ミルクフルーツ（熱帯果樹）種子における生理活性効果

(1)

4 7

ミルクフルーツ（熱帯果樹）種子における生理活性効果

平成2 8 年3 月1 7 日

純真学園大学保健医療学部検査科学科准教授

原著

ミルクフルーツ（熱帯果樹）種子における生理活性効果

天川雅夫

¹ ^）

・秋山秀彦

²^）

・日下雅友

¹^）

・一原直人

¹^）

・Tr y Pr o s

³^）

・加藤亮二

¹^）

Ph y s i o l o g i c a l A c t i v i t y f r o m Ch r y s o p h y l l u m Ca i n i t o L i n n e （St a r A p p l e ） Se e d s

M a s a o A M A K A W A

¹^），H i d e h i k o A K I Y A M A ²^），M a s a t o m o K U SA K A ¹^），

N a o t o I CH I H A R A

¹^），Tr y Pr o s ³^），R y o j i K A TO ¹^）

1 ）純真学園大学保健医療学部検査科学科，2 ）藤田保健衛生大学医療科学部臨床検査学科 3 ）プノンペン市保健局救急部（カンボジア）

1

）D e p a r t m e n t o f M e d i c a l L a b o r a t o r y Sc i e n c e s , J u n s h i n G a k u e n U n i v e r s i t y

2

）D e p a r t m e n t o f M e d i c a l Te c h n o l o g y , Fu j i t a H e a l t h U n i v e r s i t y Sc h o o l o f H e a l t h Sc i e n c e s

3

）D e p a r t m e n t o f Em e r g e n c y M e d i c i n e , Ph n o m Pe n h M u n i c i p a l H e a l t h D e p a r t m e n t .

純真学園大学雑誌第5 号平成2 8 年3 月

J o u r n a l o f J u n s h i n G a k u e n U n i v e r s i t y , Fa c u l t y o f H e a l t h Sc i e n c e s V o l . 5 , M a r c h 2 0 1 6

要旨

:

植物種子には血液型特異的凝集素の含有をはじめ，リンパ球分裂促進作用，抗酸化作用，抗腫瘍作用等，多様な生理活性を有することが知られている．今回，これらの種子の中で，熱帯果樹のひとつであるミルクフルーツ種子に高度な細胞溶解作用を有することを見出し，その細胞溶解の生理作用を明らかにする目的で研究を行った．検討内容は種子が持つ抗酸化力及び細胞溶解能で，抗酸化力の測定は従来から測定されてきた

D PPH

法，細胞溶解能は白血球癌細胞株である

H L 6 0

細胞と健常者の単核球（対照）を用いて

M TT

試験による

細胞生存率について測定し，更に細胞の形態変化についてもパッペンハイム染色を用いて検討した．抗酸化力測定ではミルクフルーツ種子の種皮に高い抗酸化力を認め，胚乳にはその能力は認めなかった．一方，細胞溶解能についてはミルクフルーツの胚乳に

H L 6 0

細胞の増殖の抑制を認め，種皮には認めなかった．H L 6 0 細胞の形態変化についてはクロマチンの凝縮，細胞の縮小化や核の断片化を認めたが，対照の健常者単核球には明らかな変化を認めなかった

.

以上の結果からミルクフルーツ種子の種皮には抗酸化作用を認め，一方，H L 6 0 細胞の増殖抑制には胚乳が関与していた．この細胞増殖の抑制は細胞数の減少であり，そのメカニズムはアポトーシスあるいはネクローシスのいずれかが考えられる

.

キーワード

:

ミルクフルーツ，種子，抗酸化力，D PPH ラジカル消去活性測定法，細胞生存率測定

A b s t r a c t :

It is well- nown that plant seeds have several functions includin ph siolo ical activit blood t pe speciﬁc

h e m a g g l u t i n a t i o n ; l y m p h o c y t e m i t o g e n ; a n t i - o x i d a n t ; a n t i - t u m o r ; a g i n g i n h i b i t o r a n d r e g u l a t o r s f o r d i a b e t e s .

I n t h i s s t u d y , t o c l a r i f y t h e p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e Ch r y s o p h y l l u m Ca i n i t o L i n n e （St a r A p p l e ）

w h i c h i s a f r u i t t h a t h a s s t r o n g c y t o l y s i s f u n c t i o n s .

St a r A p p l e e x t r a c t w a s c o n s i d e r e d b e c a u s e o f i tʼs h i g h a n t i - o x i d a n t a b i l i t y a n d c y t o l y s i s f u n c t i o n s . Th e D PPH m e t h o d

w a s u s e d i n m e a s u r i n g i t

ʼs a n t i - o x i d a n t a b i l i t y a n d M TT a s s a y w a s u s e d f o r t h e g e n e r a l v i a b i l i t y o f H L 6 0 .

Th i s w a s d e r i v e d f r o m a c u t e p r o m y e l o c y t e l e u k e m i a c e l l s a n d n o r m a l m o n o n u c l e o s i s t a k e n f r o m a h e a l t h y p e r s o n .

M o r e o v e r , H L 6 0 a n d m o n o n u c l e o s i s w e r e o b s e r v e d i n c l u d i n g t h e m o l p h o l o g i c a l c h a n g e i n St a r A p p l e s e e d e x t r a c t u s i n g Pa p p e n h e i m s t a i n i n g .

A s a r e s u l t , a t h i n c o a t o f St a r A p p l e s e e d s h o w e d i tʼs a n t i - o x i d a n t a b i l i t i e s b u t w e d i d n ʼt o b s e r v e a n y c h a n g e i n c e l l

n u m b e r s . Fu r t h e r m o r e , a m o l p h o l o g i c a l c h a n g e i n H L 6 0 w i t h t h e a d d i t i o n o f St a r A p p l e s e e d e n d o s p e r m w a s o b s e r v e d .

Th e a g g r e g a t i o n o f c h r o m a t i n a n d r e d u c t i o n o f t h e c e l l w h i c h i n c l u d e d a f r a g m e n t e d c e l l n u c l e a r . Th e e n d o s p e r m o f t h e

St a r A p p l e s e e d s h o w e d a r e d u c t i o n o f t h e a m o u n t o f c e l l s a n d m o l p h o l o g i c a l c h a n g e o f t h e c e l l s h a p e i n t h e H L 6 0 c e l l l i n e .

W e c a n c o n f e r t h a t d u e t o t h e m e c h a n i s m i n c e l l n u m b e r r e d u c t i o n u s i n g t h e St a r A p p l e s e e d e n d o s p e r m a p o p t o s i s o r

n e c r o s i s c a n b e i n d u c e d .

K e y w o r d :

Ch r y s o p h y l l u m Ca i n i t o L i n n e , Se e d , A n t i - o x i d a n t a b i l i t y , 1 , 1 - d i p h e n y l - 2 - p i c r y l h y d r a z y l f r e e - r a d i c a l

s c a v e n g i n g a c t i v i t y , M TT A s s a y

(2)

4 8

天川雅夫・秋山秀彦・日下雅友・一原直人・Tr y Pr o s・加藤亮二

1 はじめに

植物種子にはリンパ球分裂促進作用，抗酸化作用，抗腫瘍作用等，多様な生理活性を有することが知られている．例えば血液型特異的赤血球凝集作用を有する植物種子にはゴーヤ種子やリリマメ

1 - 3），リンパ球分裂促進作用ではレンズマメ，ア

カインゲンマメおよびエンドウマメ^{4 - 5}^），細胞凝集作用はダイズ，ソラマメおよびピーナッツ⁶^），フラボノイド由来成分による老化抑制作用はイチゴ種子⁷^）に有することが報告されている．近年，

このような多様な生理活性を有する植物種子を用いた研究が行われるようになり，高知大学では産学官連携による共同研究で地元の特産品の一つである枇杷種子から加工・抽出して得た抗酸化力の

高い

N -

アセチル

L -

システイン（N A C）を，美容・

ダイエット食品や飲料へ応用⁸^）などがある．また，

著者らも1 2 4 種の植物種子［果実類3 5 品種，野菜類8 2 品種（根菜類1 4 品種，葉菜類2 6 品種，果菜類

4 2

品種），穀類2 品種，香辛料類1 品種および種実類4 品種］を用いて種子中の抗酸化力測定を行った結果，柿の種子に高い抗酸化力を有していることを見出し，この抗酸化物質が含まれる柿種子抽出液を糖尿病病態マウスに3 ヶ月間経口投与した結果，血糖値の増加抑制を確認できた．更に，前述した1 2 4 品種の植物種子について細胞溶解能を調べたところ，Ch r y s o p h y l l u m Ca i n i t o L i n n e の種子に高度な細胞溶解能があることを見出した．

Ch r y s o p h y l l u m Ca i n i t o L i n n e はアカテツ科の常緑樹（図1 ）で，東南アジアなどの熱帯地域に生

育しているが，この果実はゼリー状で白色の乳液を含んでいることから，カンボジアではミルクフルーツと呼ばれている．また，この果実を横に輪切りにすると星形の模様が浮き出ることから，英名ではスターアップルとも呼ばれている．カンボジアでは，このミルクフルーツの葉や樹皮は生薬として利用されているが，種子に含まれている成分の生理作用などは不明である．今回，このミルクフルーツ種子の生理作用を明らかにするため，

抗酸化力および細胞溶解能について検討したので報告する．

2 よ方法

1

）材料

ミルクフルーツ種子はカンボジアのカンダール州産（図1 ）の種子約1 k g を空輸で検疫後に入手した．

細胞溶解能に使用した

A

および

B

型の血球はアファーマジェン（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社），O 型血球は健常者の血液を用いた．また，細胞生存率の測定および細胞の形態学的変化は，急性前骨髄球性白血病細胞株で

ある

H L 6 0

細胞を用い，その対照としては健常者

の単核球を用いて検討した．

2

）方法

2

）1 ミルクフルーツ種子抽出液の作製

ミルクフルーツ種子の抽出液は，以下の方法で作製した．まず，種子を図2 に示すように種皮と

図1　 とルクルー C h r ys o p h yl l u m C ainit o L inne（St ar A p p l e）

1.

はに

物子にはリン分用

,

化用

,

用

,

理性をると

れている

.

型集

用をる物子にはー子リリマメ

1-3)

,

リン分用ではレンマメ

,

アインンマメよエンマメ ^4-5)

,

集

用はダイ

,

ソラマメよピーッ ⁶⁾

,

フライ分による化用はイチ

子 ⁷⁾にるとされている

.

近年

,

のよ理性をる物子を用いた行れるよにり

,

学では学による同でののである子工出してた化のい

N-

アチル

L-

スイン

(NAC)

を

,

ダイエット用 ⁸⁾ ある

.

た

,

124

の物子

[

果

35 ,

82 ( 14 , 26 ,

果

42 ), 2 , 1

よ

4 ]

を用いて子中の化測定を行

った結果

,

の子にい化をしているとを出し

,

の化物質れる子出をマスに

3

月間した結果

,

のをでた

.

に

,

した

124

の物子にいて解能をたとろ

, Chrysophyllum Cainito Linne

の子に解能あるとを出し

た

.

Chrysophyllum Cainito Linne

はア科の樹

(

図

1)

で

,

東アジアのにしている

,

の果はリーでのをでいると

,

ンジアではルクフルーとれている

.

た

,

の果をに

りにるとの出ると

,

ではスターアップルとれている

.

ンジアでは

,

のルクフルーの樹はとして用されている

,

子にれている分の理用はである

. ,

のルクフルー子の理用をにるた

,

化よ解能にいて検したので

る

.

2.

材よ方法

1)

材

ルクフルー子

(

図

1)

はンジアのンダールの子

1kg

をで検にした

.

解能に使用した

A

よ

B

型のはアファーマジン

(

オーソクリルダイアスィックス社

), O

型はのを用いた

.

た

,

率の測定よの学化は

,

性性株である

HL60

を用い

,

の対としてはの

を用いて検した

. 3

07-p47-53-amakawa.indd 48 2016/06/20 8:40:17

(3)

4 9

胚乳に分け，それぞれ1 g に対して1 0 m L の生理食塩液（生食）を加え，乳鉢で磨り潰して抽出し，

1 0 , 0 0 0 r p m 4

℃ 3 0 分間遠心した．遠心後の上清を

回収し，紫外吸収法（2 8 0 n m ）よりタンパク濃度を求めた．

2

）2 ミルクフルーツ種子抽出液の抗酸化力測定抗酸化力測定法として，従来から利用されている

D PPH

法（1 , 1 - d i p h e n y l - 2 - p i c r y l h y d r a z y l f r e e -

r a d i c a l s c a v e n g i n g a c t i v i t y

）を用いて測定した．

測定方法は，ミルクフルーツの種子，種皮および胚乳に分け，それぞれ5 0 0 μ

g / m L

となるように濃度調整した．サンプルを各々5 0 μ

L

に 0 . 1 m M

D PPH

溶液（同仁化学）および0 . 0 5 M トリス塩酸

緩衝液（p H 7 . 4 ）を1 m L ずつ混和させ，室温で3 0 分間反応後，5 1 7 n m で吸光度を測定した．また，

陽性対照は抗酸化力が高いことで知られているプロポリスを用いた．抗酸化力は試料吸光度値をブランク吸光度値で除した

D PPH

残存率（% ）として示した．

D PPH 残存率（％）＝

（試料吸光度値／ブランク吸光度値）×1 0 0

2

）3 ミルクフルーツ種子抽出液の細胞溶解能

ⅰ）細胞溶解能

細胞は

A

，Bおよび

O

型の血球を用い，それぞれの血球を生食にて洗浄後，2 % 血球浮遊液を作製した．ミルクフルーツの抽出液（原液

: 1 0 m g / m l

）を生食で1 , 0 2 4 倍まで2 倍連続希釈し，各々5 0 μ

L

と前述した2 % 血球浮遊液5 0 μ

L

ずつ等量混和後，すぐに3 , 4 0 0 r p m ，1 5 秒間遠心後，判定した．

また，血球溶解の対照として0 〜3 % の塩化ナトリウムの濃度勾配を作成し血球の浸透圧による溶解を調べたところ，0 . 3 % 以下の塩化ナトリウム

低張液で細胞溶解を呈することを確認した．

ⅱ）細胞増殖度に対する影響について

ミルクフルーツ胚乳抽出液添加による細胞増殖への影響の検討に

M TT Ce l l Pr o l i f e r a t i o n A s s a y K i t

（Ca y m a n 社）を用いた．その測定原理は細胞内に取り込まれた

M TT（3 -

［4 , 5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 -

y l

］

- 2 , 5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d

）は，ミトコンドリアの還元酵素により，テトラゾリウム塩がホルマザンに還元されて青色の色素を呈する．この色素量は代謝活性のある細胞数と相関するため，

死細胞では色素は産生されない．

まず，細胞へ胚乳抽出液（1 0 μ

g / m L

）を添加したものと，サンプル対照として

PBS

を添加した2 群で比較した．健常者単核球（1 ×1 0 ⁶

/ m L

）および急性前骨髄球性白血病細胞株である

H L 6 0

細胞

（1 ×1 0 ⁶

/ m L

）をそれぞれ9 6 穴培養プレート

（FA L CO N 社）に1 0 0 μ

L

播種し抽出液を添加後，

3 7

℃，5 % CO 2インキュベータにて2 4 時間反応させた．反応後，M TT試薬1 0 μ

L

を添加し混和後，

3 7

℃，5 % CO 2インキュベータにて3 時間反応後，

上清8 5 μ

L

を除き，キットに含まれる溶解液1 0 0 μ

L

を添加して混和後，細胞に取り込まれた色素を溶解してマイクロプレートリーダー（Bi o - R a d

Be n c h m a r k

社）で5 5 0 n m にて吸光度測定した．対

照には健常者単核球を用いた．

2

）4 ミルクフルーツ胚乳抽出液による

H L 6 0

細胞の形態学的変化

H L 6 0 細胞（1 ×1 0 ^{6 /}

m L

）にミルクフルーツ胚乳抽出液を1 0 μ

g / m L

添加後，

3 7

℃，

5 % CO

2インキュベータにて2 4 時間反応後，H L 6 0 細胞を浮遊させ回収し，1 , 0 0 0 r p m ，5 分間遠心した．遠心後の沈渣を用いて細胞塗抹標本を作製し，パッペンハイム染色を行った．

パッペンハイム染色はメイ・グリュンワルド液で3 分間固定後，その上に同量の1 / 1 5 0 M リン酸緩衝液（p H 6 . 4 ）を加え3 分間染色し，水洗後，ギムザ染色液（ギムザ原液1 滴

/

リン酸緩衝液1 m L ）に浸し1 0 分間染色した．染色後，流水水洗し，ドライヤーで乾燥後，2 0 0 倍で鏡検した．また，対照として健常者単核球を用いて，ミルクフルーツ胚乳抽出液添加による細胞の形態変化を同様のパッペンハイム染色で調べた．

図2　ルクルー 子

2)

方法

2)-1

ルクフルー子出の製

ルクフルー子の出は

,

の方法で製した

. ,

子を図

2

によにと

に分

,

れれ

1g

に対して

10mL

の

を

,

でりして出し

, 10,000rpm

4 30

分間心した

.

心のをし

,

法

(280nm)

よりタンクをた

.

2)-2

ルクフルー子出の化測定

化測定法として

,

用されている

DPPH

法

(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free-radical scavenging activity )

を用いて測定した

.

測定方法は

,

ルクフルーの子

,

よに分

,

れれ

500

μ

g/mL

とるよにした

.

サンプルを

50

μ

L

に

0.1mM DPPH (

同化学

)

よ

0.05M

ト

リス

(pH7.4)

を

1mL

さ

,

で

30

分間

, 517nm

でを測定した

.

た

,

性対は化いとでれているプロリスを用いた

.

化は

をランクでした

DPPH

率

(%)

としてした

.

DPPH

率（％）

（ランク）

100 2)-3

ルクフルー子出の解能

i )

解能

は

A, B

よ

O

型のを用い

,

れれのを理にて

, 2%

を製した

.

ルクフルーの出

( :10mg/ml)

をで

1,024

で

2

し

, 50

μ

L

とした

2% 50

μ

L ,

に

3,400rpm , 15

秒間心

,

定した

.

た

,

解の対として

0 3%

の化トリムのをしのによる解をたとろ

, 0.3%

の化トリムで解をるとをした

.

ii )

に対るにいて

ルクフルー出による

のの検に

MTT Cell Proliferation Assay Kit (Cayman

社

)

を用いた

.

の測定理は

にりれた

MTT

（

3-[4,5-

dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium

bromid

）は

,

トンリアのにより

,

トラリムルマンにされてのをる

.

のは性のある

数とるたでははされい

.

,

出

(10

μ

g/mL)

をした

のと

,

サンプル対として

PBS

をした

2

でした

. (1 10

⁶

/mL)

よ

性性株である

HL60 (1 10

⁶

/mL)

をれれ

96

プレート

(FALCON

社

)

に

100

μ

L

し出を

,

37 , 5%CO

2インータにて

24

時間さ

た

. , MTT 10

μ

L

をし

,

37 , 5%CO

2インータにて

3

時間

,

85

μ

L

を

,

ットにれる解

100

μ

L

をして

,

にりれたを解してマイクロプレートリーダー

(Bio-Rad Benchmark

社

)

で

550nm

にて測定した

.

対にはを用いた

.

2)-4

HL60

の学化

HL60 (1 10

⁶

/mL)

にルクフルー出を

10

μ

g/mL , 37 , 5%CO

2イン

ータにて

24

時間

, HL60

をさ

し

, 1,000rpm, 5

分間心した

.

心のを用いて標本を製し

,

ッペンイムを行った

.

4

(4)

5 0

3 結果

3

）1 ミルクフルーツ種子抽出液の抗酸化力測定ミルクフルーツ種子を種皮と胚乳に分けて抗酸化力測定（n = 5 ）を行った結果，図3 に示すように種皮抽出液は種子（全体）および胚乳と比べ，

その

D PPH

残存率は4 4 . 7 ±1 . 2 9 % と低く，抗酸化

力は顕著に高いことが確認できた．また，陽性対照のプロポリス（6 5 . 0 % ）と比べても抗酸化力が高い結果であった．一方，種子（全体）では

D PPH

残存率は9 8 . 6 ±0 . 6 9 % ，胚乳は9 5 . 3 ±1 . 5 3 %

と抗酸化力は認められなかった．

3

）2 ミルクフルーツ種子抽出液の細胞溶解作用

ⅰ）細胞溶解能

ミルクフルーツ胚乳抽出液では

A

，Bおよび

O

型血球のすべての血球において，1 : 1 2 8 と最も高い溶解を認めた（図4 ）．種子全体では1 : 6 4 ，種皮は細胞溶解を認めなかったことから，胚乳中に細胞溶解を起こす成分が含有している可能性が示唆された（表1 ）．

3)-3.

HL60

の学化

HL60

を用いてルクフルー子によるの化にいて検した

.

の結果

,

出をした

HL60

では

(

クロマチン

)

の

,

の化よの化

数れ

,

にれた

(

図

6 ).

方

,

対として用いた

の化はれった

(

ータはさ

).

4.

物は中の線放射線のによりされる性によって化ストレスをている

.

のよでるたに

,

物よ子には性を化

る化物質ラジルをる物質をるとれている

,

の化物質ののにはリフール

,

フライ

,

ンサンれる

.

リ

フールはの物にされ

,

によって出る物のの分で

,

に

化を化用をるとれている ⁹⁾

.

日でる機会のいフラ

イはリフールので

,

し体にされい

.

方

,

にれる

ンは化用をは

,

用 ¹⁰⁾

,

用^11-12)

,

中レスロール用

13-15)

,

用 ^16-17)

,

化用 ¹⁸⁾

,

アレルギー用 ^19-21) 理性をる

.

た

,

果子にいてークーサーに

れるフライのであるレチン化用をは

,

用用をし

,

の子にれる子化用をるとれている

.

のよに物

の子理性をとにさ

れるで

,

はの物子を検してた

.

でルクフルー子解をるとにし

,

の理性をにるで化よ解能にいて検した

.

6

図　 用たルクルー 出の

3)-3.

HL60

の学化

HL60

.

の結果

,

出をした

HL60

では

(

クロマチン

)

の

,

の化よの化

数れ

,

にれた

(

図

6 ).

方

,

の化はれった

(

ータはさ

).

4. .

のよでるたに

,

フライ

,

ンサンれる

.

リ

,

に

.

,

し体にされい

.

方

,

にれる

ンは化用をは

,

用 ¹⁰⁾

,

用^11-12)

,

13-15)

,

用 ^16-17)

,

化用 ¹⁸⁾

,

.

た

,

用用をし

,

.

のよに物

れるで

,

.

,

.

6

表1　ルクルー 子の部 による 図3　ルクルー 子部 による

D PPH ラジカル（紫色）に抗酸化物質を含む抽出液を加えると，D PPH ラジ

カルが消去され色が薄くなる．この色調を吸光度測定し抗酸化力を測定する．

種皮に吸光度の減少が認められた．

ッペンイムはメイリンルで

3

分間定

,

のに同の

1/150M

リン

(pH6.4)

を

3

分間し

, ,

ギム

(

ギム

1 /

リン

1mL)

に

し

10

分間した

. ,

し

,

ライ

ーで

, 200

で検した

.

た

,

対とし

てを用いて

,

ルクフルー

出によるの化を同のッペンイムでた

.

3

結果

3)-1.

ルクフルー子出の化測定

ルクフルー子をとに分て

化測定

(n=5)

を行った結果

,

図

3

によに

出は子

(

体

)

よと

,

の

DPPH

率は

44.7 ± 1.29%

と

,

化は

にいとでた

.

た

,

性対の

プロリス

(65.0%)

とて化い結

果であった

.

方

,

子

(

体

)

では

DPPH

率は

98.6 ± 0.69%,

は

95.3 ± 1.53%

と化はれった

.

3)-2.

ルクフルー子出の解用

i )

解能

ルクフルー出では

A, B

よ

O

型のてのにいて

, 1:128

と

い解をた

(

図

4).

子体では

1:64,

は

解をったと

,

中に解を分している能性された

( 1).

ii )

に対る

ルクフルー子の分にいて解能れたと

,

出

のにいて

MTT

でた

. MTT

でにいて

,

対の

PBS

では

O.D.550nm

の

0.401 ± 0.012

に対して

,

ルク

フルー出では

0.340 ± 0.013

であ

った

. HL60

にいては

,

対の

PBS

O.D.550nm

のは

1.367 ± 0.015

に対して

,

ル

クフルー出では

0.336 ± 0.031

で

あった

.

って

,

出

24

時間の率は

HL60

にいては

8.57 ± 3.92%,

では

62.0 ± 5.11%

であった

(

図

5).

5

07-p47-53-amakawa.indd 50 2016/06/20 8:40:19

(5)

5 1

ⅱ）細胞増殖度に対する影響

ミルクフルーツ種子の胚乳部分において細胞溶解能が認められたことから，胚乳抽出液が細胞増殖への影響について

M TT

試験で調べた．M TT 試験で健常者単核球において，対照の

PBS

添加で

は

O . D . 5 5 0 n m

の0 . 4 0 1 ±0 . 0 1 2 に対して，ミルクフ

ルーツ胚乳抽出液添加では0 . 3 4 0 ±0 . 0 1 3 であった．

H L 6 0

細胞においては，対照の

PBS

添加

O . D . 5 5 0 n m

の値は1 . 3 6 7 ±0 . 0 1 5 に対して，ミルクフルーツ胚乳抽出液添加では0 . 3 3 6 ±0 . 0 3 1 であった．従って，

胚乳抽出液添加2 4 時間後の細胞生存率は

H L 6 0

細胞においては8 . 5 7 ±3 . 9 2 % ，健常者単核球では

6 2 . 0

±5 . 1 1 % であった（図5 ）．

3

）3 ミルクフルーツ胚乳抽出液による

H L 6 0

細胞の形態学的変化

H L 6 0 細胞を用いてミルクフルーツ種子添加による細胞の形態変化について検討した．その結果，

胚乳抽出液を添加した

H L 6 0

細胞では核（クロマチン）の凝縮，細胞の縮小化および核の断片化が多数認められ，形態的な異常が顕著に認められた

（図6 矢印）．一方，対照として用いた健常者単核球の形態変化は認められなかった（データは示さず）．

考察

植物は大気中の酸素から紫外線や放射線などの影響により産生される活性酸素によって酸化的ストレスを受けている．このような環境下で生育するために，植物および種子には活性酸素を無毒化する強力な抗酸化物質やラジカルを消去する物質を有することが知られているが，その抗酸化物質の代表的なものにはポリフェノール，フラボノイド，カテキンやサポニンなどが挙げられる．ポリフェノールは多くの植物に含有され，光合成によって出来る植物の色素や苦味の成分で，主に動脈硬化や脳梗塞を防ぐ抗酸化作用を有すると言われている⁹^）．日常生活で摂取する機会の多いフラボノイドはポリフェノールの一種で，僅かしか体内に吸収されない．一方，緑茶などに含まれるカテキンは抗酸化作用をはじめ，抗腫瘍作用^{1 0}^），血圧上昇抑制作用^{1 1 - 1 2}^），血中コレステロール調節作

用^{1 3 - 1 5}^），血糖値調節作用^{1 6 - 1 7}^），老化抑制作用^{1 8}^），

抗アレルギー作用^{1 9 - 2 1}^）など多様な生理活性を有す

,

ルクフルー子にる化測

定にいては

,

用されている測定法で

ある

DPPH

法を用いた

. DPPH

法は本

,

定ラジルを用い

,

定

DPPH

ラジルとい工にれたラジルの能を測定によりる方法である

. DPPH

ラジルを

にとにる

,

のに

化物質を出をると

, DPPH

ラジル

される

.

のを測定し化を測定る

.

の

DPPH

法によるルクフルーの化測定を行った結果

,

ルクフルーにいて化いと分った

.

の準は

,

化のいとれているプロリスより

1.45

いと

でた

.

に子にはリフールをでり

,

であるとい

.

のた

,

用を物には化のいとれている

,

の行でのにいて化れ

,

の

化物質はリフールのの子であるとをした ²²⁾

.

しし

,

のルクフルーにる化物質の同定は行っていい

, , HPLC-MS

を用いたルクフルー

にる化物質の同定はである

.

次に

,

ルクフルーのの理性用

,

の解にいて

HL60

を用いた

MTT

による率の測定よ

の化にいて検した

.

方法はト性性株

HL60

とを用いてルクフルー

出をして

24

時間に測定した結果

,

HL60

の率は

24.6%

と数の

たのに対し

,

はのよ化はれったと

, HL60

にルクフルー出

数のをしたとれる. の

にいてはのによ

る数のの

2

のとれる

.

れのとを検るたにの化にいてッペンイムを用いて検した結果

,

と同にではの導されたのはれったのに対し

て

, HL60

ではアトースでるの

,

クロマチンの

,

の化れた

.

た

,

ネクロースでるの化

,

の

,

化を数

,

ににれた

.

のとは

HL60

にいてはのされているのでは

,

アトースあるいはネクロースの

3)-3.

HL60

の学化

HL60

.

の結果

,

出をした

HL60

では

(

クロマチン

)

の

,

の化よの化

数れ

,

にれた

(

図

6 ).

方

,

の化はれった

(

ータはさ

).

4. .

のよでるたに

,

フライ

,

ンサンれる

.

リ

,

に

.

,

し体にされい

.

方

,

にれる

ンは化用をは

,

用 ¹⁰⁾

,

用^11-12)

,

13-15)

,

用 ^16-17)

,

化用 ¹⁸⁾

,

.

た

,

用用をし

,

.

のよに物

れるで

,

.

,

.

6

図5　出 2 の

図　出 2 の 0 の

07-p47-53-amakawa.indd 51 2016/06/20 8:40:19

(6)

5 2

る．また，果実種子においてもシークヮーサーに含まれるフラボノイド類の一種であるノビレチンが抗酸化作用をはじめ，抗腫瘍作用や抗認知作用を有し，柿の種子に含まれる没食子酸が抗酸化作用を有することが知られている．このように植物の種子が様々な生理活性を持つことが明らかにされるなかで，我々は多くの植物種子を検討してきた．そこでミルクフルーツ種子が高度な細胞溶解をすることに着目し，その生理活性を明らかにする目的で抗酸化力および細胞溶解能について検討した．

まず，ミルクフルーツ種子における抗酸化力測定においては，従来から利用されている測定法で

ある

D PPH

法を用いた．D PPH 法は本来，不安定

なラジカルを用いず，安定的な

D PPH

ラジカルという人工的に作られたラジカルの消去能を吸光度測定により求める方法である．D PPH ラジカルを溶媒に溶かすと紫色に呈するが，この溶液に抗酸化物質を含む抽出液を加えると，D PPH ラジカルが消去され色が薄くなる．この色調を吸光度測定し抗酸化力を測定する．この

D PPH

法によるミルクフルーツの抗酸化力測定を行った結果，ミルクフルーツ種皮において抗酸化力が高いことが分かった．この水準は，抗酸化力の高いことが知られているプロポリスよりも約1 . 4 5 倍高いことが確認できた．一般的に種子にはポリフェノールなどを含んでおり，有色であることが多い．そのため，食用色素を持つ野菜や植物には抗酸化力の高いことが多く知られているが，著者らの先行研究で柿の種皮においても抗酸化力が高く認められ，

その抗酸化物質はポリフェノールの一種の没食子酸であることを確認した^{2 2}^）．しかし，今回のミルクフルーツにおける抗酸化物質の同定は行っていないが，今後，H PL C- M Sなどを用いたミルクフルーツ種皮に存在する抗酸化物質の同定は必須である．

次に，ミルクフルーツの別の生理活性作用，すなわち細胞の溶解について

H L 6 0

細胞を用いた

M TT

試験による細胞生存率の測定および細胞形

態の変化について検討した．

方法はヒト急性前骨髄球性白血病細胞株

H L 6 0

細胞と健常者単核球を用いてミルクフルーツ胚乳抽出液を添加して2 4 時間後に測定した結果，

H L 6 0

細胞の生存率は2 4 . 6 % と顕著な細胞数の減

少が認めたのに対し，健常者単核球はこのような明らかな変化は認められなかったことから，

H L 6 0

細胞特異的にミルクフルーツ胚乳抽出液が

細胞数の減少を引き起こしたと考えられる．この現象については①細胞増殖への抑制②細胞死による細胞数の減少の2 つのことが考えられる．これらのことを検討するために細胞の形態変化についてパッペンハイム染色を用いて検討した結果，前述と同様に健常者単核球では細胞死の誘導された単核球の顕著な増加は認められなかったのに対して，H L 6 0 細胞ではアポトーシスで起こる細胞の縮小，クロマチンの凝縮，核の断片化が認められた．また，ネクローシスで起こる細胞の膨化，核の喪失，縮小化や空胞形成を多数認め，細胞形態にも異常が顕著に認められた．このことは

H L 6 0

細胞においては細胞の増殖が抑制されているのではなく，アポトーシスあるいはネクローシスの細胞の破壊による細胞数の減少と考えられた．

5 結

熱帯果樹であるミルクフルーツ種子は抗酸化力と細胞溶解作用を認め，特に胚乳抽出液は，白血病細胞株である

H L 6 0

細胞に対して，核の断片化や細胞の縮小化を引き起こし，細胞数の減少を認めた．その作用はアポトーシスあるいはネクローシスのいずれかが考えられた．

文献

1

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1 0

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Su z u k i Y , M i y o s h i N , I s e m u r a M . H e a l t h - p r o m o t i n g e f f e c t s o f g r e e n t e a . Pr o c . J p n . A c a d , 8 8 , 8 8 - 1 0 0 , 2 0 1 2 . 1 1

）

N e g i s h i H , X u J W , I k e d a K , N j e l e k e l a M , N a r a Y , Y a m o r i

Y . Bl a c k a n d g r e e n t e a p o l y p h e n o l s a t t e n u a t e b l o o d p r e s s u r e i n c r e a s e s i n s t r o k e - p r o n e s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v e r a t s . J N u t r . , 1 3 4 , 1 , 3 8 - 4 2 , 2 0 0 4 .

1 2

）

K u r i t a I , M a e d a - Y a m a m o t o M , Ta c h i b a n a H , K a m e i M . A n t i h y p e r t e n s i v e e f f e c t o f Be n i f u u k i t e a c o n t a i n i n g O - m e t h y l a t e d EG CG . J A g r i c Fo o d Ch e m . , 5 8 , 3 , 1 9 0 3 - 1 9 0 8 , 2 0 1 0 .

1 3

）

M u r a m a t s u K , Fu k u y o M , H a r a Y . Ef f e c t o f g r e e n t e a c a t e c h i n s o n p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l i n c h o l e s t e r o l - f e d r a t s . J N u t r Sc i V i t a m i n o l . , 3 2 , 6 , 6 1 3 - 6 2 2 , 1 9 8 6 .

1 4

）

I k e d a I , I m a s a t o Y , Sa s a k i E, N a k a y a m a M , N a g a o H , Ta k e o T, Y a y a b e F, Su g a n o M . Te a c a t e c h i n s d e c r e a s e m i c e l l a r s o l u b i l i t y a n d i n t e s t i n a l a b s o r p t i o n o f c h o l e s t e r o l i n r a t s . Bi o c h i m Bi o p h y s A c t a . , 1 1 2 7 , 2 , 1 4 1 - 1 4 6 , 1 9 9 2 . 1 5

）

I k e d a I , Ts u d a K , Su z u k i Y , K o b a y a s h i M , U n n o T,

To m o y o r i H , G o t o H , K a w a t a Y , I m a i z u m i K , N o z a w a A , K a k u d a T. Te a c a t e c h i n s w i t h a g a l l o y l m o i e t y s u p p r e s s p o s t p r a n d i a l h y p e r t r i a c y l g l y c e r o l e m i a b y d e l a y i n g l y m p h a t i c t r a n s p o r t o f d i e t a r y f a t i n r a t s . J N u t r . , 1 3 5 , 2 , 1 5 5 - 1 5 9 , 2 0 0 5 .

1 6

）

A n d e r s o n R A , Po l a n s k y M M . Te a e n h a n c e s i n s u l i n a c t i v i t y . J A g r i c Fo o d Ch e m . , 5 0 , 7 1 8 2 - 7 1 8 6 , 2 0 0 2 .

1 7

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R o g h a n i M , Ba l u c h n e j a d m o j a r a d T. H y p o g l y c e m i c a n d h y p o l i p i d e m i c e f f e c t a n d a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f c h r o n i c e p i g a l l o c a t e c h i n - g a l l a t e i n s t r e p t o z o t o c i n - d i a b e t i c r a t s . Pa t h o p h y s i o l o g y , 1 7 , 1 , 5 5 - 5 9 , 2 0 1 0 .

1 8

）

U n n o K , Fu j i t a n i K , Ta k a m o r i N , Ta k a b a y a s h i F, M a e d a K , M i y a z a k i H , Ta n i d a N , I g u c h i K , Sh i m o i K , H o s h i n o M . Th e a n i n e i n t a k e i m p r o v e s t h e s h o r t e n e d l i f e s p a n , c o g n i t i v e d y s f u n c t i o n a n d b e h a v i o u r a l d e p r e s s i o n t h a t a r e i n d u c e d b y

c h r o n i c p s y c h o s o c i a l s t r e s s i n m i c e . Fr e e R a d i c R e s . , 4 5 , 8 , 9 6 6 - 9 7 4 , 2 0 1 1 .

1 9

）

Sa n o M , Su z u k i M , M i y a s e T, Y o s h i n o K , M a e d a - Y a m a m o t o M . N o v e l a n t i a l l e r g i c c a t e c h i n d e r i v a t i v e s i s o l a t e d f r o m o o l o n g t e a . J A g r i c Fo o d Ch e m . , 4 7 , 5 , 1 9 0 6 - 1 9 1 0 , 1 9 9 9 .

2 0

）

M a t s u o N , Y a m a d a K , Sh o j i K , M o r i M , Su g a n o M . Ef f e c t o f t e a p o l y p h e n o l s o n h i s t a m i n e r e l e a s e f r o m r a t b a s o p h i l i c l e u k e m i a

（R BL - 2 H 3 ）

c e l l s : t h e s t r u c t u r e - i n h i b i t o r y a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p . A l l e r g y . , 5 2 , 1 , 5 8 - 6 4 , 1 9 9 7 .

2 1

）

M a e d a - Y a m a m o t o M , Em a K , Sh i b u i c h i I . I n v i t r o a n d i n v i v o a n t i - a l l e r g i c e f f e c t s o f ' b e n i f u u k i ' g r e e n t e a c o n t a i n i n g O - m e t h y l a t e d c a t e c h i n a n d g i n g e r e x t r a c t e n h a n c e m e n t . Cy t o t e c h n o l o g y . , 5 5 , 1 3 5 - 1 4 2 , 2 0 0 7 .

2 2

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ミルクフルーツ（熱帯果樹）種子における生理活性効果

4 7