植物病原性細菌を用いたクズの生物防除

1

> 3 5 6 3 1〜

3

禽 近臥 棚 .紺 鮎弊 那 8号 200

植物病原性細菌を用いたクズの生物防除

野 々村 照雄 *･林 美世絵 *･泉 美里 *･楼谷 保之*･豊 田 秀吉 *

●近世 ^一年出単部雌羊糾 (

)1‑が急激 に繁殖 し始め､

bt oaa Puerari

Ⅰ

. ^{あ るクズ ( al}

生態系に様 々な悪影智 を及ぼ している0本キ ャン 地球環境問題 や生物種の保全が世 界中で注 目さ パ ス内においては､絶滅危快種 (レ ッドリス トに

0

挙げ られている生物磯)に指定 された

1

唖程の勅 なが ら､現在 ､その成果は乏 し く､深刻な一歩 を 物種 が確認 されてお り､例えば､昆虫燐ではオオ 辿 っている｡ また､私達 が生活 している身近な場 ムラサキ､べ二 イ トトンボ､ イ トア メンボな どが 面で も､環境問題や生凄 系の悪化 を認識す るこ と 絶滅 危快種 として指定 されてい る1')｡ この よ うな がで きる.近怨大学奈 良キ i･ソパ スは 自然に囲 ま 勤物種の個体群密度が クズの繁殖 に よって急速 に れた緑盤かな場所 に存在 しているOしか しなが ら､ 減少 している と考 え られ る｡ そ こで､筆者 らは､

5月中旬頃 か ら11月にかけてマ メ科植物の一種で 本学キ ャンバ ス内での絶滅危倶種の保全や封観の

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緒言

れ､その解決策 が早急 に誹 じられているC しか し

32 軒 'L村 僻雌 ･杯 美 ut絵 ･良

保全を 円的 とした全学的研究 を展開することとし た｡ その節 1段階 として､植物病理学の立場 か ら 繁殖旺盛な クズを防除す るため､微生物 を用いた 防除 (生物防除)を試み るこ ととした｡ 自然 界で は クズに病原性 を示す数唖の微生物が存在 し' '

…､ 自然 界に存在 す る微生物 を用 いた雑 草防除

は

｢環境 にや さ しい ソフ トだ珪素 ｣ と考 え られ る. そ こで筆者 らは､ クズに強 い病原性 を示す微生物 を 分離 した後､その細菌の細菌学的諸性質を検討す る とともに

､

野外で生息 しているクズ茎 に細菌旅 を注入接種 し､生物防除幣材 としての適 用を検討 することとした｡

Ⅱ.材料および方法

1.クズ葉か らの病原性細菌の分離

近畿大学奈 良キ ャンパス内では クズのIEE盛な繁 茂が 見 られる (図 1A)｡ そこで本実験 では､ クズ 薬 か ら琉 点性 の病斑 を示 した細菌 を分離 す るた め ､ 比校 的 新 しい病王妊部 を 切 り取 り､ 水洗 後 ､

tf 分

､ l

7 ンチホル ミンで 1

70

J'エ ク ノーJレで

1 t

X'

分表面滅菌 し

､

滅菌水で数回洗浄 した｡ 次に､そ れ らを乳鉢内で摩砕 し､L寒天培地 (

5g

酵母エ キ ス

､10g

パ ク トトリプ トン

､1 0g

塩化ナ ト

リウム お よび

15%

寒 天 ) に塗 抹 植菌 した 後 ､ 30℃で

3

日間培頚 したo コロニー色や形状 を‑Eにi‑

ら種規の細菌 を単離 した｡ また､ これ らの分離細

美盟 ･慣 '6 保之 ･盟lll 秀吉

菌 に ついて はMPL‑01､MPL‑02､MPL‑03､ Mph‑04およびMPL‑05と命名 し､以下の実験 に 使用 した｡

2.

病原性細菌の同定

常法Tlに従って細菌学的許性質を検討す るため､

透過 aJ.稲 子顕微鏡 (でEM)での形,tE観察 ､ グラL.

ム熟 色､OF培地 (10g グJL,コー ス､ 2g ペ プ トン

､･ 5 g

塩化ナ トリウム

､04 .

9'1プロムモチモ ー ルプル‑お よび0.3%寒天 )を用 いたブ ドウ糖 発酵性試験､IDテ ス ト､幣化性試験､ペ クチン . セルロー ス ･デンプ ン分解性試験 お よびオキ シダ ーゼ活性試験 を行った｡

a )

グラム染色

細菌 懸濁液を スラ イドガラ ス上で塗抹夙乾 させ た後､ 火炎固定 を行 った｡ 次に グラム娘色液 (保 存液A:クリスタル紫 7gを

9 t 5

Mエ ク ノー.

J L]0 ,0 mL

に溶解 した もの､保 存旅B :フ ェ /‑ル5gを水

100川

1に溶解 した もの)で約

1

分間染 色 した後､

洗浄を行い､碓紙で余分な水分を取 り除いた｡ ル ゴール液 (ヨウ素 ･ヨウ化カ リウム液)を滴下 し､

1

分間1‑#旺 した後､水洗を行い

､

縫紋 で余 分な水 分を取 り除 いた｡ 次に､紫の 色素がな くなるまで 連続的 にアル コールを滴下 し､水洗を行 った｡最 後に､サ フラニン染色液 (サ フラニ

ン･ 5g

を9う%

エ ク ノー ル

1001 1

11に溶解 し､ 使用の際､ これ を 10倍希釈す る｡)で

10

秒間毅 色 し､水洗後､検錠

図1.近横大学奈良キ ャンパス内でのクズの繁茂 (A)とクズ葉に形成 された斑点性病斑 (B) 病斑部か ら

5

つの細菌

( C‑ G)

が分離 された｡

33 植物病原性細菌を用いたクズの生物防除

を行 った｡

b)OF

培地を用いたブ ドウ糖発酵性試験

試験管に

OF

培地 を

5ml

ずつ分注 し､半数の試 験 管 には厚 さ

1cm

にな るよ うに流動パ ラフ ィン を重層 した｡ それぞれ 1本ずつを 1組 として､刺 増感 した

025

℃で培糞 した後､培地 が黄色 に変化 した場 合は発声的分解､開放系の培地のみが萌 色 に変化 した場合は酸化的発酵 と判断 した｡

C)lDテス ト

ブ ドウ糖 発 酵 性 梓 菌 同定 用 にはIDテ ス ト ･

NF20

(日水製薬杜興) をブ ドウ糖非発酵性梓菌 同定用 にはIDテス ト

･NF1 8

(日水製薬社製)杏 使用 し､生化学的性状 を検討 した｡ まず､細菌液 の調整 を行 うために､被検菌を

30

℃で一晩振 とう 培糞 した後 ､遠心分離 したoIDテ ス ト

･NF20

を 用 いる場 合は細菌密度を

3. 0×1 0

･'細菌/mlに､I D テ ス ト

･NF1 8

を用 い る場合は細菌密度 を

1. 5×

1 0

^H細菌/mlに調整 した｡次に､調整 した細菌液を 滅菌 ピペ ッ トを用 いて吸 い とげ

､NF

プ レー トの 各検定 ホール に

0. 1 ml

ずつ注入 したO注入後､指 定C)9項 目には流動パ ラフ ィンを

3 5 ‑

.層 にな る ように重層 し空気を遮断 した後

､NF20

は

1 8‑20

時間

､NF18

は

22‑24

時間､37℃の温度 条件下 で反応 させた｡

d)資化性試験

カゼ イソ ･キ トサンお よびデンプン添加

M9

最 少寒天培地 を用 いて､ 各分離細菌の資化能につい て検討 した｡

e)分解性試験

各分離細菌のペ クチン ･デンプソおよびセル ロ ースの分解能 を検討するため､分離細菌 を

30

℃で

‑‑･晩振 とう培兼 した後､遠心分離 し､細菌密度 を

1. 0×1 0

17細菌

/ m

lに調整 した｡ 次に､細菌懸濁液 を

M9

最少寒天培地 に塗抹植菌 し

､30

℃で

5

日間 培雀 した後､ハ ロー (透 明帯)形成の有無 を観察

した ｡

f)オキシダーゼ活性試験

1%

テ トラメチルパ ラフ ェニ レンジア ミン水溶 液 を数滴澄み込 ませた試薬 に白金耳を用 いて菌体 を塗 りつけた｡ また､塗布後

､1 0

秒以内に渡紫色 に変化するか否かで活性の有無 を判断 した｡

3.

クズ葉への分離細菌の接種

得 られた

5

つの分離細菌 をそれぞれ

1. 0×1 . 00

細 菌/mlに調整 し､ クズ薬 への接種 を試みた｡ ま

ず､滅 歯針 (

1

本

､5

本および

1 0

本)で薬面上 を 傷つけ､細菌液を接稚する方法を行 った｡さらに､

クズ茎への針接種 およびカーボランダムを用 いた 唱導接鹿 を行 った｡

4.

クズ葉 における病撒観察

得 られた

5

つの分離細菌を用い､ クズ葉 に接種 した後 ､病徴進展を観察 した｡ まず､葉脈 に注射 針を差 し込み､導管に細菌液を直接注入 し

､25

℃ の 温 度 条 件 下 で培 逢 した ｡ また ､ 細 菌 密 度 を

1. 0×1 0

‑･細菌

/ ml .

､

10×1 0

ホ細菌

/n rl

および

ユ0× . 1 0

1細菌0 /lr州こ凋啓 した後､接種 に使用 した0

5.1 6

Sリボ ゾーム

DNA

領域の解析

既報h■の

16

Sリポ ゾーム

DNA

領域 に基づ いて

2

機 構 の プ ラ イマ ー

(16S Forwar dl5' ‑ GRAGAGTTTGATCMTGGC‑ 3'

､

16S Rever s e:5'‑GGTTACCTTGTTACGATT‑

3'

) を作製 した

｡PCR

条件 は､熱変性

94

℃

､ 1

分､アニー リング

51

℃

､ 1

分､伸長

72

℃

､

1分､

25

サ イクルで行われた｡ さ らに､得 られた

PCR

増幅産物 を電気泳動 にて確認 した後､その増幅産 物 を

pCR4‑ TOPO

ベ クター

( I nvi, r r ogen

社製 ) に挿入 し､塩基配列の決定 を行 った｡

6.

分離細菌の宿主範囲の検定

クズ と同 じマ メ科 に属する植物 (インゲン､エ ン ドウお よび レンゲ)を用 い､上記 と同 じ方法で 接種検定 を行 った｡

7.

野外で繁茂するクズへの分叔細菌の接種 a)単独接種

5

つり分 離細 菌 とか さ枯病 菌 (Pseudomonas syigerna

p. v

paelcl)hsoioa を供試 し

､3

種類の方 汰 (針接種､チ ップ接種および脱脂綿)を用 いて､

単独接種 を試みた｡分離細菌 をそれぞれL培地 で 一晩振 とう培式 した後

､150 0p .0 rm

で

1

分間遠 心分離 し､ リン酸緩衝液で懸濁 した｡ 次に トーマ 氏血球盤 を用いて､細菌密度を

1. 0×1 0

L細菌O

/ ml

に調整 した｡針接種 は シ リンジに細菌 液 を入れ､

クズ茎 に直接注入 した.チ ップ接種はチ ップに菌 液を入れた後､クズ茎 にチ ップを直接差 し込んだO 脱脂綿接種 は クズ茎の先端 を切断 した後､細菌液

を含 ませた脱脂綿 で切 り口を包んだ｡

b)混合接種

野 々村 照雌 .林 剃 Lt絵.淡 央里 .怖谷 保之 .掛u 秀藷

5

つの分離細菌 とか さ枯病菌 を用い､それぞれ 経時的観察 を行 った｡ その結果､培養温度20℃､

2

機構ずつ混合させ､クズ茎 に針接種 した.また､ 25℃では､培頚後3日日までに褐色の病斑 が観察 これ らに供試 した細菌は､菌密度 を10×10 ■細o されたが､接健後

3

日目を経過す ると褐色 した柄 菌/mlに調整 した後､混 合した｡

Ⅲ.結果および考察

1.クズ葉か らの細菌分離

本実験では､L一培地 を使用 し､本キ ャンバ ス内 で採取 した図1Bに示す ような戊点性病斑 の観察 された クズ集 を供試 し､それ らの病斑部 か らクズ に強 い病原性 を示 す微生物の分離 を試みた｡ その 結果､ コロニーの色､形状 および^.きさが異なる 細菌が分離 され､その うち高頻度 ･高密度 に分離 された 5億頬の細菌 をMPL‑Ol(図 1C)､MPL‑

02(図 1D)､MPL103(図 1E)､MPL‑04(図

斑の開園が黄 化 し､接種後

5

日日を経過す る と病 斑はほ とん ど広が らなか った｡ しか し､培慈温度 30℃では､援越後5日日までの病斑の広が りが激 しく

､5

日目を経過 する と次 々に薬の枯死が観察 された (図2)｡以上の結果か ら､ これ ら分離細菌 の発病最適温度は30℃であることが示唆 された｡

1F)およびMP ‑1,05(図1G)と命 名 し､以後の

0

実験 に使用 した｡

2.

分軌細菌の同定

得 られた 5つの分離細菌 を 1種頬ずつ用いて､

細菌学的諸性質a)検討 を行 ったoMPL‑01および

10

B

(

[[ ヽ′̲...

濫 5

MPL‑02は､ブ ドウ糖非発酵性 グラム陰性菌であ $ 1匹 ったため､1Dテ ス ト･NF‑20を用 いた｡ その結

i

t rcescens

03､MPL1 ‑ はブ ドウ糖 発酵性

､l ･NFl18 グラム陰性菌であ ったため Dテス ト

ll R ha neaa

ama と同定 された｡ また､MPL 04お よびMPL 05

S Eera

果､MPL101は qlLtailis､MPLl02は

0

C 10

‑

を用 いたo その結 果､MPL‑03は nas P

o Pseu od na

ho s

t

4

an

0

‑

mo はX mo small

pと同定された｡

ona P dseuom cepac

i

a

､MP

L

MPL‑05は s

ia il h ､

3.

クズ葉への針接種

得 られた

5

つの分離細菌 を用い､薬面上 に直接 0 細菌懸濁液を滴下接種す る方法 を行 ったが､病徴

15 10

5

接種後の日数 (日) が現 れなか ったため､滅菌針 で葉面上 を脇 つけ､

図

2.

針接種 によるクズ葉 での病斑部の広が り.

細菌懸濁液を接種す ることとした｡ すなわち､接

A

は増董温度20℃

､B

は培養温度25℃､C 種針 を

1

本

､5

本および10本 と本数 を変 え､街を は培養温度30℃を示 す｡ また､接種針

1

( ●)

､接種針

5

本

本 (▲)お よび接種針

つけた後､細菌液の接種 を試みた ところ病斑 の広 が りに顕著な差異が観察 された｡また､20℃では､

針の本数 が多 くなるほ ど､病徴の直径 も大 き くな ったが､25℃､30℃では針 の本数 と病斑 の直径 に相関関係はなかった｡ 次に分離細菌の発病堤通

10後瓜

本 (■) を用 いて クズ葉 に傷 をつ けた 細菌液 を接種 し､経時的 に斑点病斑の が日ソ を 戟 秦 した

温度を検討す るために､ クズ薬面上 に針接種 を行

4.

生育段階の異なるクズ葉を用いた接種検定 った後､20℃､25℃お よび30℃の温度条件下 で 生育段階の異な るクズの若 い葉 と成長 した葉 を 34

植物病原性知 歯を )●lJいた クズの生物防除 35

用いて針接種を行 った｡その結果､若 い薬の方が 顕著な病徴を示 し､痕終的に落葉 に至 った｡ この ことか ら､若い葵への接種のフナが クズの防除には 効果的であ ると考 え られた｡ 次にカーボ ランダム を用いた噴謀接種 を行 った (図

3A)

O その結果 ､ クズ茎 では変化は見 られなか ったが､ クズ薬では 壌脈 が褐変化 し (3B､3 C)､菓面上 に浮 き上が っ た (3D)｡ また､ クズ典の下部 に注射針 を用 い､

細菌掛 萄液 を注入 した｡その結果､ クズ茎の上部 に行 くほ ど病徴が激 し くな り (図4A)､接健後 4 日目には蕗輩す るまでに至 った

( 4B､4C､4 D)

｡ また､主葉脈 か ら側葉脈に病徴が広が ってい くこ とも観察で きた｡一方､下部では､斐面上 に褐 色 した病班 がで きた後､その間辺に黄化が観察 され た｡ また､茎 で も褐変化が観察 され､ もろ くな っ た｡ 次に､ クズ茎 を ユ時間細菌懸濁液に没放 した 後､病徴の変化 を観察 した ところ､薬 と茎 で褐色 がみ られ､楼種 後 4日Rには茎 が折 れ曲が った｡

薬 への接種 よ りも病徴か顕著 に現 れた こ とか ら､

茎へ直接 ､細菌懸濁練を注入で きれば､有効であ る と考 え られた｡

5.1 6

Sリボ ゾーム

DNA

領域の解析

分離細 歯

MPL‑ 04

の

1 6

Sリポ ゾーム

DNA

領域 の解析 を 行 ったo その結果

､S t e no

tr

o pho mo nas

図

3

. 噴霧接種 によるクズ葉 および茎 での病徴

mat♪ ii lohla ( nhmoa Xa to n smatpula) loi'i･

と

(A).葉では褐変化 (BとC)が観察 され､ 99.3%の相同性が確認 された｡ これは､細菌学的 葉脈が葉面上 に浮 き上 が った (Dの矢印)0

噴霧接種後

5

日目の写真｡ 諸性質に よって同定 された細菌 と一致 した｡

図 4. クズ茎への細菌注入接種 による病徴 (A) . クズ茎の下部 か ら注射針 を用 い､細菌液 を注入 したo クズ茎 の上部 で病徴 が激 しく､接種後 4日目に落 葉 した｡また､クズ葉は主脈か ら側脈にそ って病徴 が広が った ( B

､C､D )

0

36 TT,村 q. 林･L .g触 ･ 英世絵 ･泉

6.

分離細菌の宿主範囲検定

分離細菌の宿主範朋 を検定す るため､ クズ と同 じて メf:ト植物に尻す る インゲン､エン ドウ

お

よび レンゲに棲位を試みたO その結果､いずれの分離 細菌 をて ノf:トに針接健 して も病徴は観察 されなか った｡ 今後､ さらに､他のマ メ科植物 への接種 を 行い､生物防除幣材 としての有効性 を検討 してい

く予定であ る｡

7.

野外で繁茂するクズへの分離細菌の接種 a)単独接種

得 られた らつの分離細菌 とか さ枯病菌 を用 い､

3髄頬の方法を用いて 単独楼鹿 を試みた｡ その結 果､針接穂 とチ ･,プ楼唖では､棲唖後/

1､2

EE]l に茎部接種部位で壊死が観察 され､脱脂綿接雌 で は､接種後､茎部先端模様 部位 で褐変化が観察さ

れた｡さ らに､気温の高い夏期に針接種 した場 合､

植物体の枯死や蕗繋が観察 され､発病率の高い傾 向にあ った｡

b)混合接種

うつの分離細菌 とか さ枯病菌を用い､ 2種類o) 分離細菌 を混 合 した後､ クズ茎に針接種 した｡ そ の結果､ どの組 み合わせにおいて も､発病率 に孤 老 な差昇は観察 されず､単独接 純での発病率 と比 較 して同程度であ った｡

以上の結果か ら､筆者 ら0)基礎的研究では､分 離細菌 を使用 し､ クズ基 に直接接種 した後､ クズ を完全に枯死 させ ることに成功 した｡ この結果を 基に クズの防除簾 として､簡便かつ迅速 に分離細 菌 を接種で きれば､旺盛 に繁殖増殖す るクズの個 体群密度 を効果的 に減少させ るこ とがで きる と考 え られる｡ また､本細菌の実用化のためには､同 時 に､苛性の強化､選択磁性 の検討､安定性 およ び経済性な ど多 くの ことを考慮す る必要 がある｡

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