体表各部に変 形が生じ ，生活水中で泳いでいる状態とはかけ離 れた形態を示す結果となる ． このため通常の固定 法では全身観察のような低倍の観察には耐えられ ない ．比較的低倍の観察は体表各部の構造解明ば かりでなく，分類学 にと っても重要な意義を持つ Masaki U ENo: Advanced fixation m ethods: Applications in scanning electron microscopy for crustacean larvae材 料
検 討 材 料 と し て ア ル テ ミ ア (Artemia salina) の幼生を用いた ．休 眠卵 は23℃ の 人 工 海 水 中 で 孵化 させノープリウスおよびメタノ ー プリウス期 の幼生 を採取した ．方法及び検討結果
1. 幼生採集方法 幼生を傷つけず，効率よく 集めるため滅菌ろ過用フィルター （ボトル トップフ ィルタ ー， Becton Dickinson Labware) を使用
した （図1 ). 滅菌フィルタ ー は取り除き ，代 わ りに ペ ーパ ー タオル （キムワイプS-200,クレシア ） をフ ィルターの大きさに切りと って容器にはめ込 んだ ．飼育水は吸引する こ となく水圧のみでフィ ルター外に流れ去るため，幼生を傷めることはな い．幼生はペ ーパータオル上にろ過されて集めら れる ． 図1 幼生採集用フ ィルター：スノコ （中）の上に置 かれているフ ィルターをキムワイプ （右）に替 え、キ ャッ プ（左）をね じ込んで飼育水をこの 中に注いでろ過する．
2. 固 定 ビ ン ヘ の 採 集 幼 生 の 入 れ 方 幼生はろ 過 し た ペ ー パ ー タ オ ル ご と 固 定 液 中 に 移 さ れ る （図2 ). 固 定 ビ ン と し て ガ ラ ス 製2 0 m l バ イ ア ル ビンを用い ， 固 定 液 益 は1 0 m l とした ． ビンのロ に プ ラ ス チ ッ ク 製 の キ ャ ッ プ を ゆ る ＜ 締 め た ． 図 2 固定ビン ：ろ過した幼生はキムワイプごと固 定液に入れてマイクロウ ェーブを照射する． 固定された幼生はビンの底に落ち，キムワイ プは固定後の洗浄時に取り除 く 3. 電 子 レ ン ジ の 照 射 方 法 マイクロウェ ー プ 照 射 の 均 ー化 と固定液温の急激な上昇を防ぐ為， 固 定 ビ ン は 耐 熱 ガ ラ ス 製 の 直 径1 3 c m の 容 器 （レ ンジパック7508G, 岩 城 ハ ウ ス ウ ェ ア ） に4 0 0 m l の 氷 冷 水 を 入 れ た も の に 沈 め た ． 固 定 ビ ン 内 部 の 固 定 液 の 液 面 は 外 部 の 冷 水 面 よ り も わ ず か に 下 が っ て い る ． 固 定 液 の 液 面 が 高 い と そ の 部 分 だけマイク ロウェ ー プが集中して温度が急上昇し てし ま うため ，必ず 外 部 液 面 よ り 低 く な る よ う に する ．照 射 時 は 回 転 テ ー プ ル を 回 転 し ， マ イ ク ロ ウェープの照射むらを防止した ． 4. 電 子 レ ン ジ の 照 射 条 件 電子レンジはマイ ク ロ ウ ェ ー プ 迅 速 試 料 処 理 装 置 (Ml-77型 ，東 屋 医 科 器 械） を使用した ． こ の 器 械 は 間 欠 照 射 や 温 度コン トロー ル が 可 能 に な っ て い る が ， こ れ ら の 機 能 は 使 わ ず ，3 5 0 W の出力で連続照射を行った ． 固 定 液 の 液 温 は 照 射4 分 間 で 約 2 ℃から 75℃ ま で 上昇する. 4分 以上の照射は固定液の沸騰を招き， 安 全 上 問 題 が あ る の で 行 わ な か った. 4 分 間 の 照 射 後 ，固 定 ビ ン を ガ ラ ス 容 器 よ り 取 り 出 し ， 室 温 に放置した ． 5. 固 定 液 の 選 択 3 % パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド の4時 間 単 独 固 定 （マ イ ク ロ ウ ェ ー プ 非 照 射） に よ る 観 察 像 を 図3に示す ． また ，3 % グルタルア ルデヒド4 時間単独固定（マイク ロ ウェーブ非照 射 ） の 像 を 図4 に示す ．後 者 の 方 が 変 形 が 少 な い が，いずれにしても変形が強すぎる ． 固定に4分 間のマイク ロ ウ ェ ー プ 照 射 を 加 え グ ル タ ル ア ル デ ヒドの
i
農度を2.5 - 7 % ま で 上 昇 さ せ た と こ ろ濃 図3 3 % パラホルムアルデヒド4時間単独固定 （マ イクロウェーブ非照射）．メタノープリウスの 全身に激しい変形が起こ っている． 固4 3 % グルタルアルデヒド4 時問単独固定 （マ イクロウ ェーブ非照射）．パラホルムアルデヒ ド固定に比 べると変形がやや 少な く、特に腹 部で顕著に改善されている． しか し触角周辺 の収縮は明 らかに残 っている．上 野 正 樹 37 度 が 高 い ほ ど 変 形 は 少 な く な っ た （ 図5, 6). 7 % 以 上 の グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド は 単 独 で 浸 透 圧 が 環 境 水 の 値 を 超 え て し ま う た め ， 濃 度 は7 % に と ど めた． し か し ， こ れ に よ っ て も ク チ ク ラ の 数 は 完 全 に は 取 れ な か っ た ． なお，固定剤はメーカ ー と ロ ッ ト に よ っ て 固 定 効 果 に 大 き な 差 異 を 生 じ る 場 合 が あ る こ と に 注 意 を す べ き で あ る ．今 回 の 実 験 で は パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド はT A A B 社 ， グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド はT A A B 社 の 50 % 水 溶 液 ， 四 酸 化 オスミウムはM E R C K社 の も の を 用 い た ． 図5 3 % グルタルアルデヒド4 時間単独固定（マ イクロウェーブ照射 ）触角の変形はかなり改 善されている ． しかしまだ鼻先の部分がへこ んでいる． 6. 固 定 液 の 浸 透 圧 幼 生 は ク チ ク ラ が 渾 い た め 固 定 液 等 の 浸 透 圧 の 影 響 を 受 け や す い ． 飼 育 水 の 浸 透 圧 は 約9 8 0 m 0 s m で あ っ た た め 固 定 液 に な る よ う 固 定 液 中 の 海 水 の 混 合 割 合 を 変 化 させた ． 固 定 液 の 浸 透 圧 の 測 定 結 果 を 表1に示 す ． な お ，浸 透 圧 は 浸 透 圧 計 (FISKE O N E - T E N O S M O M E T E R , FISKE A S S O C I A T E S) で 計 測 し た． グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド 固 定 後 の 洗 浄 は2 / 3 海 水 で 行 い ， 脱 水 液 は 浸 透 圧 の 調 整 を 行 わ な か っ た． 図6 7 % グルタルアルデヒド4 時間単独固定 （マ イクロウェーブ照射 ）鼻先のへこみは少なく なったが，大きな被はなくなっていない． 7. 固 定 時 間 マ イ ク ロ ウ ェ ー ブ 照 射 後 の グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド 固 定 液 へ の 浸 漬 時 間 を
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時間- 14 日間まで変化させた ． そ の 結 果 ， 短 時 間 の 浸 漬 で は 稀 に う ま く い く 事 が あ っ て も 安 定 し て よ い 結 果 は 得 ら れ な か っ た ． 浸 潰14 日 で も グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド の 単 独 固 定 で は 体 表 面 の 人 工 的 勘 が 完 全 に は 取 れ な か っ た ． 一 方 ， グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド 浸 漬8 日 の 試 料 に さ ら に 四 酸 化 オ ス ミ ウ ム の 後 固 定 (2 時間 ） を 追 加 し た と こ ろ 体 表 の 勘 は ほ ぽ 完 全 に 無 固定液の種類 3 %パラホルムアルデヒド 4 %パラホルムアルデヒド 3 % グルタルアルデヒド 7 % グルタルアルデヒド 2 %四酸化オ スミウム 人工海水 表1 固定液などの浸透圧 浸透圧m O s m 固定液10m lの作り方 995 8 %パラホルムアルデヒド 3.75ml+ 蒸留水 6.25ml 1279 8 %パラホルムアルデヒド 5 m l + 蒸留水 5ml 910 2 5 % グルタルアルデヒド 1.25 m l + 蒸留水 2.5 m l + 人工海水 6.25ml 905 2 5 % グルタルアルデヒド 2.8ml+ 蒸留水 5.6ml+ 人工海水 1.6 ml 572 4 % 四酸化オスミウム 5 ml+ 人工海水 5 ml 925図7 7 % グルタルアルデヒド10 日間固定 （マイク ロウ ェーブ照射）後，
2 %
四酸化オスミウム で2 時間の後固定をおこ なっ たノ ープリウス 幼生．変形は少なく，ほぼ満足できる像が得 られている ． 固8 7 % グルタルアルデヒド8 日間固定 （マイク ロウ ェープ照射 ）後，2 %
四酸化オスミ ウム で2時間後固定をおこ なっ たメタノ ープリウ ス幼生 （前面）．部分的 には多少変形が認めら れ る が 生 き て い る 状態に近い1
象が得られて いる ． くなり ， メ タ ノ ー プ リ ウ ス の 第 二 触 角 も 自 然 に 近 い 状 態 に 固 定 さ れ た （図7, 8, 9). 四 酸 化 オ ス ミ ウ ム の 固 定 液 で は 長 時 間 の 浸 漬 固 定 は で き な い． なぜならその酸化作 用 に よ り組織の固定後の 侵 食 が 起 こってしまうからであり ，固 定 時 間 は グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド と 同 様 の 条 件 で4分間のマイク ロウェ ー プ照射後2時 間 に と ど め た ． 図9 図8と同様の固定をしたメタノープリウスの 背面．頭 部や触角には変形は 目立たないが， 背部には霰が認められる ．8.
脱 水 条 件 脱 水 剤 と し て 上 昇 エ タ ノ ー ル 系 列を 用 いた ．急 激 な 脱 水 は 変形を もた ら す た め ， エ タノ ー ル の 濃 度 を30, 50, 70, 80, 90, 95, 100 % と し ， 特 に100 % で の 脱 水 は3回 行 っ た ． 各 ス テ ッ プ の 長 さ は1時 間 とし た． 固 定 が 不 十 分 だと高濃度のエタノ ール (95,100% ) に移した時 に変形が起こった ． しかし，固定が完全に行われ た 状 態 で は 変 形 は認 め ら れ な か っ た ． 9. 乾 燦 方 法 と 試 料 マ ウ ン ト S E M試 料 の 乾 燥にはエタノ ー ルを酢酸イソアミルに置換し ，そ の 後 液 化 二 酸 化 炭 素 に よる 臨 界 点 乾 燥 を 行 う か ， か の ど ち ら か を 行 う の が一 般 的 である ． しかし ， ル コ ー ル ヘ の 入 れ 代 え 時 に 変 形 が 生 じ る こ と が 明 ら か に な っ た 臨 界 点 乾 燥 器 に100 % エ タ ノ ー ル のステ ップ か ら 直 接 か け る 事 も 可 能 で あ り ， 酢 酸 イソアミルに置換せず に臨界点乾燥を行うことに し た 乾 燥 し た 試 料 は実 体 顕 微 鏡 下 で 眉 毛 プ ラ シ （図10) を使用して， S E M試 料 台 に 載 せ た ．眉 毛 プ ラ シ は 試 料 を 傷 め ず に 目 的 の 場 所 に 試 料 を 移 動 し固定できた ．試料の試料台への接培にはカ ーボ ンパウダーを木工用速乾ボンド （コニシ ） に練り 込 ん だ も の を 使 用 し た ． これには水をわずかに混 入することによ って，固着時間をコント ロールで上 野 正 樹
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きる．一般に使用されるカーボンテープは接着力 が弱< , 幼生のような表面に凹凸の多い試料には 不向きである ． また，有機溶媒を 含 ん だ 銀 ペ ース ト等では毛細管現象で体表に生える剛毛を伝って ペーストが上昇してしまい，表面構造が埋もれて しまう．カーボンペーストはこの欠点を持たずか つ，固化した面が非常に平滑であるため観察時に バックグラウンドが大変きれいになる（図11 ). 図10 眉毛ブラシ：眉毛を竹串 （右上）の先に接着 してある ．細かい作業に非常に便利で．余分 な力が加わらないため試料を1
纂つけること はない． 図11 観察試料台 ：乾燥済み試料は眉毛ブラシで適 切な方向を定めて試料台上のカーボンペー ストに接着させる．接清剤の乾燦後．オスミ ウムプラズマコーターでオスミウム重合膜 をコーティングしてある ． 10. コ ー テ ィ ン グ コ ー テ ィ ン グ は 試 料 の 帯 電障害防止や（象の明るさおよびコントラストの増 強 な ど の 理 由 か ら コ ン ベ ン シ ョ ナ ル なS EM
では 必 須である ．低倍の観察においては金のスパッタ コーテ ィングで十分と考えられるが，幼生の体表 面は微細な突起に満ちており，スパッタコーティ ン グ で は そ の 微 細 構 造 が ス パ ッ タ さ れ た 粒 子 に 埋もれてしまう ． オスミウムプラズマコーティン グは非常に薄いナノメーターオーダーのオスミウ ムプラズマ重合膜を形成することができ，低倍か ら高倍までの観察に耐える微細形態保持 ，帯電防 止，検出 二次電子量増大の上からも非常に有用で ある ． プラズマ重合膜の厚さは約1 0 n mになるよ うに設定し， 真空蒸着器(VE-2020,
真空デバイス） を用いてコーティングした．考 察
本 研 究 は 甲 殻 類 の 形 態 を 研 究 す る 際 の 一 助と なるように ，出来るだけ簡便な方法でど こでも最 良の結果が得られるS E M
試 料 作 製 条 件 を 模 索 し た結果を示したものである ．最近の電子顕微鏡の 技 術 的 進 歩 に 伴 って ， 性 能 の 良 い 低 真 空S EM
が 開 発 さ れ た ． こ の 顕 微 鏡 を 用 い れ ば 固 定 に 苦 労 する必要は無いのではないかと思われるかも知れ ないが，それは間違いで，低倍から高倍まで満足 の得られる観察像を得るにはやはり完全な固定を 経た試料作りが必要である ．電子レンジ固定につ いては多くの研究が脊椎動物組織の光学顕微鏡像 および透過型電子顕微鏡像を得ることを目的とし ており，最近はなるべく温度を上げないでマイク ロウェーブの固定効果に焦点を当てた固定方法が 検討されてきた．そのために照射時間や到達温度 のコントロールができる特殊な電子レンジが開発 されているが，何とか家庭用の電子レンジで固定 できないかと模索した結果 ，かえって高温が幼生 の固定には有効に働くとの結論が導かれた．マイ クロウェープ照射の固定効果はマイクロウェープ 自体の固定効果と固定液温上昇による加熱効果の2
つ の 面 が あ る こ と が 知 られている ．ウ ォーター バスで固定液を過熱することによって加熱のみの 固定を試みたが，満足の行く結果は得られなかっ た．従 って ，幼生の電子 レンジ固定には両面の効果があることが判明した ．家庭用電子レンジを用 いる際はあらかじめ試科を入れない固定ピンで固 定液が沸騰する照射条件を決めておき，沸騰する 直前の照射時間で照射するとよい．今回は海水中 で孵化したアルテミ ア幼生を用いて各種固定条件 を検討したが，淡水性の甲殻類を含めて種による 条件の差異はもちろん存在するであろう．どの種 の幼生においても共通だと思われるのはマイクロ ウェープ照射を含む高濃度のグルタルアルデヒド による長時間の固定が形態保持に絶大な効果をも たらすことと電子レンジによる加熱効果が固定に 有効である こと である ．こ の点をおさえた上で対 象種に合わせて固定条件を変更すれば良い結果が 得られるはずである．
文 献
水平敏知編 ・著, 1993. マイク ロウェープ照射による 生物試科の 固定・ 染色法の基礎とその応用． 学際企 画社，東京Hasegawa, H . Mizuhira, , V., & Notoya, M ., 2000. Microwave-Stimulated Fixation and Histochemical Application to Biological Specimens. Acta Histochem. Cytochem., 33(5): 319-340.
Hernandez, F. & Guillen, R. 2000. Microwave Processing for Scanning Electron Microscopy. European Journal of Morphology, 38(2): 109-111.
