皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 MRSA 株 に 見 ら れ る 新 規 MRSA ク ロ ー ン の 出 現 状 況
MRS A c lone s ide ntifie d in outpa tie nts ’ c linic s of de rma tolog y 細 谷 志 乃1、 伊 藤 輝 代1 , 2、 三 澤 成 毅3、 吉 池 高 志4、 小 栗 豊 子5、 平 松 啓 一1 , 2
Shino Hosoya, Teruyo Ito, Shigeki Misawa, Takashi Yoshiike, Kunimitsu Yamada, Toyoko Oguri, Keiichi Hiramatsu
1 順 天 堂 大 学 大 学 院 感 染 制 御 科 学 2 順 天 堂 大 学 医 学 部 細 菌 学 教 室 3 順 天 堂 大 学 医 学 部 附 属 順 天 堂 医 院 臨 床 検 査 部 4 順 天 堂 静 岡 病 院 皮 膚 科 5 亀 田 総 合 病 院 臨 床 検 査 部 所 属 英 文
1. Department of I nfection Control Science, Graduate School of Medicine, Juntendo University
2. Department of Bacteriology, School of Medicine, Juntendo University
3. Department of Clinical Laboratory, Juntendo University Hospital
Key Word
community-acquried MRSA,MRSA clones,Staphylococcal cassette chromosome mec （ SCCmec ） , pathogenicity island,Phage open reading frame typing (POT)
ラ ン ニ ン グ タ イ ト ル ： TSST-1 保 有 新 規 MRSA ク ロ ー ン の 増 加 別 冊 希 望 部 数 ： 30 別 冊 請 求 先 ： 順 天 堂 大 学 大 学 院 感 染 制 御 科 学 郵 便 番 号 113-8421 東 京 都 文 京 区 本 郷 2-1-1 ペ ー ジ 数 ： 20ペ ー ジ 図 表 の 数 ： 6 署 名 印
要 旨
我 が 国 の 市 中 に 拡 が る メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 の 特 徴 を 明 ら か に す る 目 的 で ,2009年 2月 か ら 2012年 9月 に 順 天 堂 大 学 付 属 ４ 病 院 の 皮 膚 科 外 来 患 者 の 検 査 材 料 か ら 分 離 さ れ た
methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) 54株 の Staphylococcal cassette chromosome mec （ SCCmec） の タ イ プ と Multi Locus Sequence Typing（ MLST） を 決 定 し た .加 え て ４ 種 の 毒 素 遺 伝 子 の 保 有 を 検 討 し た .
１ ０ の 染 色 体 タ イ プ（ Clonal Complex ）と １ ２ の SCCmecタ イ プ が 存 在 し ,こ の 二 つ の 組 み 合 わ せ で 定 義 さ れ る MRSAク ロ ー ン は 15種 類 以 上 あ っ た .最 も 多 く 検 出 さ れ た の は Clonal Complex (CC)5-typeIIa SCCmec株 （ 16株 ） で あ っ た . 我 が 国 の 院 内 感 染 事 例 か ら 分 離 さ れ る 株 の 多 く が 毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 毒 素 遺 伝 子（ toxic sh ock syndrome toxin gene;tst） 陽 性 の CC5-typeIIa SCCmec株 で あ る の に 比 べ ,今 回 の 供 試 菌 株 中 で はtst陽 性 の CC5-typeIIa SCCmec株 は わ ず か ２ 株 で , 他 はtst陰 性 で あ っ た .CC5株 以 外 が 38株（ 70.4%）あ っ た .そ の 中 で は CC8株 が 12株 と 多 か っ た が ,tst陽 性 CC8-typeIVl SCCmec株 9
株 ,Panton-Valentine Leukocidin(PVL)遺 伝 子 （lukS,F-PV） を 保 有 す る CC8-typeIVa SCCmec株 １ 株 な ど ,既 知 の 毒 素 遺 伝 子 保 有 株 が 10 株 を 占 め た .続 い て 多 か っ た の は と び ひ と 関 連 す る ク ロ ー ン で
CC89-typeV SCCmec株 お よ び CC89-typeIIb SCCmec株 で は ,６ 株 中 ５ 株 お よ び ５ 株 中 ２ 株 が b型 表 皮 剥 奪 性 毒 素 遺 伝 子（ exofoliative toxin b；etb） を 保 有 し て い た . CC121-typeV SCCmec株 は ,2株 中 2株 が a型 表 皮 剥 奪 性 毒 素 遺 伝 子 （ exofoliative toxin a；eta） を 保 有 し て い た .他 に CC1-type IVa SCCmec株 , CC8-typeI SCCmec株 , CC81-type IVg SCCmec株 , CC97-type IVc SCCmec株 , CC89-type IVa SCCmec株 , CC91-type IVa SCCmec株 , CC45-typeIIn SCCmec株 （ サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 株 ） , CC59-type IVg SCCmec株 ,及 び 本 研 究 で 見 い だ さ れ た 新 規 サ ブ タ イ プ の CC8-typeIVm SCCmec,CC89-SCCmec未 同 定 株 が 存 在 し ,多 様 な MRSAク ロ ー ン が 出 現 し て い る 状 況 が 本 検 討 で 明 ら か に さ れ た .
To know the characteristics of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) strains disseminating at the Japanese community, we have determi ned types of Staph ylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) elements, Multi-Locus Sequence Typing (MLST), and carriages of four exotoxin genes (to xic-shock syndrome toxin, P anton-Valentine L eukocidine, and e xfoliative toxins a and b) u s ing 54 MRSA strain s isolated from ou tpatients of clinics of der matology at the f our university ho spitals of
have been identif ied. As results, m ore than 15 MRSA c lones that were defined by th e combination of g enotype and SCCmec type, were identified. Among them, Clonal Complex (CC)5-typeIIa SCCmec strains were the most major (16 strains). In contrast that CC5-typeIIa SCCmec strains known as hospital-associated MRSA clone in Japan carried toxic-shock syndrome toxin gene (tst), only 2 of 16 strains carried tst. Thirty-eight (70.4 %) of isolates belonged to the clones dist inct from CC5-type IIa SCCmec strains. Among th em, CC8 strains we re major(12 strai ns), which contained 9 tst-positive CC8-typeIVl SCCmec clone and
CC8-typeIVa SCCmec strain carrying Panton Valentine Leukocidin gene (lukS,F-PV). Clones related to impetigo were also
identified:7 exfoliative toxin b (etb)-positive clones, CC89-typeIIa SCCmec and CC89-typeV SCCmec strains; and 2 exfoliative toxin a (eta) -positive CC121-typeV SCCmec strains. Other clones were as follows: CC1-typeIVa SCCmec, CC8-typeI SCCmec, CC81-typeIVg SCCmec, CC97-typeIVc SCCmec, CC91-typeIVa SCCmec, CC59-typeIVg SCCmec, CC45-typeIIn SCCmec, CC89-SCCmec nontypeable, and CC8-type IVm, novel subtype of type IV SCCmec
identified in this study. Our data showed that many n ovel MRSA clones have emerged at the community.
序 文 メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 （ methicillin-resistant Staphylococcus aureus;MRSA）は 出 現 以 来 ,院 内 感 染 の 原 因 菌 と し て 問 題 と さ れ て き た .し か し 近 年 で は MRSAは 市 中 感 染 症 か ら 多 く 分 離 さ れ ,健 康 人 が 保 菌 し て い る こ と も 報 告 さ れ る よ う に な っ た1 ）.と り わ け 2000年 代 に は い る と 全 世 界 で そ の 分 離 率 は 増 大 し ,深 刻 な 問 題 と な っ て い る . 市 中 感 染 症 か ら 分 離 さ れ る MRSAの う ち ,外 来 患 者 あ る い は 入 院 後 48時 間 以 内 の 入 院 患 者 か ら 分 離 さ れ ,か つ 各 種 医 療 関 連 の 危 険 因 子（ 人 工 装 置 の 装 着 ,MRSA感 染 の 履 歴 ,12ヶ 月 以 内 の 手 術 , 入 院 ,人 工 透 析 な ど の 経 歴 ） を 持 た な い 株 を Community-associated MRSA（ CA-MRSA）2 )と 呼 び ,医 療 関 連 施 設 か ら 分 離 さ れ る Healthcare-associated MRSA(HA-MRSA)と 区 別 さ れ る よ う に な っ た . MRSAは メ チ シ リ ン 耐 性 を 担 う 遺 伝 因 子 で あ る staphylococcal cassette chromosome mec （ SCCmec） が メ チ リ ン 感 受 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus; MSSA)株 に 挿 入 さ れ た も の で あ る ,そ し て SCCmecに は 構 造 の 異 な る 多 く の 種 類 が あ る こ と か ら3 ）現 在 で は ,MRSAク ロ ー ン を SCCmecタ イ プ と MSSA
染 色 体 の 違 い の 組 み 合 わ せ で 定 義 す る と い う 方 法 が 全 世 界 で 使 用 さ れ て い る .MSSA染 色 体 の 分 類 に は 染 色 体 上 の7つ の housekeeping遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 決 定 し,遺 伝 子 配 列 の 差 異 (alleles)を コ ン ピ ュ ー タ ー 解 析 す る こ と に よ っ て 菌 株 の 識 別 を 行 う Multi Locus Sequence Typing（ MLST）4 ）が 用 い ら れ る .
MRSAク ロ ー ン の 決 定 が 世 界 各 地 で 行 わ れ る と ,そ れ ぞ れ の 国 に 特 徴 的 な CA-MRSAク ロ ー ン が 出 現 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た .ま た CC1-typeIV SCCmec株 ,CC8-typeIV SCCmec株 （ 米 国 ） ,CC30-typeIV SCCmec株 ,CC59-typeV SCCmec株 （ 台 湾 ,中 国 ） ,CC80-typeIV SCCmec 株 （ ヨ ー ロ ッ パ ） な ど 海 外 で の 特 徴 的 な MRSAク ロ ー ン の 多 く は Panton-Valentine Leukocidin(PVL)と 呼 ば れ る 強 力 な 白 血 球 溶 解 毒 素 産 生 株 で あ っ た . 我 が 国 の CA-MRSA に つ い て は , と び ひ 患 者 由 来 株 の 中 で MRSA の 割 合 が 増 大 し て い る こ と が い ち 早 く 報 告 さ れ , ま た 健 康 な 小 児 や 成 人 か ら も 分 離 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る5 ). ま た 海 外 の MR SA の 日 本 へ の 持 ち 込 み も 報 告 さ れ て い る6 ) 7 ). 本 研 究 で は 我 が 国 の 市 中 に 拡 が り つ つ あ る MRSA の 特 徴 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て , 順 天 堂 医 院 の 皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 株 の MRSA ク ロ ー ン を 決 定 し た . 同 時 に 近 年 院 内 感 染 MRSA の 解 析 に 用 い ら れ て い る Phage ORF Polymorphism Typing(POT)8 )を 実 施 し ,POT で 検 出 す る 23 遺 伝 子 の 保 有 の 有 無 と
MLSTと の 対 応 を 比 較 し た . 材 料 お よ び 方 法 1 . 供 試 菌 株 順 天 堂 大 学 医 学 部 附 属 4 病 院 よ り 分 与 さ れ た 2009 年 2 月か ら 2012 年 9 月 に 皮 膚 科 外 来 患 者（ 入 院 後 48 時 間 以 内 を 含 む ）の 表 皮 病 巣 部 及 び 膿 瘍 部 位 （ 皮 下 、 頸 部 な ど ） か ら 分 離 さ れ た MRSA 54 株 : 14 株 （ 順 天 堂 医 院 ） ,17 株 （ 練 馬 病 院 ） ,７ 株 （ 浦 安 病 院 ） ,16 株 （ 静 岡 病 院 ） を 実 験 に 供 し た . 2 . 分 子 疫 学 的 解 析 1)染 色 体 DNA の 抽 出
染 色 体 DNA は QIAa mp DNA Mini Kit（ Quiagen, MD, USA） 及 び シ カ ジ ー ニ ア ス DNA 抽 出 試 薬 （ 関 東 化 学 , 東 京 ） を 用 い た 簡 便 法 に て 抽 出 し た .
2)SCCmec タ イ プ の 決 定
Kondo ら の 開 発 し た Multiplex PCR を 使 用 し た9 ).TypeIV S CCmecの サ
ブ タ イ プ の 決 定 に 用 い た primer setは Table 1 に 示 す9 ) 1 0 ).
3)MLST
Enright ら の 方 法 1 1 ) に 従 っ て 行 い , MLST.net に ア ク セ ス し て
Sequence type (ST ) を 決 定 し , さ ら に eBURSTv3 で Clon al complex (CC)及 び Founder Group(FG)を 決 定 し た .
4)毒 素 遺 伝 子 保 有 の 検 討 PVL遺 伝 子（lukS,F-PV）,毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 毒 素 遺 伝 子 (tst) 表 皮 剥 奪 性 毒 素 遺 伝 子 (et)の 有 無 を PCRに て 判 定 し た .使 用 し た primer setは Table 1 1 2 ) 1 3 )に 示 す . Table1 挿 入 3 . Typ eI V S CCmec の 全 塩 基 配 列 の 決 定
DNA は QIAamp DNA Mini Kit（ Quiagen , MD, USA） で 抽 出 し た も の を 使 用 し た . Expand High Fidelity PCR System ( R o c h e , I N , U S A ) の キ ッ ト を 用 い ,Long-range PCR に て 2 株 （ JCSC8843, JCSC8975） の 持 つ typeIV SCCmec の 全 領 域 を 増 幅 し,そ の 塩 基 配 列 を primer walking に て 決 定 し た.Long-range PCR に 使 用 し た primer 及 び そ の 位 置 は Fig. １ に 示 す . 決 定 し た 塩 基 配 列 は イ ン シ リ コ バ イ オ ロ ジ ー 社 の imc_ge を 用 い て 解 析 し た . 4 ． P OT 法 に よ る 菌 株の比 較 シ カ ジ ー ニ ア ス 分 子 疫 学 解 析 POTキ ッ ト （ 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 用 ）（ 関 東 化 学 , 東 京 ） を用 い添 付 の 説 明 書 に 従 っ て 2 組 の P CR を 実 施 し た 後 ,PCR産 物 を ３ ％ Metaphor agarose（ Lonza, ME USA） を 用 い て １ xTBE bufferに て 電 気 泳 動 を 行 っ た . ２ 組 の PCRに よ り SCCmec上 の ５ つ の 遺 伝 子 ,黄 色 ブ ド ウ 球 菌 のfemA及 び 他 の ２ つ の 染 色 体 上 の ORFに 加 え て , バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ に 代 表 さ れ る 動 く 遺 伝 因 子 上 の 15 の
ORFの 検 出 で き ,こ れ ら の PCR産 物 の 有 無 に よ り 菌 株 を 比 較 す る8 ).
成 績 １ ． S CCmecタ イ プ の 決 定
最 も 多 か っ た の は typeII SCCmec株 で 22株 （ 40％ ） で あ り ,次 い で 多 か っ た の は typeIV SCCmec株 で 21株 （ 39％ ） で あ っ た （ Table２ ） . そ の 他 は typeV SCCmec株 は 9株 , typeI SCCmec株 は 1株 で ,１ 株 は mec 遺 伝 子 複 合 体 の ク ラ ス は 決 定 で き た が ,ccr遺 伝 子 が 検 出 で き な か っ た た め SCCmecタ イ プ が 決 定 で き な か っ た .
次 に typeII SCCmec及 び typeIV SCCmecに つ い てKondoら の 方 法9 )に 基
づ き J１ 領 域 の サ ブ タ イ プ を 調 べ た と こ ろ ,typeII SCCmec株 は IIa （ 16株 ） , IIb（ 5株 ） ,IIｎ （ サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 株 ,1株 ） で あ り ,typeIV SCCmec株 は IVa（ 7株 ） , IVc（ 1株 ） ,IVn(サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 株 , 13株 )で あ っ た .更 に typeIVn SCCmec株 13株 を 用 い て ,typeIVgを 検 出 す る primer1 0 )を 使 用 し て 調 べ た 結 果 ,IVg株 が 3株
見 い だ さ れ た .
2 ． T yp e I V SC Cmecの 塩 基 配 列 の 決 定
そ こ で ,サ ブ タ イ プ の 決 ま ら な い 10株 の 中 か ら JCSC8975株 と
JCSC8843株 を 選 び ,こ れ ら の 株 の 持 つ SCCmecの 全 塩 基 配 列 を 決 定 し た .JCSC8975株 の typeIV SCCmecは ,2012年 に 報 告 さ れ た typeIVl SCCmecと 同 じ で あ る こ と が 判 明 し た1 4 ).次 に typeIVl SC Cmecの サ ブ
タ イ プ を 検 出 す る primer(table 1)を 用 い た PCRを 実 施 し た 結 果 ,10 株 中 の 9株 は typeIVl SCCmecで あ っ た .
他 の 一 株 ,JCSC88 43 の 持 つ typeIV SCCmec の 構 造 を Fig. １ に 示 す .SCCmecJ C S C 8 8 4 3 の サ イ ズ は 28.4kb で ,orfX の 下 流 か ら mec 遺 伝 子 複 合 体 ,ccr遺 伝 子 複 合 体 ま で の 約 17kbの 領 域 は こ れ ま で に 報 告 さ れ た typeIV SCCmecと ほ ぼ 同 じ で あ っ た .し か し ,ccr遺 伝 子 複 合 体 の 下 流 か ら SCCmecの 右 端 末 端 ま で の 領 域 （ J１ 領 域 ） は ,こ れ ま で に 報 告 さ れ た も の と は 全 く 異 な っ て い た の で SCCmecJ C S C 8 8 4 3 を typeIVm SCCmec と 命 名 し た .J1 領 域 に は 9 個 の ORF が 存 在 し た . 特 徴 的 な ORF と し て LPXTGモ チ ー フ を 持 つ ORF（ 3288bp ）が 存 在 し た .Type IVlSCCmec 上 に も 同 様 な 蛋 白 が 存 在 す る . こ れ ら の ORF の C 末 端 を 代 表 的 な 表 層 蛋 白 と 比 較 し た と こ ろ （ Figure 2） ,共 通 し て C末 端 側 に ,LPXTGモ チ ー フ ,疎 水 性 ア ミ ノ 酸 領 域 ,陽 性 に 荷 電 し た ア ミ ノ 酸 が 存 在 し た の で ,
こ れ ら の ORFはStaphylococcus aureus surface protein(sas)の 一 種
で あ る と 判 断 さ れ た1 5 ) 1 6 ). そ し て ,ty peIVl SCCmec 上 に 存 在 す る sas
をsasL, typeIVm SCCmec上 に 存 在 す る sasを sasMと 命 名 す る こ と を 提
案 す る .
3 .皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 M RSA ク ロ ー ン の 特 徴
54株 の MLSTを す べ て 決 定 し た （ Table３ ） .現 在 MLSTの Websiteで は ,旧 来 の Clonal com plex（ CC）を 新 し く 包 括 す る グ ル ー プ 分 け と し て
Founder group（ FG） を 用 い て い る の で ,そ れ に 従 っ た が ,特 に FG1に 属 す る 場 合 は ,従 来 の CCを 使 用 し た ほ う が よ り 明 確 に ク ロ ー ン の 違 い を 表 わ す こ と が で き る と 考 え ,両 者 を 併 記 す る と と も に ,MRSAク ロ ー ン 記 載 と し て は CCを 用 い た .既 知 の STに 属 さ ず ,今 回 新 た に ST番 号 を 登 録 し た 株 が ７ 株 存 在 し た が ,こ れ ら は FG10（ ２ 株 ） ,FG4（ １ 株 ） ,FG1（ ３ 株 ）,FG7（ １ 株 ）と FG3以 外 の す べ て の グ ル ー プ に 分 布 し て い た .54株 の 外 来 患 者 由 来 株 は ５ つ の FG,10の CCに 属 し た .MRSAク ロ ー ン を 保 持 す る SCCmecの タ イ プ と 染 色 体 タ イ プ を CCで 表 示 し た 場 合 ,FG1に 属 す る CC1-typeIVa SCCmec, CC5-typeIIa SCCmec,CC8-typeI SCCmec, CC8-typeIVa SCCmec, CC8-typeIVl SCCmec, CC8-typeIVm SCCmec, CC81-typeIVg SCCmec, CC97-typeIVsSCCmec,FG10に 属 す る CC89-typeIIb SCCmec,CC89-typeIVaSCCmec, CC89-typeV SCCmec, CC89-untypabel SC Cmec, CC91-typeIVa SCCmecを 始 め ,CC45-typeIIn SCCmec（ FG 3,CC121-typeV SCCmec (FG4), CC59-typeIVg SCCmec(FG7) と 16種 類 の MRSAク ロ ー ン が 存 在 し て い た .Table3に 示 す よ う に
,CC5-typeIIa SCCmec株 が 最 も 多 く ,CC8-typeIVl SCCmec株 が こ れ に 続 い た . 毒 素 遺 伝 子 の 保 有 を PCRに て 検 討 し た 結 果 は .tst陽 性 株 は 12株 , lukS,F-PV陽 性 株 は １ 株 ,eta陽 性 株 は 2株 ,etb陽 性 株 は 7株 で あ っ た .tstは ,CC5-typeIIa SCCmec株（ 2/16）, CC98-typeIVc SCCmec 株（ 1）,CC8-typeI Vl SCCmec株（ 9/9）に保 持 さ れ て い た . lukS,F-PV
は CC8-typeIVa SCCmec株 に 保 持 さ れ て い た.米 国 で 蔓 延 す る USA300 の 可 能 性 を 検 討 す る た め arginine catabolic mobile element の 存 在 を PCRで 調 べ た が ,陰 性 で あ っ た .etaは CC121-typeV SCCmec株 に 保 持 さ れ ,etbは CC89-tyepIIb SCCmec株 ,CC89-typeV SCCmec株 に 保 持 さ れ て い た .
Table 2挿 入
４ ． P OT 法 の 検 討
POT法 を 用 い て 54株 を 解 析 し た . POT法 で は ２ 組 の multiplex PCRを 実 施 し 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 の マ ー カ ー と し て のfemA 遺 伝 子 の 検 出 に 加 え （ １ ） SCCmec上 の ５ つ の 遺 伝 子 （ mecA,type 2 ccrA, IS1272の ト ラ ン ス ポ ゼ ー ス , mecI,type II SCCmecの J1領 域 に 存 在 す る kdpC）,（ ２ ） N315株 及 び MW2株 の 染 色 体 上 の ORF(SA2259及 び MW0919), （ ３ ） 染 色 体 上 に 挿 入 さ れ た ト ラ ン ス ポ ゾ ン Tn554,バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ な ど の 動 く 遺 伝 因 子 上 の 1 5 の ORF の 保 持 を 検 出 で き る .Table 3 に SCCmec 上 の ５ つ の 遺 伝 子 及 び 染 色 体 上 の ２ つ の ORF の 検 出 結 果 及 び こ れ ら の 結 果 を 基 に POT値 と し て 数 値 化 さ れ た 結 果 を 示 す （ Table 3） .
先 に 決 定 し た MRSA ク ロ ー ン と 対 比 し た 場 合 ,CC5-typeIIa SCCmec 株 で は ,mecA,mecI,classA type2 ccr遺 伝 子 の 保 持 及 び typeIIa SCCmec の 特 徴 的 OR F で あ るkdpC が 検 出 さ れ , か つ N315 株 の 染 色 体 上 の ORF を
保 持 し て い る こ と が 確 認 さ れ た .し か し POT１ 値 が 106示 す 株 （mecA, IS1272, type 2 ccr,MW0919陽 性 ） に は CC1-typeIVa SCCmec,CC8に 属 し typeIVa, IVl,IVnew SCCmec を 持 つ 株 , CC81-typeIVg SCCmec, CC97-typeIVc SCCmec 株 が 含 ま れ た . ま た POT １ 値 が 104 を 示 す 株 （ mecA, IS1272, type 2 ccr 陽 性 ） に は CC59-typeIVg SCCmec, CC89-IVa SCCmec,CC91-typeIVa SCCmec が 含 ま れ た . CC8-tyepI SCCmecの 場 合 は mecAと IS1272の み が 検 出 さ れ ,CC121-StypeVCCmec及 び CC89-typeV SCCmecの 場 合 は 検 出 さ れ た の は mecAの み で あ っ た .
Table3挿 入 考 察 こ れ ま で の 我 が 国 の 病 院 分 離 株 で は ST5-typeIIa SCCmec株 が 主 要 で あ る と さ れ て い る .今 回 の 解 析 で は ,検 査 室 か ら 分 与 さ れ た 株 は 63株 で あ っ た . こ の 中 に は 後 に 入 院 患 者 由 来 株 と 判 明 し た た め 集 計 か ら 除 外 さ れ た 株 が ９ 株 存 在 し た .こ の 9株 中 で は ST5株 が ５ 株 と 大 半 を 占 め て お り , 依 然 と し て ST5-typeIIa SCCmec ク ロ ー ン が 病 院 感 染 の 起 因 菌 と し て 主 要 な 位 置 を 占 め て い る と 判 断 さ れ た . 今 回 の 解 析 に お い て わ ず か 54 株 中 に 16 種 類 の ク ロ ー ン が 存 在 し た .C C5-typeIIa SCCmecク ロ ー ン の う ち で も ST5に 属 す る 株 は 9株 で ,ま た 他 の 7株 は そ れ 以 外 の STで あ っ た .こ の 点 を 考 慮 に い れ た 場 合 ,病 院 に 主 に 蔓 延 し
て い る ST5-typeIIa SCCmec以 外 の ク ロ ー ン は 54株 中 45株 （ 83％ ） で あ っ た . 今 回 分 離 さ れ た ク ロ ー ン はeta, etb 保 有 株 は と び ひ 由 来 株 と し て 報 告 さ れ た ク ロ ー ン と 同 じ で あ っ た . 今 回 の 検 討 し た 株 の 中 に は 海 外 の MRSA の 持 ち 込 み と 推 定 さ れ た 株 は 存 在 し な か っ た . し か し , 我 々 の 以 前 の 検 討 で は 順 天 堂 病 院 の 皮 膚 科 外 来 患 者 由 来 株 よ り 米 国 で 蔓 延 し て い る USA300 と 判 定 さ れ た 株 が １ 株 , 台 湾 で 蔓 延 し て い る ST5 9 と 判 定 さ れ た 株 が 分 離 さ れ た .USA300 は 我 が 国 で は 200 8 年 に 最 初 に 報 告 さ れ て い る が ,そ の 後 ,報 告 例 は 増 加 し 爆 発 的 に で は な い が 徐 々 に そ の 分 離 株 が 増 加 し て い る と 思 わ れ る6 ) 7 ).
毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群 毒 素 toxic shock syndrome toxin(TSST-1)
は 1981 年 に 米 国 で 初 め て 報 告 さ れ た 毒 素 性 シ ョ ッ ク 症 候 群toxic
shock syndromeの 原 因 毒 素 で あ る .tstは 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 染 色 体 上 の
pathogenicity isl and（ PI）上 に コ ー ド さ れ て い る .最 初 に 報 告 さ れ た RN4282株 の も つ SaPIは integraseの 相 同 性 か ら ゲ ノ ム 上 の 3時 の 位 置 に 挿 入 さ れ て い る と 推 定 さ れ る . こ れ に 対 し て 我 が 国 の typeII SCCmec株 の 多 く が も つ tstは 10時 の 位 置 に 存 在 す る 別 の integraseを 持 つ PI（νSa4）上 に コ ー ド さ れ て い る .ST8-type IVｌ 株 の 多 く は tst 遺 伝 子 を 保 持 し て い た が , こ れ は Iwao ら に よ り 既 に 報 告 さ れ て い る よ う に SaPIm と 同 様 に 3 時 の 位 置 に 挿 入 さ れ て い る と 推 定 さ れ る1 4 ).
じ く 3 時 の 位 置 に 挿 入 さ れ て い る 別 の P I を 保 持 し て い る と 思 わ れ る （ Uehara,未 発 表 デ ー タ ） . 今 回 検 討 し た 菌 株 は 外 来 患 者 あ る い は 入 院 後 48 時 間 以 内 の 入 院 患 者 か ら 分 離 さ れ た 株 で は あ る が , 各 種 医 療 関 連 の 危 険 因 子 に 関 す る 情 報 は 得 る こ と が で き な か っ た の で community-onset MRSA に 分 類 さ れ る 可 能 性 は 否 定 で き ず community-onset MRSAと community-associated MRSAの 混 合 し た も の と み な す の が 妥 当 で あ る と 考 え て い る が , 今 回 の デ ー タ は ,tst を コ ー ド す る 新 し い P I が 出 現 し , 市 中 に 広 ま っ て い る こ と を 示 し て い る と 考 え ら れ た .ま たtypeIVl SCCmec上 に 存 在 す る は LPXTGモ チ ー フ
を も つ ORF（ 5046bp ）及 び 本 研 究 で 明 ら か に し た typeIVm SCCmec上 の
LPXTGモ チ ー フ を も つ ORF（ sasM,3288bp）な ど ,Sasタ ン パ ク 質 を 持 つ
TypeIVSCCmecを 持 つ 株 が 10株 存 在 し た の も 一 つ の 特 徴 で あ っ た .
黄 色 ブ ド ウ 球 菌 は 宿 主 組 織 と の 結 合 や 宿 主 の 免 疫 を 回 避 す る た め に 働 く 各 種 の 表 層 タ ン パ ク を 産 生 す る こ と で 知 ら れ る .免 疫 グ ロ ブ リ ン IgGと 結 合 す る protein A,フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン 結 合 蛋 白 な ど が 代 表 的 な も の と し て 古 く か ら 知 ら れ て い る が ,こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 共 通 し て C末 端 側 に（ １ ）sortaseの 働 き に よ り 切 断 さ れ る LPXTGモ チ ー フ ,（ ２ ） 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 領 域 ,（ ３ ） 陽 性 に 荷 電 し た ア ミ ノ 酸 を 持 っ て い る1 5 ) 1 6 ).報 告 さ れ た ゲ ノ ム 配 列 を コ ン ピ ュ ー タ ー 解 析 し た
更 に 10の 新 規 タ ン パ ク 質 が 見 出 さ れ た1 6 ) 1 7 )
.こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 先 の 報 告15~ 17)に 基 づ き Staphylococcus aureus surface (Sas)
proteinと 命 名 さ れ て い る .SCCmec上 で 見 出 さ れ た 最 初 の sas蛋 白 は typeI SCCmecの コ ー ド す る plasmin sensitive protein (pls)で あ る . 今 回 検 討 し た typeIVl SCCmec上 の ORF 及 び 新 規 typeIV SCCmec上 の ORFも sas蛋 白 に 分 類 す る の が 妥 当 と 考 え た .こ れ ら の ORFの 機 能 は ま だ 特 定 さ れ て い な い が ,何 ら か の 宿 主 へ の 定 着 ,宿 主 免 疫 か ら の 回 避 に 働 い て い る こ と が 推 測 さ れ る .
Figure2挿 入
POT法 は ２ 組 の multiplex PCRを 実 施 し ,生 成 さ れ た DNA断 片 か ら 菌 株 の 特 徴 を 推 定 す る 方 法 で Suzuki 等 に よ り 開 発 さ れ た 方 法8)を 基 に , 改 良 さ れ た も の が 市 販 さ れ て い る .菌 株 か ら 簡 便 法 で 抽 出 し た DNAを 用 い て 菌 株 間 の 相 同 性 を 簡 便 に 比 較 す る 事 が で き る の で , 院 内 感 染 の 解 明 な ど に 役 立 つ と さ れ て い る . し か し , 特 定 の ORF を 検 出 し て MRSA ク ロ ー ン を 推 定 す る の は , 原 理 的 に も 非 常 に 難 し い と 推 定 さ れ る . 今 回 の 我 々 の 検 討 で は , 設 計 さ れ た primer か ら 予 想 さ れ た 通 り CC5 − typeIIa SCCmec 株 の 検 出 は 確 実 に で き , 菌 株 相 互 の 比 較 も で き る こ と が 示 さ れ た . ま た typeIV SCCmec 株 の 同 定 も で き る . し か し , 複 数 の MRSA ク ロ ー ン が 同 じ POT 値 を 示 す 事 か ら 他 の ゲ ノ タ イ プ の MRSA, 他 の SCCmec タ イ プ 株 は 特 定 の ク ロ ー ン を 同 定 で き る と い う 段
階 に は 至 っ て い な い と 判 断 さ れ た . N akao ら は 入 院 小 児 患 者 の 糞 便 分 離 株 と 鼻 腔 由 来 株 を POT法 に て 比 較 し ,同 一 の 菌 株 が 鼻 腔 及 び 糞 便 か ら 分 離 さ れ た こ と を 推 定 し て い る1 8 ).POT 値 か ら MRS A ク ロ ー ン を 推 定 す る 作 業 は , MRSAク ロ ー ン を 推 定 す る 原 理 に 基 づ い た も の で は な い た め ,POT 値 か ら MRSA ク ロ ー ン を 推 定 す る こ と せ ず , 簡 便 法 と し て 利 用 し , 我 が 国 の 病 院 に 蔓 延 す る 代 表 的 な CC5-typeIIa SCCmec 株 の 同 定 あ る い は そ れ と の 識 別 ,及 び 増 幅 さ れ た DNA断 片 の パ タ ー ン の 比 較 に よ り 菌 株 間 の 相 同 性 を 見 る こ と に 留 め る べ き で あ る と 考 え る . 謝 辞 菌 株 の 収 集 に 御 協 力 い た だ い た 順 天 堂 大 学 附 属 静 岡 病 院 検 査 部 山 田 邦 光 氏 ,順 天 堂 大 学 附 属 浦 安 病 院 検 査 部 中 澤 武 司 氏 ,順 天 堂 大 学 附 属 練 馬 病 院 検 査 部 立 花 勇 一 氏 に 感 謝 申 し 上 げ ま す .ま た 研 究 を 御 指 導 ,御 協 力 頂 い た 順 天 堂 大 学 感 染 制 御 科 学 韓 笑 博 士 ,張 萌 博 士 ,呂 宇 傑 氏 に 感 謝 申 し 上 げ ま す .本 研 究 は 文 部 科 学 省 基 盤 研 究 (C19590456) 及 び 私 立 大 学 戦 略 的 基 盤 形 成 支 援 事 業（ 2012 – 2017） の 支 援 を 受 け た. 利 益 相 反 自 己 申 告 ： 申 告 す べ き も の な し 文 献
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Fig. 1. Structure of two type IV SCCmec elements.
Structures of type IV SCCmec of a new subtype and type IVl SCCmec are illustrated based on the nucleotide sequences deposited in the DDBJ/EMBL/Genbank databases under the accession nos.AB872254 and AB872255 respectively. The black triangles (▲) indicated the positions of direct repeat sequences located at the both ends of the elements. The arrows indicted locations of the primer’s pairs used for amplifying DNA fragments used for nucleotide sequencing. Nucleotide sequences of primers are as follows: cR2(5'-AAACGACATGAAAATCACCAT-3'), mA1(5'-TGCTATCCACCCTCAAACAGG-3'), mA2(5'-AACGTTGTAACCACCCCAAGA-3'), pSJ21-3(5’-TATCTCTTAAGGCGTTGACAACAT-3'),
com13(5’-AGCTGTATCAGTCGCTGGTAA-3'), LO2-N (5'-CAGTCGCATCAAATGTCTCTAATG-3').
ORFs encoded by SCCmecJCSC8975 (21 ORFs) and SCCmecJCSC8843 (28 ORFs) are indicated by thick arrows.
Fig. 2
Comparison of C-terminus amino acids of LPXTG-motif proteins.
Amino acid sequences of C-terminus of two Staphylococcus aureus surface proteins (Sas) are compared to 3 representative LPXTG-motif proteins. LPXTG-motif (five amino acids sequence), which are composed of L(Leucine), P(Proline), X (Aspartic acid or Glutamic acid), T(Threonine), and G(Glycine), are marked with underlines. Three representative LPXTG motif proteins are S. aureus protein A (Spa), fibronectin-binding protein (FbpA), plasmin sensitive protein (Pls). All of them are cell-wall anchor proteins.Spa bind immunoglobulins through the Fc part of several kinds of IgG antibodies.FbpA influences host tissue adherence by binding to host fibronectin. Pls, which is associated with poor bacterial adherence to fibronectin and immunoglobulin G, are suggested to be a virulence factor
for septic arthritis and sepsis.
Asterisks indicate common sequences between five proteins. H(Histidine), K(Lysine), and R(Arginine) are positively-charged residues; D(Aspartic) and E(Glutamine) are negatively-charged residues.
Table 2 Characteristics of 54 MRSA clones
Founder groups Clonal complexes SCCmec types
FG１ CC1 (n=2) IVa(n=2) CC5 (n=16) IIa(n=16) CC8 (n=12) I(n=1) IVa(n=1) IVl(n=9) IVm(n=1) CC81 (n=2) IVg(n=2) CC97 (n=1) IVc(n=1) FG3 CC45 (n=1) IIn(n=1) FG4 CC121 (n=2) V(n=2) FG7 CC59 (n=1) IVg(n=1) FG10 CC89 (n=16) IIb(n=5) IVa(n=4) V(n=6) ND*(n=1) CC91 (n=1) IVa(n=1) *ND :Not determined
1) Abbreviations:tst , toxic shock syndorome toxin; lukS, F-PV ; genes for S- a: etb , exfoliative toxin b.
tst lukS,F-PV eta etb - - - -+ (2/16) - - -- - - -- + (1/1) - -+ (9/9) - - -- - - -- - - -+ (1/1) - - -- - - -- - + (2/2) -- - - -- - - + (2/5) - - - -- - - + (5/6) - - -
-carriage of exotoxin genes1)
fragment and F-fragment for Panton Valentine Leucokidin; eta , exfoliative toxin
com13
28.4kbp
orfX IS431 ugpQ mecA
5,000bp
△mecR1 IS1272 10,000bp
classB
J1 region
ccrB
IS431 ugpQ mecA △mecR1 IS1272 ccrB ccrA ccrA 15,000bp orfX
