エライジン酸の 5-fluorouracil 抗腫蕩効果に与える影響

(1)

エライジン酸の

5 ‑ f l u o r o u r a c i l

抗腫蕩効果に与える影響

奈良県立医科大学分子病理学講座

北吉美沙穂、田遺絵里子、羅突、園安弘基

EFFECT O F ELAIDIC ACID O N ANTI‑TUMORAL EFFECT O F 5‑FLUOROURACIL

MISAHO KITAYOSHI, ERIKO TANABE, Yr LUO, HIROKI KUNIYASU Dφa r t

^{悦叩}

to f M o l e c u l a r P a t h o l o

邸，

NaraM e d i c a l U

^{似悦}

r s i t yS c h o o l o f M e d i c i n e

Rec

巴

i v

巴

dF

巴

b r u a r y2 7 , 2 0 1 5

( 7 )

Abstract . We s t u d i e d t h e e f f e c t s o f e l a i d i c a c i d ( E A ) h a s o n t h e a n t i ‑ t u m o r e f f e c t o f 5 ‑ f l u o r o u r a c i l ( F U ) . Examining t h e 5 FU s e n s i t i v i t y i n mouse l u n g c a n c

巴

rc e l l l i n e L L 2 , a n d mouse c o l o r e c t a l c a n c e r c e l l l i n e s CT26 a n d CMT93, CMT93 showed l o w s e n s i t i v i t y . The i n c r e a s e d growth i n h i b i t o r y e f f e c t s i n C T 2 6 , CMT93, a n d LL2 c e l l s wer

巴

1 0

，】

1 . 2 ‑ ,a n d 1 . 1 ‑ t i m e s , r e s p e c t i v e l y , o n c o n c u r r e n t t r e a t m e n t w i t h EA a t a n a p o p t o s i s

^戸

i n d u c i n g c o n c e n t r a t i o n and

ら

FUa t a c o n c e n t r a t i o n o f I C 5 0 . On e x a m i n i n g a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e (ALDH) a c t i v i t y c h a n g e s i n t h e c a n c e r stem c e l l s i n t h i s c a s e , i t was f o u n d t o hav

巴

beeni n c r e a s e d 3 . 8 f o l d by s i m u l t a n e o u s t r e a t m e n t w i t h 5‑FU a n d EA i n CT26 a n d LL2 c e l l s , b u t 1 . 5 ‑ f o l d i n CMT93 c e l l s . I n a d d i t i o n , c o n s i d e r i n g t h e e x p r e s s i o n o f n u c l e o s t e m i n a s a stem c e l l m a r k e r , i n s i m u l t a n e o u s t r e a t m e n t w i t h 5

^】

FU a n d EA, a n d t r e a t m

巴

n tw i t h EA a l o n e , t h e e x p r e s s i o n was i n c r e a s e d i n CT26 a n d LL2 c e l l s , w h e r e a s t h e e x p r e s s i o n l e v e l d i d n o t c h a n g e i n CMT93 c e l l s . The f o r e g o i n g s u g g e s t s t h a t , r a t h e r t h a n a l t e r i n g t h e 5‑FU s e n s i t i v i t y o f c a n c

巴

rc e l l s , EA m i g h t p r o m o t e t h e s u r v i v a l o f c a n c e r stem c e l l s . The r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e c o n t e n t o f t h e d i e t d u r i n g c h e m o t h e r a p y i s a r e l e v a n t i s s u e .

Key words . e l a i d i c a c i d , c a n c e r s t e m c e l l , a n t i ‑ c a n c e r t h

巴

r a p y

I . はじめに

エライジン酸は、 1 8 個の炭素を含み l 個のトランス型不飽和結合を有する長鎖トランス脂肪酸である。

エライジン酸の構造異性体は、シス型不飽和結合を有するオレイン酸である。エライジン酸はオレイン酸の工業的水素化により生成され、融点が室温以上であるため、マーガリンやショートニングなど多くの食品に用いられる

1

）。しかし、トランス脂肪酸は LDL −コレ

ステロールの増加を招き動脈硬化・虚血性心疾患のリスクを高めることが明らかとなっており、アメリカ食品医薬品局により添加制限が設けられている

1

）。一方、

トランス脂肪酸の癌に対する影響は 1 9 8 1 年に癌促進

作用が報告されているが

2

）、以後ほとんど詳細な解明

はなされていない。このため、エライジン酸を用いて

頻用されている抗がん剤である 5‑FU の抗腫蕩効果へ

の影響を検討した。

(2)

(8)

北古美沙穂、他 3 名

I I .材料と方法

細胞培養： 10% （ウシ胎児血清， f e t a lb o v i n e serum, FBS, Sigma Chemical C o . , S t . L o u i s , MO, USA ）および 2%p

巴

n i c i l l i n

^戸

S t r e p t o m y c i nS o l u t i o n 含

有

D‑MEM で 3 7 ℃ 、 5%C02 下で培養した CT26 （マウス大腸癌細胞株、 D r .F i d l e r [MD Anderson Cancer C e n t e r ］から供与）および CMT93（マウス大腸癌細胞株）、 LL2 （マウス肺癌細胞株、いずれも DS Pharma b i o m e d i c a l , O s a k a , J a p a n ）の 3 種類の細胞株

を使用した。

動物実験・ CT26 細胞をトリプシナイズし PBSにて 2

回洗

i 争後ハンクス液に懸濁したものを、同系統の BALB/c 雄性マウス（4 週齢）の、皮下（l x l 0 7 個）、尾静脈（肺転移、 l x l 0 6 個）、牌臓（肝転移、 l x l 0 6 個）、腹腔（腹膜播種、 l x l 0 6 個）に接種し、それぞれ腫蕩系、肺転移巣数、肝転移巣数、腹膜播種巣体積（短径 x 短径 x 長径／4 [ m

皿3

］）を検討した。エライジン酸は週 1

回

1 0m g /kgBW 腹腔内投与した。

試薬：エライジン酸および 5 −フルオロウラシル ( 5

^目

FU ）は Sigma

^【

A l d r i c h( S t . L o u i s , MO, USA ）から購入し、それぞれ 100%エタノール、 p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S , Sigma ）で希釈し使用した。また、テトラゾリウム化合物［3 ‑ ( 4 , 5

^四

d i m e t h y l t h i a z o l2 ‑ y l ）ふ（3

^『

c a r b o

町

m e t h o x y p h e n y l )‑ 2 ‑( 4

^』

s u l f o p h e n y l ) 2H t e t r a z o l i u m , i n n e r s a l t (MTS ）試薬（C e l l T i t

巴

r 96 AQueous One S o l u t i o n Reagent, Promega B i o s c i e n c e s , I n c . San L o u i s O b i s p o , CA, USA 、） ALDEFLUOR K i t ( V e r i t a s , T o k y o , J a p a n ）を購入し使用した。

MTS a s s a y：エライジン酸・ 5FU 同時処理の実験では、 2 4

^』

w e l l プレートに、通常培地にて CT26 細胞・

LL2 細胞（2×1 0 4c e l l s / w e l l ）、および、 CMT93 細胞（3

×1 0 4 c e l l s / w e l l ）を播き、 2 4 時間後にエライジン酸および 5‑FU を加えた。 2 4 時間後に 20%MTS 試薬を加え、 1 時間後 492nm で吸光度を計測した。

エライジン酸前処理の実験では、 25cm シャーレに通常培地により CT26 、LL2 、CMT93 の各細胞を 2 4 時間培養し、エライジン酸（2 0 μ g/mL ）を 2 4 時間処理した。その後、 2 4

^悶

w e l l プレートに各細胞（7 ×1 0 4 c e l l s / w e l l ）を播き、 6 時間後に 5FU 処理した。 2 4 時間後に 20%MTS 試薬を加え、 1時間後 4 9 2nm で吸光度を計測した。

Reverse t r a n s c r i p t i o n ‑ p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n (RT‑PCR) : T r i z o l r e a g e n t ( M o l e c u l a r Res

巴

a r c h C e n t e r I n c . , C i n c i n n a t i , OH, USA ）を用い、細胞

より RNAを単離し、残存 DNAを除去するため DNase 処理を行った。 HighC a p a c i t y cDNA R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n K i t ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , R o c k v i l l e , MD, USA ）を用いて、 RNA( 2 μ g ）から cDNAを合成し、得られた cDNA は T a b l eLに記した p r i m e r s

^巴

t を用いて各遺伝子を増幅した。 PCR産物（5 μ L ）はエチジウムブロマイド入りアガロースゲルで電気泳動し発現を確認した。ハウスキーピング遺伝子である g l y c e r a l d e h y d e ‑ 3 ‑ p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e (GAPDH ）を l o a d i n gc o n t r o lとして用いた。なお、

Th

巴

r m a lr e a c t i o n は以下の条件で反応させた。 9 5 ℃ x 5min

×

l c y c l e ( 9 5 ℃ x 30sec‑Tm

値 ×

3 0 s e c

目

7 2 ℃× 3 0 s e c ）× 4 5 c y c l e s 、7 2 ℃× l O m i n ×1c y c l e 、

4 ℃×∞

Aldehyde d e h y d r o g e n a s e a s s a y 目測定には ALDEFLUOR キットを用いた。 9 6 w e l l プレ｝トに通常培地により各細胞（5 0 0 0c e l l s / w e l l ）を播き、 2 4 時後にエライジン酸および 5‑FU を加えた。 2 4 時間後に培地を除去し、 AssayB u f f e r ・ A c t i v a t e d r

巴

a g e n t

Lower p r i m e r

GAPDH

•5 ’－ TGTGTCCGTCGTGGATCTGA 同3’ 5’ー TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'

一………一………^ω………………眠、一……^h…………一………一…………ー即時

T a b l e 1 . The p r i m e r s e q u e n c e s u s e d f o r RT PCR a n a l y s i s .

(3)

5 f l u o r o u r a c i l

抗腫蕩効果に与える影響

混合液を加え

40

分処理した。

Ne g a t i v ec o n t r o l

として

aldehydedehydrogenase i n h i b i t o r

である

diethylaminobenzaldeh y de ( DEAB

）を加えた混合液を用いた。その後、

325 nm

で培地の蛍光を計測した。

統計処理・

I n S t a t 3 . 0

ソフトウェア（

Graphpad.com, La J o l l a . CA , USA

）により

t w o ‑ t a i l e dMann‑Whitney U

検定を行い、 p

f

直が

0 . 05

未満の場合に有意差があ

ると判定した。

皿結果

本研究は、エライジン酸が

5

・

FU

の抗腫蕩効果に与える影響を明らかにする目的で、エライジン酸の

5‑FU

感受性および癌幹細胞への影響を検索した。

( 1 )

エライジン酸の細胞噌殖能・転移能への影響エライジン酸の腹腔内投与により

CT26

大腸癌細胞によるマウス皮下腫蕩の増大が有意に促進された

( F i g . lA ）。

さらに、腹膜橋種、肝転移、肺転移のいずれのマウス転移モデルにおいても、エライジン酸の

A 2 s r Subcutaneous tumor

f 2 0

. . . . .

i t s

a

信

唱

. 1 0

. _;

t : ! s

1

^P^制⁼^‑⁰^.^{0曲 T}

C T r

削

m e n t ( d

町｝

1 0 L i v e r metastasis

C 8 」

さ盟

E

i ⁶

号

4 z 2

。 v

^面記辰一

OA EA τ r e a t m e n t

( 9 )

腹腔内投与により転移形成は著明に促進された（

F i g .

lB, C, D）。このように、エライジン酸は著明な腫蕩増大

・

転移の促進作用を有することが示された。

( 2

）エライジン酸の

5‑FU

細胞増殖抑制効果への影響

CT26

細胞および

CMT93

細胞において、エライジン酸濃度を変えて処理し、

5‑FU

単独処理した場合とエライジン酸・

5‑FU

を同時処理した場合を比較すると、低用量のエライジン酸では

5‑FU

の細胞毒性が促進されたが、高用量では促進効果は消失していた

( F i g . 2 A , C

）

。

これに対し、

LL2

細胞では、エライジン酸・

5‑FU

の同時処理による

5‑FU

の増殖抑制効果に変化は認められなかった（

F i g .2B

。）

次に、癌細胞におけるエライジン酸を前処理したのち残存する細胞の数を揃えて捲き直し、

5FU

処理した時の

5‑FU

増殖抑制効果への影響を検討した。すると同時処理の時とは異なり、

5‑FU

単独処理とエライジン酸前処理後

5‑FU

処理の細胞増殖を比較しでも、

CT26

細胞では減少したのに対し、

LL2

細胞および

CMT93

細胞では

5FU

単独処理に比較し細胞数は増

B ₄₀₀ _, _‑ P e r i t o n e a l metastasis P < 0.0001

h u

内

υ A υ

A O A

U A U

︐

a ︑ ︐ ．．

a

わ昌喜︶

富田

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・問 ︒

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﹂F

A H V A M v a U

2d

吻

e

− a

Ee E2 3−

SE SZ

F i g . 1 . E f f e c t o f e l a i d i c a c i d o n g r o w t h a n d m e t a s t a s i s o f CT26 c e l l s

( A ) D i a m e t e r o f s u b c u t a n e o u s t umor o f CT26 c e l l s . ( B D ) M e t a s t a s e s t o t h e p e r i t o n e u m

但），

l i v e r ( C ) ,

a n d l u n g ( D ) . M i c e w e r e a d m i n

】

s t r a t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y w i t h v e h i c l e ( 7 0 % e t h a n o l ) , o l e i c a c i d (OA

1 0 r r g / k g b o d y w e i g h t ) . o r e l a i d i c a c i d (EA 1 0 m g / kg b o d y w e i g h t ) . B a r , mean o f r e s u l t s o f 6 m i c e

E r r o r b a r s . SD

(4)

( 1 0 )

北吉美沙穂、他

3

名

加していた（

F i g .3A C

）。

エライジン酸は

5‑FU

増殖抑制効果に関して細胞により差異が見られ、明瞭な一定の量的影響を与えなかったので、癌幹細胞を標的とする質的な影響を知るため、癌幹細胞マーカーを検討した。

( 3

）エライジン酸の癌幹細胞性への影響

一般的に癌幹細胞マーカーとされる

CD133

および

nucleostemine (NS

）の発現を

3

種類の細胞株を用いて検討した（

F i g .4

）。いずれの細胞株においても

5‑FU

単独処理とエライジン酸・

5‑FU

同時処理との問で

CD133

発現レベルに差は認められなかった（

F i g . 4A,B

）。

次に、 NS発現を検討すると、

5‑FU

同時処理を比較すると、

CMT93

細胞では有意な発現低下が、と

LL2

細胞では有意な発現の増加がみられ、

CT26

細胞では発現レベルにほとんど変化が認められなかった（

F i g .4C , D

）。このよう

に、癌幹細胞マーカーの発現は細胞株によって変化が異なっていた。

さらに、エライジン酸と

5‑FU

処理における癌幹細胞性の変化を検討するために、癌細胞での

ALDH

活性へのエライジン酸と

5‑FU

の影響を調べた（

F i g .5 A‑C

）。

CT26

細胞と

CMT93

細胞では、

5‑FU

5FU

同時処理との間で

ALDH

活性に変化が認められなかった（

F i g .4A,C

）。

LL2

5‑FU

同時処理で

5‑FU

単独処理よりも

ALDH

活性に有意な上昇が認められた（

Fig.4B

）。

処理後の細胞個々の幹細胞性を検討するため、

ALDH

活性を細胞数と

DEAB

処理

n e g a t i v ec o n t r o l

で標準化すると、

CT26

細胞と

CMT93

5FU

同時処理で

5‑FU

ALDH

活性がやや高い傾向が見られた（

F i g .5D

）。

これら

3

株の平均をとり比較すると、エライジン酸・

5‑FU

同時処理では

5‑FU

ALDH

活性が有意に高く認められた（

F i g .5E

）。

T26 j l ! ! : , l l ! i 1 ! ^~u ^. A jl!J ~ i

L~ 1 : i ^"" ^\ ^[~ B l j ‑ i

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と

正午； i ti : I主主主 1~1 ^-~ ^· ⁱ ^M ^f ^f ^>

F i g . 2 . E

旺

e c to f e l a i d i c a c i d o n 5 FU c y t o t o x i c i t y i n c a n c e r c e l l s by c o n c u r r e n t t r e a t m e n t o f t h e e l a i d i c a c i d and 5 FU

CT26 ( A ) . LL2 ( B J and CMT93 ( C ) c e l l s were t r e a t e d w i t h e l a i d i c a c i d ( E A ) ( 1 0

μg / mL o r 2 0 μg /mL) and 5‑FU ( 1 μg / mL o r 2 μg / mL) f o r 2 4 h r s . E r r o r b a r s , SD

F i g . 3 . E

旺

e c to f e l a i d i c a c i d p r e t r e a t m e n t

on 5‑FU c y t o t o x i c i t y i n c a n c e r c e l l s .

CT26 ( A ) . LL2 ( B ) a n d CMT93 ( C ) c e l l s

were p r e t r e a t e d w i t h e l a i d i c a c i d ( E A )

( 2 0 μg/mL) f o r 2 4 h r s . A f t e r t h a t , t h e

c e l l s were t r e a t e d w i t h 5 FU ( 1 μ g / mL)

f o r 6 h r s ( ' P < 0 . 0 5 ) . E r r o r b a r s , SD

(5)