妊 娠 中 の 咀 嚼 運 動 が
新 生 仔 の 母 体 ス ト レ ス 性 脳 機 能 障 害 に
及 ぼ す 効 果
お お に し み か
大 西 見 佳
本 論 文 の 要 旨 は ， 第 146 回 朝 日 大 学 大 学 院 歯 学 研 究 科 発 表 会 (平 成 25 年 9 月 24 日 ， 岐 阜 )に お い て 発 表 し た ． 本 論 文 の 一 部 は ， 第 34 回 日 本 神 経 科 学 大 会 (平 成 23 年 9 月 14～ 17 日 ， 横 浜 ), 第 50 回 日 本 小 児 歯 科 学 会 大 会 （ 平 成 24 年 5 月 12～ 13 日 , 東 京 ） , 第 35 回 日 本 神 経 科 学 大 会 （ 平 成 24 年 9 月 18～ 21 日 ,名 古 屋 ），
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t h Japanese Association for Dental Research (平 成 24 年 12 月 14～ 15 日 , 新 潟 ), 91
t h International Association for Dental Research (平 成 25 年 3 月 20～ 23 日 ,シ ア ト ル ) ， 第 51 回 日 本 小 児 歯 科 学 会 大 会 （ 平 成 25 年 5 月 23～ 24 日 , 岐 阜 ） に お い て 発 表 し た ．1
緒 言
わ が 国 の 急 激 な 社 会 構 造 の 変 化 に 伴 い ， 人 々 は 計 り 知 れ な い ス ト レ ス 環 境 下 に お か れ ， う つ 病 や 自 律 神 経 失 調 症 あ る い は 内 分 泌 疾 患 が 急 増 し ， 近 年 ， 大 き な 社 会 問 題 に な っ て い る 1 )． 厚 生 労 働 省 の 患 者 調 査 に よ れ ば ，日 本 の う つ 病 患 者 数 は ，1999 年 に は 64.0 万 人 ， 2008 年 に は 108.8 万 人 と 著 し く 増 加 し て い る 2 )．
生 体 に ス ト レ ス が 負 荷 さ れ る と ， 視 床 下 部 -下 垂 体 -副 腎 皮 質 系 （ HPA 系 ） が 活 性 化 し ， ス ト レ ス 反 応 が 開 始 さ れ る 3 )． HPA 系 の 制 御 核 は 視 床 下 部 に あ る 室 傍 核 (PVN)で ， ス ト レ ス 負 荷 に よ り 小 細 胞 群 の 細 胞 が 副 腎 皮 質 刺 激 ホ ル モ ン 放 出 ホ ル モ ン (CRH)や ア ル ギ ニ ン バ ソ プ レ ッ シ ン (AVP)を 分 泌 す る 4 )． CRH や AVP は 下 垂 体 前 葉 の 細 胞 に 作 用 し 副 腎 皮 質 刺 激 ホ ル モ ン （ ACTH） の 分 泌 を 促 し ， ACTH は 副 腎 皮 質 に 作 用 し て グ ル コ コ ル チ コ イ ド を 分 泌 さ せ ス ト レ ス 反 応 が 開 始 さ れ る 4 )． 一 般 的 に ， CRH は 急 性 ス ト レ ス 下 で ， AVP は 慢 性 ス ト レ ス 下 で 分 泌 さ れ ， HPA 系 を コ ン ト ロ ー ル し て い る 4 )．
近 年 ， 妊 娠 中 か ら 周 産 期 の 環 境 が 仔 の 発 育 ・ 成 長 に 大 き く 影 響 す る こ と が わ か っ て き た 5 - 1 0 )． 特 に ， 妊 娠 中 に 強 い ス ト レ ス ， 或 い は 弱 く て も 持 続 的 に ス ト レ ス に 曝 さ れ た 母 親 か ら 生 ま れ た 子 は ，
2
高 次 脳 機 能 回 路 形 成 の 発 達 が 遅 延 し ， 学 習 ・ 記 憶 障 害 や 情 動 障 害 の リ ス ク が 高 ま る こ と が 報 告 さ れ
5 - 1 0 )， 妊 娠 中 の 環 境 が 注 目 さ れ る よ う に な っ た ．
妊 娠 中 ， 特 に 妊 娠 後 期 の 胎 盤 機 能 が 完 成 し た 後 に ス ト レ ス を 被 っ た 母 親 か ら 生 ま れ た 子 の 行 動 異 常 や 精 神 遅 滞 の 発 生 率 が ， ス ト レ ス を 受 け な か っ た 母 親 か ら 生 ま れ た 子 の 約 2 倍 で あ る と い う 疫 学 調 査 の 結 果 が 発 表 さ れ て い る 1 1 )． ま た ， マ ウ ス や ラ ッ ト の 妊 娠 母 体 を 出 産 前 １ 週 間 拘 束 ス ト レ ス 下 に お く と ， 生 ま れ て く る 仔 の 脳 の 高 次 ネ ッ ト ワ ー ク の 生 後 発 達 が 遅 れ ， 空 間 認 知 障 害 や う つ 病 様 の 情 動 障 害 を 発 症 す る こ と が 確 か め ら れ た 5 - 1 0 )．
海 馬 は 記 憶 の 座 で あ り ， 海 馬 歯 状 回 で は 出 生 後 も 生 涯 を 通 じ て 細 胞 新 生 が 続 き ， 増 殖 ， 生 存 ， 分 化 と い う 3 つ の ス テ ー ジ を 経 て 大 部 分 が 神 経 細 胞 に 分 化 す る 1 2 )． 分 化 し た 神 経 細 胞 は ， 軸 索 突 起 や 樹 状 突 起 を 発 達 さ せ 海 馬 内 の 神 経 ネ ッ ト ワ ー ク に 組 み 込 ま れ ， 空 間 認 知 機 能 に 関 与 す る よ う に な る と 言 わ れ て い る 1 3 , 1 4 )． 妊 娠 拘 束 ス ト レ ス は 仔 の 海 馬 神 経 細 胞 の 新 生 機 構 1 5 )や ， 海 馬 錐 体 細 胞 の 発 達 を 抑 制 し 1 5 )， 空 間 認 知 障 害 を 惹 起 さ せ る こ と も 明 ら か に な っ て き た ． こ れ ら の 障 害 は ， グ ル コ コ ル チ コ イ ド プ ロ グ ラ ミ ン グ 説 が 原 因 と 考 え ら れ て い
る 1 6 , 1 7 )． つ ま り ， 発 達 期 の 胎 児 の 脳 が ス ト レ ス 性
に 上 昇 し た 母 体 の グ ル コ コ ル チ コ イ ド に 曝 さ れ る
3
と 胎 児 の ス ト レ ス 軸 が 変 化 し 1 6 , 1 7 )， 生 涯 を 通 じ て ， ス ト レ ス に 対 し て 過 敏 か つ 過 剰 に 反 応 す る こ と に よ り 様 々 な 脳 機 能 障 害 が 惹 起 さ れ る と い う も の で あ る ．
最 近 ， ヒ ト や 動 物 を 対 象 と し た 多 く の 研 究 に よ り ， ス ト レ ス 下 の 咀 嚼 運 動 が ス ト レ ス 緩 和 作 用 を 有 す る こ と が 報 告 さ れ は じ め た 1 8 - 2 4 )． 咀 嚼 運 動 に よ り ス ト レ ス 性 に 生 じ た 癌 )や ス ト レ ス 性 の 胃 潰 瘍 の 発 生 が 抑 制 さ れ た り 1 8 )， ス ト レ ス に よ る 脳 内 カ テ コ ー ル ア ミ ン と ア ド レ ナ リ ン の 増 加 を 抑 制 す
る 1 9 , 2 0 )こ と な ど が 示 さ れ て い る ． ま た ， 咀 嚼 運 動
は ， HPA 系 の 活 性 を 低 下 さ せ ， グ ル コ コ ル チ コ イ ド の 分 泌 を 抑 え る こ と も 報 告 さ れ て い る 2 1 - 2 4 )．
そ こ で 本 研 究 で は ， 拘 束 ス ト レ ス 曝 露 下 で 咀 嚼 様 刺 激 を 与 え た 妊 娠 マ ウ ス と 与 え な か っ た 妊 娠 マ ウ ス か ら 生 ま れ た 仔 マ ウ ス の 情 動 機 能 ,空 間 認 知 機 能 及 び 海 馬 に お け る 神 経 細 胞 新 生 機 構 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た ．
4
材 料 お よ び 方 法
実 験 に は 3 か 月 齢 の 雌 雄 （ 雌 54 匹 ， 雄 27 匹 ） の ddY マ ウ ス を 用 い た 2 6 )． こ れ ま で に 妊 娠 し た 経 験 の な い 雌 2 匹 と 雄 1 匹 を ケ ー ジ に 入 れ 交 配 さ せ た ． 交 配 翌 日 膣 の プ ラ グ を 確 認 し ， プ ラ グ の 認 め ら れ た マ ウ ス を 妊 娠 0 日 と し て 個 別 の ケ ー ジ で 飼 育 を 行 っ た .
実 験 に 用 い た ddY マ ウ ス は 朝 日 大 学 歯 学 部 実 験 動 物 飼 育 施 設 に お い て 飼 育 し た ． 室 温 （ 22± 2℃ ） と 湿 度 （ 55± 2％ ） は 一 定 に 保 た れ ， 明 暗 周 期 は 6 時 よ り 18 時 ま で 点 灯 ,18 時 よ り 6 時 ま で 消 灯 さ れ る . マ ウ ス は 固 形 飼 料 (日 本 ク レ ア 社 ,CE-2,東 京 ) と 水 は 自 由 に 摂 取 で き る 状 態 と し た .
な お こ の 実 験 は 朝 日 大 学 歯 学 部 動 物 実 験 専 門 委 員 会 の 承 認 （ 13-017） を 得 て い る .
1.妊 娠 期 の ス ト レ ス
妊 娠 中 の マ ウ ス に Lemaire ら 7 , 1 5 )の 方 法 に し た が っ て 拘 束 ス ト レ ス を 負 荷 し た ． 妊 娠 12 日 目 か ら 出 産 ま で の 1 週 間 ， 1 回 45 分 間 １ 日 3 回 （ 10 時 ， 14 時 ， 18 時 ）， 長 さ 10.3cm， 内 径 4.5cm の プ ラ ス チ ッ ク 製 の チ ュ ー ブ に 妊 娠 マ ウ ス を 閉 じ 込 め , 拘 束 ス ト レ ス と し た .
5
2.咀 嚼 様 刺 激
拘 束 ス ト レ ス を 負 荷 す る プ ラ ス チ ッ ク チ ュ ー ブ の 片 側 2 個 所 に 直 径 約 2mm の 穴 を あ け 直 径 約 2mm の 爪 楊 枝 を 挿 入 し ,マ ウ ス の 鼻 先 に 位 置 す る よ う に 爪 楊 枝 を 固 定 し ， マ ウ ス に 噛 ま せ た .マ ウ ス が 爪 楊 枝 を 噛 み き っ た 場 合 ,古 い 爪 楊 枝 を 除 去 し ,新 た な 爪 楊 枝 を チ ュ ー ブ の 穴 に 挿 入 し ,引 き 続 き 爪 楊 枝 を 噛 ま せ た .
3.仔 マ ウ ス の 分 類
拘 束 ス ト レ ス を 負 荷 し た 母 マ ウ ス か ら 出 生 し た 仔 マ ウ ス を 「 ス ト レ ス 群 」 ,拘 束 ス ト レ ス 中 に 爪 楊 枝 を 噛 ま せ た 母 体 か ら 出 生 し た 仔 マ ウ ス を 「 咀 嚼 群 」 ,ス ト レ ス を 負 荷 せ ず 通 常 の 母 体 か ら 出 生 し た 仔 マ ウ ス を 「 コ ン ト ロ ー ル 群 」 と し た ． 出 生 し た 仔 マ ウ ス を 無 刺 激 状 態 の 飼 育 ゲ ー ジ 内 で 母 マ ウ ス と と も に 通 常 飼 育 し ,生 後 21 日 目 に 離 乳 さ せ た . 離 乳 後 ,雌 雄 別 に 同 一 腹 ご と に 同 一 ケ ー ジ で マ ウ ス を 飼 育 し た .本 実 験 で は 雄 の 4 か 月 齢 の 仔 マ ウ ス 60 匹 を 使 用 し た ．
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4.母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA の 検 索
妊 娠 18 日 目 の 各 群 の 母 マ ウ ス (各 群 の 母 マ ウ ス ， n＝ 6)に ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル (40mg/kg)麻 酔 を 行 い ， 37℃ の 生 理 食 塩 水 を 30ml， 続 い て 4℃ の 4％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド [0.1M リ ン 酸 緩 衝 液 (PB)]固 定 液 100ml を 心 臓 か ら 灌 流 さ せ 固 定 を 行 っ た ． 次 い で ,脳 を 取 り 出 し ,2％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 固 定 液 (4℃ )に よ り 一 晩 後 固 定 を 行 っ た 後 ， ア ル コ ー ル 上 昇 系 に よ っ て 処 理 し ， パ ラ フ ィ ン 包 埋 し た ．
AVPｍ RNA の 検 索 に は Tanaka ら の 方 法 2 7 )に よ り
in situ
hybridization 法 を 用 い た ． パ ラ フ ィ ン 包 埋 し た 脳 を ， ス ラ イ デ ィ ン グ ミ ク ロ ト ー ム （ リ ト ラ ト ー ム ， 大 和 光 機 工 業 ， 埼 玉 ） を 用 い て ， 前 頭 断 で 厚 さ 6μ ｍ の PVN の 連 続 切 片 を 作 成 し た ． 発 色 に は DAB Liquid System(DAKO, USA)を 用 い ， 反 応 産 物 の 可 視 化 を 行 っ た 後 ， 対 比 染 色 と し て ヘ マ ト キ シ リ ン 染 色 を 行 っ た ． 次 い で ， 通 法 に し た が っ て エ タ ノ ー ル 上 昇 系 列 に 通 し て 脱 水 し た 後 ， キ シ レ ン を 用 い て 透 徹 封 入 （ マ ウ ン ト ク イ ッ ク Ⓡ 大 道 産 業 ， 埼 玉 ） し た ．AVPmRNA の 解 析 は ， Tanaka ら の 方 法 2 7 )に よ り 行 っ た ． 3 群 の 母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA 陽 性 部 分 の 面 積 を Filing System（ FLOVEL, 東 京 ） を 用 い て 解 析 し た .ス ト レ ス 群 と 咀 嚼 群 の 母 マ ウ ス の AVPmRNA の 面 積 は コ ン ト ロ ー ル 群 の AVPmRNA
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の 面 積 を 100％ と し た 時 の 増 減 率 で 表 し た ． 計 測 部 位 は ， Swason Brain Maps2 8 ) を 用 い て ， Bregma-1.80mm ～ -1.88mm の 部 位 を 計 測 範 囲 と し た ．
5.母 マ ウ ス の 血 中 コ ル チ コ ス テ ロ ン （ CO） 濃 度 の 測 定
妊 娠 18 日 目 に 各 群 の 母 マ ウ ス (n＝ 6)の 血 中 の CO 濃 度 を 測 定 し た ． エ ー テ ル 麻 酔 下 で マ ウ ス の 腋 窩 動 脈 を 切 開 し 全 血 を 採 取 し た ． 採 血 し た 血 液 を 2.0 ml の マ イ ク ロ 遠 心 管 に 採 取 し ， 4℃ で 10 分 間 3,500× g で 遠 心 分 離 し た 後 ,血 清 の み を 採 取 し て , 分 析 す る ま で の 間 － 80℃ の 冷 凍 庫 で 保 存 し た ． 血 中 CO 濃 度 は SRL Biochemistry Lab(東 京 )で ラ ジ オ イ ム ノ ア ッ セ イ に よ り 測 定 し た ．
6.ホ ー ル ボ ー ド 試 験
ホ ー ル ボ ー ド 試 験 は 齧 歯 類 の 情 動 性 を 多 角 的 に か つ 定 量 的 に 解 析 す る 実 験 と し て 広 く 利 用 さ れ て
い る 2 9 )． 4 か 月 齢 の 各 群 の マ ウ ス を 用 い て 5 分 間
に お け る 穴 を 覗 く 回 数 を 測 定 し ， 妊 娠 中 の 母 体 ス ト レ ス 負 荷 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 生 ま れ た 仔 の 情 動 性 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た (各 群 ， n＝ 5)．
装 置 本 体 は ， 縦 40 ㎝ × 横 40 ㎝ × 高 さ 36 ㎝ の 灰 色 四 角 形 で あ り ， 床 面 に 中 央 か ら 等 距 離 の 間 隔 で
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16 個 の 直 径 5 ㎝ （ マ ウ ス 用 ） の 穴 が 設 け ら れ て い る ． マ ウ ス の 探 索 行 動 解 析 は コ ン ピ ュ ー タ シ ス テ ム （ Move-tr/2DⓇ ,Library, 東 京 )に 連 結 し た CCD カ メ ラ (ExwaneⓇ , SONY, 東 京 )に よ り 行 っ た ． 5 分 間 に 穴 を 覗 く 回 数 を 測 定 し 2 9 )， 仔 マ ウ ス の 情 動 性 の 評 価 を 行 っ た ．
7.Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト
Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト は ,齧 歯 類 の 海 馬 機 能 を 反 映 し た 空 間 認 知 機 能 の 測 定 に 広 く 利 用 さ れ て
い る 3 0 , 3 1 )． ホ ー ル ボ ー ド 試 験 を 行 っ た 翌 日 か ら ，
各 群 の マ ウ ス に 1 日 に 4 回 ず つ 7 日 間 連 続 し て Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト を 実 施 し ， 妊 娠 中 の 母 体 ス ト レ ス 負 荷 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 生 ま れ た 仔 の 空 間 認 知 機 能 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た （ 各 群 ， n＝ 5）．
水 迷 路 に は 直 径 90 ㎝ ,深 さ 30 ㎝ の ス テ ン レ ス 製 の プ ー ル （ 内 壁 面 は 青 く 塗 ら れ て い る ） を 用 い て , 深 さ 22 ㎝ ま で 水 (水 温 28℃ )を 入 れ , 直 径 12 ㎝ の 台 (プ ラ ッ ト フ ォ ー ム )を プ ー ル の 中 央 近 く の 水 面 下 1 ㎝ の 深 さ の 位 置 に 設 置 し た . ま た ,水 中 の プ ラ ッ ト フ ォ ー ム が 見 え な い よ う に す る た め 水 面 を 直 径 1～ 2 ㎜ の ス チ レ ン ビ ー ズ で 覆 っ た ． 本 実 験 で は 4 箇 所 の ス タ ー ト 地 点 を 設 け ,マ ウ ス を プ ー ル 内 壁 面 に 向 け な が ら 静 か に 水 中 に 入 れ た . 始 め の う ち マ ウ ス は プ ラ ッ ト フ ォ ー ム の 存 在 を 知 ら ず 泳
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ぎ 回 り ,偶 然 に プ ラ ッ ト フ ォ ー ム に た ど り 着 く ． テ ス ト の 回 数 を 重 ね る に つ れ ,プ ラ ッ ト フ ォ ー ム の 位 置 を プ ー ル 周 囲 の 目 標 物 と の 位 置 関 係 で 記 憶 す る よ う に な り ,プ ラ ッ ト フ ォ ー ム へ の 到 達 時 間 が 次 第 に 短 く な る . 4 か 月 齢 の 各 群 の マ ウ ス を こ の プ ー ル で 泳 が せ , コ ン ピ ュ ー タ シ ス テ ム (Move-tr/2DⓇ ,Library , 東 京 )に 連 結 し た CCD カ メ ラ (ExwaneⓇ , SONY, 東 京 )に よ り 遊 泳 中 の 動 き を 記 録 し ,プ ラ ッ ト フ ォ ー ム へ の 到 達 時 間 を 計 測 し た ． さ ら に ,視 力 や 遊 泳 能 力 に よ る 影 響 を 調 べ る た め ,6 日 目 の 水 迷 路 テ ス ト 終 了 後 プ ラ ッ ト フ ォ ー ム を 水 面 上 に 約 1cm 露 出 さ せ ,Visible Probe Test を 行 っ た .
8.海 馬 歯 状 回 に お け る 神 経 細 胞 新 生 機 構 の 解 析 妊 娠 中 の 母 体 ス ト レ ス 負 荷 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 生 ま れ た 仔 の 海 馬 歯 状 回 で の 神 経 細 胞 新 生 機 構 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た .5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU)は 細 胞 の 分 裂 周 期 に お け る S 期 の 細 胞 DNA に の み 選 択 的 に 取 り 込 ま れ ， 新 生 細 胞 の マ ー カ ー と な る 化 学 物 質 で あ る 1 2 , 3 2 , 3 3 )． 今 回 ， BrdU を マ ウ ス に 投 与 し ， 新 生 細 胞 の 増 殖 数 ， 生 存 数 お よ び 分 化 率 に つ い て 解 析 し た ．
1) BrdU 投 与
Gilbert ら 3 3 )の 方 法 に 準 じ て ， 各 群 の マ ウ ス に
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BrdU 溶 液 （ BrdU:チ ミ ジ ン 類 似 物 質 ） 10 ㎎ /ml を 50 ㎎ /㎏ の 割 合 で ， 3 時 間 毎 に 5 回 マ ウ ス に 腹 腔 内 投 与 し た ．
2) BrdU 陽 性 細 胞 の 染 色
BrdU 投 与 24 時 間 後 マ ウ ス を ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル 麻 酔 (40mg/kg)し ， 37℃ の 生 理 食 塩 水 を 30ml，
続 い て 4℃ の 4％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 0.1M リ ン 酸 緩 衝 液 (PB)固 定 液 100ml を 心 臓 か ら 灌 流 さ せ 固 定 を 行 っ た ． そ の 後 ,速 や か に 脳 を 摘 出 し ,2％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド (4℃ )に よ り 一 晩 後 固 定 を 施 し , そ の 翌 日 か ら 1 日 お き に 10％ ス ク ロ ー ス ,20％ ス ク ロ ー ス ,30％ ス ク ロ ー ス 加 0.01M リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (PBS)に 浸 漬 さ せ 高 張 処 理 を 行 っ た (4℃ )．
高 張 処 理 し た 脳 を ド ラ イ ア イ ス を 用 い て 凍 結 さ せ ， ク リ オ ス タ ッ ト (CM1850， LEICA， BRD)を 用 い て 前 額 断 で 厚 さ 40μ m の 海 馬 の 連 続 切 片 を 作 成 し た ． 切 片 を PBS に よ り 洗 浄 し た 後 ， 2× SSC（ 20× SSC Buffer Stock Solution を 蒸 留 水 で 希 釈 ） を 加 え 濃 度 を 50％ に 調 整 し た ホ ル ム ア ミ ド に よ り 65℃
で 2 時 間 反 応 さ せ ,そ の 後 2× SSC で 洗 浄 し た . 次 い で 37℃ の 2M の HCl で 30 分 間 DNA 切 断 処 理 を 行 い ,0.05M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 (TBS, pH8.5)と PBS で 洗 浄 後 ,1％ H2O2 で 10 分 間 処 理 し た . そ の 後 PBS で 切 片 を 洗 浄 し た 後 ,5％ normal rabbit serum に よ り 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た . 再 び 切 片 を PBS で
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洗 浄 し た 後 ， 0.3％ の Triton X-100 を 含 ん だ PBS(PBS-T ） に よ っ て 200 倍 に 希 釈 し た rat monoclonal to BrdU (abcam, UK)を 用 い て 4℃ で 48 時 間 反 応 さ せ た ． 切 片 を PBS で 洗 浄 後 ， 500 倍 希 釈 し た rabbit anti-rat (DAKO,USA)(PBS-T)で 2 時 間 室 温 で 反 応 さ せ た ． PBS と TBS で 切 片 の 洗 浄 を 行 い ，TBS に よ り 500 倍 に 希 釈 し た peroxidese – conjugated–streptoavidin (DAKO, USA) を 用 い て 室 温 で 1 時 間 の 反 応 を 行 っ た ． 発 色 は diamino benzidine tetrahydrochloride(同 仁 化 学 研 究 社 ， 熊 本 )お よ び １ ％ H2O2 に よ り 行 っ た ．
3) BrdU 陽 性 細 胞 数 の 解 析 方 法
Li ら の 方 法 に 準 じ て 3 3 )，作 成 し た 海 馬 の 連 続 切 片 に お い て 4 枚 ご と （ 120μ m 間 隔 ） に 1 切 片 を 選 び だ し ， 計 8 枚 の 切 片 に つ い て 左 側 海 馬 歯 状 回 の BrdU 陽 性 細 胞 を 光 学 顕 微 鏡 下 で カ ウ ン ト し た (各 群 ， n＝ 5)．
4) 新 生 細 胞 の 生 存
海 馬 歯 状 回 で 新 生 し た 細 胞 は 新 生 後 約 3 週 で 神 経 細 胞 や 星 状 膠 細 胞 に 分 化 し ， 神 経 細 胞 は 軸 索 を 伸 展 し ， 成 熟 し た 神 経 細 胞 へ と 成 長 す る と い わ れ て い る 1 2 )． し た が っ て 本 実 験 で は ， BrdU 投 与 21 日 後 の BrdU 陽 性 細 胞 数 を 計 測 し た ． 前 述 の 方 法 を 用 い て ， BrdU 溶 液 を 各 群 の マ ウ ス に 投 与 し ， 21 日 後 に 灌 流 固 定 を 行 っ た ． そ の 後 ， 抗 BrdU 抗 体
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（ abcam, UK） を 用 い て 免 疫 組 織 染 色 を 行 い ， 前 述 の 方 法 を 用 い て 新 生 細 胞 生 存 数 の 計 測 を 行 っ た (各 群 ， n＝ 5)．
5) 新 生 細 胞 の 分 化
海 馬 歯 状 回 に お け る 新 生 細 胞 は 約 3 週 間 で 神 経 細 胞 と 星 状 膠 細 胞 に 分 化 す る と 言 わ れ て い る 3 5 )． 新 生 細 胞 か ら 神 経 細 胞 と 星 状 膠 細 胞 へ の 分 化 率 を 調 べ る た め ， 前 述 の 方 法 を 用 い て BrdU 溶 液 を 各 群 の マ ウ ス に 投 与 し ， 21 日 目 に 前 述 の 方 法 で 還 流 固 定 を 行 っ た ．
新 生 細 胞 か ら 神 経 細 胞 に 分 化 し た 細 胞 を 検 出 す る た め ， 抗 BrdU 抗 体 （ abcam, UK） と 神 経 細 胞 の 核 に 特 異 的 に 存 在 す る 蛋 白 質 で あ る neuronatal nuclei(NeuN)に 対 す る 抗 NeuN 抗 体 （ Millipore, USA） を 用 い ， ま た ， 新 生 細 胞 か ら 星 状 膠 細 胞 に 分 化 し た 細 胞 を 検 出 す る た め ， 抗 BrdU 抗 体 （ abcam, UK） と 星 状 膠 細 胞 に 特 異 的 に み ら れ る 線 維 性 蛋 白 質 で あ る glial fibrillary acid protein(GFAP) に 対 す る 抗 GFAP 抗 体 （ Millipore, USA） を 用 い て 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 を 行 っ た ． 固 定 し た 脳 を ド ラ イ ア イ ス を 用 い て 凍 結 さ せ ， ク リ オ ス タ ッ ト (CM1850， LEICA， 東 京 )を 用 い て 前 額 断 で 厚 さ 20
μ
m の 海 馬 の 連 続 切 片 を 作 成 し ,切 片 を DNA 切 断 処 理 し ,次 い で 抗 BrdU 抗 体 （ abcam, UK） と 抗 NeuN 抗 体 （ Millipore, USA） ,抗 GFAP 抗 体 （ Millipore,13
USA） を 用 い て 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 を 行 っ た . 切 片 を PBS に よ り 洗 浄 し た 後 ， 2× SSC を 加 え 50％ に 調 整 し た ホ ル ム ア ミ ド に よ り 65℃ で 2 時 間 反 応 さ せ ,2
× SSC で 洗 浄 し た . 2N の HCl で 37℃ ,30 分 間 DNA 切 断 処 理 し ,TBS(pH8.5)と PBS で 洗 浄 し ,1％ H2O2 で 10 分 間 処 理 し ,PBS で 洗 浄 を 行 っ た .
BrdU と NeuN の 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 で は ,PBS で 200 倍 に 希 釈 し た 抗 BrdU 抗 体 (abcam， UK)と 100 倍 に 希 釈 し た 抗 NeuN 抗 体 （ Millipore, USA） を 用 い て 4℃ で 2 日 間 反 応 さ せ た . PBS で 洗 浄 後 ,PBS で 100 倍 に 希 釈 し た anti-sheep IgG RITC (Santa Cruz, USA)と anti - mouse IgG FITC (Millipore, USA)を 用 い て ,遮 光 下 に て 室 温 で 2 時 間 反 応 さ せ た . 一 方 ， BrdU と GFAP の 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 で は ,PBS で 200 倍 に 希 釈 し た 抗 BrdU 抗 体 と 1000 倍 に 希 釈 し た 抗 GFAP 抗 体 (Millipore, USA)を 用 い て 4℃ で 2 日 間 反 応 さ せ た ． PBS で 洗 浄 後 ,PBS で 100 倍 に 希 釈 し た anti–sheep IgG RITC (Santa Cruz, USA)と anti rabbit IgG FITC (Santa Cruz,USA)を 用 い て ,遮 光 下 に て 室 温 で 二 時 間 反 応 さ せ た . 再 び PBS で 切 片 を 洗 浄 し , 遮 光 下 で 封 入 (Aqua Poly/Mount, Polysciences ,USA)し た .
Lee ら の 方 法 に 準 じ て 3 6 )作 成 し た 海 馬 の 連 続 切 片 に お い て 8 枚 ご と （ 120µm 間 隔 ） に 1 枚 の 切 片 を 選 び 出 し ， 計 8 枚 の 切 片 に つ い て 左 側 海 馬 歯 状
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回 の BrdU 細 胞 数 を カ ウ ン ト し た (各 群 ， n＝ 5)．
BrdU 陽 性 細 胞 50 個 に 対 す る BrdU 陽 性 か つ NeuN 陽 性 細 胞 と BrdU 陽 性 か つ GFAP 陽 性 細 胞 数 の 比 率 を そ れ ぞ れ の 神 経 細 胞 と 星 状 膠 細 胞 の 分 化 率 と し
た 3 6 )．
9.統 計 学 的 処 理
Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト の 結 果 の 統 計 処 理 に は ， repeated measure ANOVA を 用 い た ． AVPmRNA の 発 現 率 ， 血 中 CO 濃 度 ， ホ ー ル ボ ー ド テ ス ト の 結 果 ， 新 生 細 胞 数 ， 新 生 細 胞 の 生 存 数 お よ び 新 生 細 胞 の 分 化 率 は ， One-way-factorial ANOVA 後 ， 有 意 差 の あ る も の は ， Tukey に よ る 多 重 比 較 検 定 を 行 っ た ．
P
<0.05 を 有 意 差 が あ る も の と 判 定 し た ．15
結 果
1.母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA シ グ ナ ル 発 現 率
各 群 の 母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA の 染 色 像 の 一 例 を 図 1 に 示 す ． 各 群 の 母 マ ウ ス の PVN で AVPmRNA が 染 色 さ れ た ． 咀 嚼 群 の 母 マ ウ ス に お け る AVPmRNA は ス ト レ ス 群 の 母 マ ウ ス と 比 較 し て 減 少 し て い る よ う に 思 わ れ た ．
図 1 各 群 の 母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA の 組 織 像 ． Bars:100
μ
mコ ン ト ロ ー ル 群 ス ト レ ス 群 咀 嚼 群
16
図 2 各 群 の 母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA の 発 現 率
各 群 の 母 マ ウ ス の PVN に お け る AVPmRNA の 発 現 率 の 結 果 を 図 2 に 示 す ． コ ン ト ロ ー ル 群 の 母 マ ウ ス の AVPmRNA の 発 現 率 を 100％ に し た と き ， ス ト レ ス 群 の 母 マ ウ ス の AVPmRNA の 発 現 率 は 約 296％
で 多 く な り （
P
<0.01）， 咀 嚼 群 で は 約 111％ で あ っ た ． 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 に は 有 意 差 が 認 め ら れ な か っ た ．※ ※
P
＜ 0.01 mean(SD)17
2.各 群 の 母 マ ウ ス に お け る 血 中 CO 濃 度
各 群 の 母 マ ウ ス に お け る 血 中 CO 濃 度 の 結 果 を 図 3 に 示 す ． 咀 嚼 群 の 母 マ ウ ス の 血 中 CO 濃 度 は ， ス ト レ ス 群 の 母 マ ウ ス の 約 52％ で あ っ た（
P
<0.01)．咀 嚼 群 の 母 マ ウ ス と コ ン ト ロ ー ル 群 の 母 マ ウ ス と の 間 で 血 中 CO 濃 度 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た ．
図 3 各 群 の 母 マ ウ ス に お け る 血 中 CO 濃 度
※ ※
P
＜ 0.01 mean(SD)18
3.ホ ー ル ボ ー ド 試 験
ホ ー ル ボ ー ド 試 験 に お け る 各 群 の マ ウ ス の 5 分 間 の 移 動 軌 跡 の 典 型 例 を 図 4 に 示 す ． ス ト レ ス 群 の マ ウ ス は 動 き 回 ら な か っ た が ， コ ン ト ロ ー ル 群 や 咀 嚼 群 で は 板 上 を く ま な く 移 動 し て い る こ と が 観 察 さ れ た ．
図 4 各 群 の 5 分 間 で の 移 動 軌 跡 の 典 型 例
各 群 の ホ ー ル ボ ー ド 試 験 に お け る 5 分 間 で 穴 を 覗 く 回 数 を 図 5 に 示 す ． 咀 嚼 群 の 5 分 間 で 穴 を 覗 く 回 数 は ス ト レ ス 群 と 比 較 し て 有 意 に 多 か っ た
（
P
<0.01)． ま た ， ス ト レ ス 群 の 穴 を 覗 く 回 数 は コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 べ て 有 意 に 少 な か っ た が（
P
<0.01)， に 有 意 な 差 （P
<0.01)が ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 間 で は 有 意 な 差 は み ら れ な か っ た ．コ ン ト ロ ー ル 群 ス ト レ ス 群 咀 嚼 群
19
図 5 各 群 に お け る 5 分 間 で の 穴 を 覗 く 回 数
※ ※
P
＜ 0.01 mean(SD)20
4.Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト の 結 果
Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト の 結 果 を 図 6A に 示 す ． 咀 嚼 群 の プ ラ ッ ト フ ォ ー ム へ の 到 達 時 間 は ス ト レ ス 群 と 比 較 し て 有 意 に 減 少 し た （
P
＜ 0.05）． プ ラ ッ ト フ ォ ー ム へ の 到 達 時 間 に お い て ， ス ト レ ス 群 は コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 べ て 有 意 に 延 長 し た （P
＜ 0.05） が ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 に は 有 意 な 差 は み ら れ な か っ た ．Visible Probe Test を 行 っ た 結 果 （ 図 6B）， 3 群 の 間 で プ ラ ッ ト フ ォ ー ム へ の 到 達 時 間 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た ．
21
図 6 Morris 水 迷 路 テ ス ト の 結 果
（ A） 1 日 4 回 の 平 均 到 達 時 間 ．
（ B） Visible Probe Test の 結 果 ．
※
P
＜ 0.05 mean(SD)22
5.母 体 ス ト レ ス 負 荷 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 生 ま れ た 仔 の 新 生 細 胞 の 増 殖 に 及 ぼ す 影 響
各 群 の 海 馬 歯 状 回 に お け る BrdU 陽 性 細 胞 の 免 疫 組 織 染 色 像 の 一 例 を 図 7 に 示 す ． 咀 嚼 群 の 新 生 細 胞 が ス ト レ ス 群 と 比 較 し て 増 加 し て い る よ う な 所 見 が 得 ら れ た ．
図 7 各 群 に お け る 海 馬 歯 状 回 (DG)に お け る BrdU 陽 性 細 胞 の 組 織 像 ． Bars:100
μ
mコ ン ト ロ ー ル 群 ス ト レ ス 群 咀 嚼 群
23
図 8 各 群 に お け る 新 生 細 胞 増 殖 数
図 8 は 各 群 の DG 領 域 の 新 生 細 胞 の 増 殖 数 を 示 す ． 咀 嚼 群 の 新 生 細 胞 増 殖 数 は ス ト レ ス 群 の 約 130％
で あ っ た （
P
＜ 0.01）． コ ン ト ロ ー ル 群 の 新 生 細 胞 数 は ス ト レ ス 群 に 比 較 し て 有 意 に 多 か っ た が （P
＜ 0.01）， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 新 生 細 胞 増 殖 数 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た ．
※ ※
P
＜ 0.01 mean(SD)24
6.母 体 ス ト レ ス 負 荷 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 生 ま れ た 仔 の 新 生 細 胞 の 生 存 に 及 ぼ す 影 響
各 群 の BrdU 投 与 21 日 後 の BrdU 陽 性 細 胞 数 を 図 9 に 示 す ． 咀 嚼 群 の BrdU 陽 性 細 胞 数 は ス ト レ ス 群 と 比 較 し て 有 意 に 多 か っ た （
P
＜ 0.01）． BrdU 陽 性 細 胞 数 は コ ン ト ロ ー ル 群 と ス ト レ ス 群 の 間 で 有 意 な 差 （P
＜ 0.01） を 認 め た が ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 有 意 な 差 は み ら れ な か っ た ．図 9 各 群 に お け る 新 生 細 胞 生 存 数
※ ※
P
＜ 0.01 mean(SD)25
7.母 体 ス ト レ ス 負 荷 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 生 ま れ た 仔 の 新 生 細 胞 の 分 化 に 及 ぼ す 影 響
各 群 の 海 馬 歯 状 回 領 域 で 神 経 細 胞 や 星 状 膠 細 胞 に 分 化 し た 細 胞 が 認 め ら れ た ．図 10 は BrdU と NeuN も し く は BrdU と GFAP の 二 重 染 色 に よ っ て 染 色 さ れ た 神 経 細 胞 と 星 状 膠 細 胞 の 一 例 を そ れ ぞ れ 示 し て い る ．
図 10 免 疫 蛍 光 二 重 染 色 像
a:BrdU+/NeuN+,b:BrdU+,c:NeuN+,d:BrdU+/GFAP+
e: BrdU+, f: GFAP+. Bars: 100μ m
26
図 11 各 群 に お け る 新 生 細 胞 分 化 率
図 11 は 海 馬 歯 状 回 に お け る 新 生 細 胞 か ら 神 経 細 胞 や 星 状 膠 細 胞 へ の 分 化 率 を 示 し て い る ． 咀 嚼 群 の 新 生 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 は 約 78％ で ス ト レ ス 群 と 比 較 し て 有 意 （
P
＜ 0.01） に 高 い 分 化 率 を 示 し た ． ま た ， コ ン ト ロ ー ル 群 の 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 は ス ト レ ス 群 よ り 有 意 （P
＜ 0.01） に 高 い 値 を 示 し た が ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で は 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た ．こ れ に 対 し て ， 新 生 細 胞 か ら 星 状 膠 細 胞 へ の 分 化 率 は 3 群 の 間 で 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た ．
※ ※
P
＜ 0.01 mean(SD)27
考 察
今 回 使 用 し た ddY マ ウ ス は ， ク ロ ー ズ ド コ ロ ニ ー と し て 維 持 さ れ て い る 非 近 交 系 マ ウ ス で あ り ，
様 々 な 研 究 に 広 く 用 い ら れ て い る も の で あ る 2 6 )． 動 物 に 加 わ る ス ト レ ス の 大 き さ を 調 べ る た め に
CO レ ベ ル の 測 定 を 行 っ た ． ス ト レ ス が 生 体 に 加 わ る と 視 床 下 部 -下 垂 体 -副 腎 皮 質 系 （ HPA 系 ） が 活 性 化 さ れ ， グ ル コ コ ル チ コ イ ド が 分 泌 さ れ ， ス ト レ ス 応 答 が 開 始 さ れ る 3 ). 齧 歯 類 で は ,グ ル コ コ ル チ コ イ ド の う ち CO が 最 も 強 い 生 理 作 用 を 示 す と 言 わ れ て い る 3 7 )． ま た ， CO 濃 度 は 20 時 に 最 高 値 に な る と 報 告 さ れ て い る 3 8 )た め ， 各 群 の 母 マ ウ ス の 採 血 は 20 時 に 行 っ た ．
ホ ー ル ボ ー ド 試 験 に お け る 穴 覗 き 行 動 は ， ス ト レ ス 刺 激 に 対 し て 高 い 感 受 性 を 有 し ， 穴 を 覗 く 回 数 が 情 動 機 能 と 相 関 す る と 言 わ れ て い る た め 2 9 )， 今 回 の 実 験 で は ， 仔 マ ウ ス の 情 動 性 を 調 べ る た め に 行 っ た ． な お ， ホ ー ル ボ ー ド 試 験 に お い て 試 行 回 数 が 増 え る に 従 っ て 動 物 の 情 動 反 応 が 低 下 す る こ と が 明 ら か に な っ て い る 2 9 )た め ， 各 マ ウ ス に つ き 1 度 の み ホ ー ル ボ ー ド 試 験 を 実 施 し た ．
ス ト レ ス 曝 露 下 の 妊 娠 マ ウ ス に 咀 嚼 様 刺 激 を 与 え る と ， 母 体 の PVN に お け る AVPmRNA の 発 現 量 が 減 少 し ， 血 中 の CO 濃 度 が 顕 著 に 低 下 し た ． ま た ，
28
ス ト レ ス 下 で 咀 嚼 様 刺 激 を 与 え た 妊 娠 マ ウ ス か ら 生 ま れ た 仔 マ ウ ス で は ス ト レ ス 性 に 惹 起 さ れ る 情 動 機 能 ， 空 間 認 知 能 お よ び 海 馬 に お け る 神 経 細 胞 新 生 機 構 の 障 害 が 抑 制 さ れ た ．
PVN は HPA 系 の 制 御 核 で あ り ， PVN の 小 神 経 細 胞 群 の 細 胞 が CRH と AVP と い う 2 種 類 の ホ ル モ ン を 分 泌 し て い る 4 )． 生 体 に ス ト レ ス が 負 荷 さ れ る と ， 小 神 経 細 胞 群 の 細 胞 か ら CRH が 分 泌 さ れ る ． CRH は 下 垂 体 前 葉 の CRH 受 容 体 に 結 合 し て ， 下 垂 体 か ら 副 腎 皮 質 刺 激 ホ ル モ ン （ ACTH） の 分 泌 が 促 さ れ る 4 )． 下 垂 体 か ら 分 泌 さ れ た ACTH は 副 腎 皮 質 の 細 胞 を 刺 激 し ， グ ル コ コ ル チ コ イ ド の 放 出 を 促 進 さ せ る 4 )． し か し ， 慢 性 ス ト レ ス の よ う に ス ト レ ス が 長 期 間 持 続 す る よ う な 場 合 ， 小 細 胞 群 の 細 胞 は AVP を 分 泌 し ACTH の 分 泌 を 調 整 し て い る 4 )． つ ま り ， CRH は 急 性 ス ト レ ス 時 に ， AVP は 慢 性 ス ト レ ス 下 で HPA 系 の 活 性 化 に 関 与 し て い る こ と に な る ． 本 実 験 に お い て ， ス ト レ ス 群 の 母 マ ウ ス の PVN の AVPmRNA の 発 現 量 が 増 加 し ， 血 中 CO 濃 度 も 上 昇 し て い た こ と か ら ， 本 研 究 で 妊 娠 マ ウ ス に 負 荷 し た 拘 束 ス ト レ ス は 慢 性 ス ト レ ス と し て 作 用 し て い る も の と 考 え ら れ た ．
一 方 ， Kaneko ら 3 9 )や Hori ら 1 9 )は ， 45 分 間 の 拘 束 ス ト レ ス 条 件 下 で ラ ッ ト に 木 製 の 棒 を 噛 ま せ る と ， ス ト レ ス に よ っ て PVN で 増 加 す る Fos 発 現
29
の 増 強 と CRH 陽 性 細 胞 数 の 増 加 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し て い る ． ま た ， 3 週 間 の 拘 束 ス ト レ ス 負 荷 中 に 木 の 爪 楊 枝 を 噛 ま せ た マ ウ ス で は ， ス ト レ ス 性 に 引 き 起 こ さ れ る 血 中 CO 濃 度 の 上 昇 が 抑 制 さ れ る こ と が 示 さ れ て い る 2 2 )． 本 実 験 に お い て ， 咀 嚼 群 の 母 マ ウ ス の PVN で AVPmRNA の 発 現 率 が 低 下 し ， 血 中 CO 濃 度 が コ ン ト ロ ー ル 群 の 母 マ ウ ス の レ ベ ル ま で 低 下 し た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， 咀 嚼 様 刺 激 は 急 性 お よ び 慢 性 ス ト レ ス を 緩 和 す る だ け で は な く ， 妊 娠 中 と い う 特 殊 な 条 件 下 で も 母 体 の ス ト レ ス 抑 制 作 用 を 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た ．
情 動 障 害 が 認 め ら れ る ラ ッ ト や マ ウ ス で は ， ホ ー ル ボ ー ド 試 験 に お い て 穴 を 覗 く 回 数 が 顕 著 に 減 少 す る と い わ れ て い る 4 0 , 4 1 )． Maccari ら は ， 妊 娠 中 に 母 体 が ス ト レ ス に 曝 さ れ る と 生 ま れ て く る 仔 の 情 動 機 能 が 障 害 さ れ る と 指 摘 し て い る 1 0 )． ま た ， 妊 娠 中 に ス ト レ ス を 被 っ た 母 親 か ら 生 ま れ た 仔 ラ ッ ト や マ ウ ス で は 空 間 認 知 障 害 や 海 馬 歯 状 回 に お け る 細 胞 増 殖 ， 新 生 細 胞 の 生 存 お よ び 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 が 障 害 さ れ る が ， 星 状 膠 細 胞 へ の 分 化 率 に 変 化 が み ら れ な い こ と が 報 告 さ れ て い る 7 , 1 5 )． 本 研 究 で は ス ト レ ス 群 の 情 動 機 能 と 空 間 認 知 能 が 顕 著 に 低 下 し ， 海 馬 に お け る 細 胞 増 殖 ， 生 存 ， 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 の 障 害 が み ら れ ， こ れ ま で の 報 告 と よ く 一 致 し て い た ．
30
歯 状 回 で 誕 生 し た 新 生 細 胞 は 神 経 細 胞 や 星 状 膠 細 胞 に 分 化 し 3 4 )， 神 経 細 胞 は ， 1～ 3 週 間 程 度 で 苔 状 線 維 回 路 に 軸 索 を 伸 ば し 神 経 ネ ッ ト ワ ー ク を 形 成 し ， 空 間 認 知 能 を は じ め と す る 海 馬 機 能 に 関 与 す る よ う に な る と い わ れ て い る 4 2 )． 海 馬 歯 状 回 に お け る 神 経 細 胞 新 生 機 構 は 海 馬 へ の 神 経 細 胞 供 給 と 神 経 ネ ッ ト ワ ー ク の 維 持 ・ 再 構 築 機 能 上 極 め て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と 考 え ら れ て い る 4 2 )． こ の 神 経 細 胞 新 生 機 構 は ホ ル モ ン や ス ト レ ス な ど の 環 境 変 化 に 極 め て 敏 感 で 4 3 )， 例 え ば ， ス ト レ ス の 負 荷 や CO の 投 与 は 新 生 細 胞 の 増 殖 ， 生 存 ， 分 化 を 抑 制 し ， 広 い ケ ー ジ で の 飼 育 や 木 ， チ ュ ー ブ 等 の ケ ー ジ 内 へ の 設 置 等 豊 か な 環 境 で の 飼 育 や 学 習 課 題 の 実 施 は 新 生 細 胞 の 生 存 率 を 高 め る こ と が わ か っ て い る 4 4 , 4 5 )． 海 馬 に お け る 細 胞 増 殖 数 と 空 間 認 知 能 と は 密 接 に 関 係 し て い る こ と 7 )や う つ 様 病 状 を 呈 す る 動 物 で は 海 馬 に お け る 細 胞 増 殖 能 が 顕 著 に 低 下 し て い る こ と か ら ， 海 馬 歯 状 回 で の 細 胞 増 殖 と 情 動 機 能 と の リ ン ク も 示 唆 さ れ て い る 1 5 )． 本 研 究 結 果 は こ れ ら の 報 告 と よ く 一 致 し て お り ， 情 動 反 応 や 空 間 認 知 能 は 海 馬 歯 状 回 に お け る 神 経 細 胞 新 生 機 構 の 影 響 を 受 け る こ と が 示 唆 さ れ た ．
妊 娠 ス ト レ ス に よ る 仔 の 情 動 お よ び 空 間 認 知 障 害 は 発 達 期 の 胎 児 の 脳 が ス ト レ ス に よ っ て 上 昇 し た 母 体 の CO に 曝 さ れ る た め に ， 仔 の HPA 系 の 反 応
31
異 常 が 生 じ る と い う グ ル コ コ ル チ コ イ ド プ ロ グ ラ ミ ン グ 説 1 6 , 1 7 )で 説 明 さ れ て い る ． Donnell ら は ， 妊 娠 中 に 母 体 が ス ト レ ス に 曝 さ れ る と ， 母 体 血 液 中 に 増 加 し た CO が 胎 盤 を 通 じ て 母 体 か ら 胎 児 へ と 移 行 す る と 報 告 し て い る 4 6 )．
グ ル コ コ ル チ コ イ ド 受 容 体 （ 以 下 ， GRs） は 脳 全 体 に 分 布 し ， 特 に 海 馬 の GRs 密 度 は 高 く 4 7 )， 海 馬 の GRs が CO と 結 合 す る と ， HPA 系 の 視 床 下 部 に 対 し て ネ ガ テ ィ ブ フ ィ ー ド バ ッ ク が 働 く ． 海 馬 は グ ル コ コ ル チ コ イ ド レ ベ ル の 上 昇 に 敏 感 で あ り 4 8 )， CO 移 行 が 遷 延 す る と ， 海 馬 GRs と GRmRNA の ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー シ ョ ン が お こ り 4 9 , 5 0 )， 胎 児 の HPA 系 の 負 の フ ィ ー ド バ ッ ク 機 構 が 障 害 さ れ る 5 1 )． こ の 結 果 ， 血 中 の CO 濃 度 の 上 昇 が 持 続 し ， CO に よ る 神 経 毒 性 に よ る 海 馬 の 神 経 細 胞 死 が 惹 起 さ れ 5 0 )， 海 馬 機 能 が 低 下 し ， さ ら に HPA 系 の 制 御 が 難 し く な る と い う 悪 循 環 を 引 き 起 こ す 5 1 )． 一 方 ， 咀 嚼 群 で は ス ト レ ス 群 で 認 め ら れ た 情 動 機 能 障 害 ， 空 間 認 知 能 の 障 害 や 海 馬 に お け る 神 経 細 胞 新 生 機 構 の 障 害 が 抑 制 さ れ た ．
視 床 下 部 室 傍 核 の CRF 分 泌 細 胞 は HPA axis を コ ン ト ロ ー ル す る と と も に 大 脳 辺 縁 系 と も 線 維 連 絡 し て い る 5 2 )． 延 髄 の A1 と A2 に 存 在 す る ノ ル ア ド レ ナ リ ン 分 泌 細 胞 は 視 床 下 部 の PVN に 直 接 線 維 連
絡 し 5 2 )， 中 脳 の 青 斑 核 由 来 の ノ ル ア ド レ ナ リ ン 線
32
維 は 大 脳 皮 質 や 大 脳 辺 縁 系 に 投 射 さ れ て い る 5 2 ). ス ト レ ス 条 件 下 で は 中 脳 の A1 に 存 在 す る ノ ル ア ド レ ナ リ ン 分 泌 細 胞 が CO の 分 泌 を 促 し ス ト レ ス 反 応 を 強 め る と い わ れ て い る 5 2 )． ま た ， 拘 束 ス ト レ ス は 青 斑 核 の ノ ル ア ド レ ナ リ ン 分 泌 細 胞 の 活 性 を 顕 著 に 上 昇 さ せ る こ と も 報 告 さ れ て い る 5 2 )．
こ れ に 対 し て ， ス ト レ ス 下 の 咀 嚼 様 刺 激 は ス ト レ ス 性 に 上 昇 す る 前 頭 前 野 や 扁 桃 体 の 活 性 を 抑 制
し 1 9 , 3 8 )， 咀 嚼 運 動 が 視 床 下 部 ， 扁 桃 体 ， 大 脳 皮 質
な ど の 脳 部 位 に お け る ノ ル ア ド レ ナ リ ン の 代 謝 や 血 中 CO 濃 度 の 上 昇 を 抑 制 す る こ と が 確 認 さ れ て
い る 2 4 )． さ ら に ， 拘 束 ス ト レ ス 下 の 咀 嚼 様 刺 激 は
視 床 下 部 PVN に お け る CRF 陽 性 細 胞 数 や fos 陽 性 細 胞 数 の 発 現 を 抑 制 す る だ け で は な く 5 3 , 5 4 )， 海 馬 に お け る グ ル コ コ ル チ コ イ ド レ セ プ タ ー の 密 度 を 高 め る と 報 告 さ れ て い る 2 4 ) ． こ れ 以 外 に も Tail-pinch ス ト レ ス や cold -restraint 中 の 積 極 的 な 咀 嚼 運 動 は 線 条 体 の ド ー パ ミ ン の 代 謝 を 高 め
5 3 , 5 4 )， 視 床 下 部 や 辺 縁 系 に お け る ノ ル ア ド レ ナ リ
ン の 代 謝 を 上 昇 さ せ る と と も に ス ト レ ス 性 の 胃 潰 瘍 の 発 生 を 抑 制 す る 5 5 )． こ れ ら の 報 告 か ら ， ス ト レ ス 下 の 咀 嚼 様 刺 激 は 青 斑 核 の 求 心 性 経 路 を 含 め ノ ル ア ド レ ナ リ ン 神 経 系 を 抑 制 す る こ と に よ っ て ス ト レ ス を 緩 和 し て い る の か も し れ な い ．
神 経 細 胞 の 軸 索 に 分 布 す る 分 泌 顆 粒 に 含 ま れ て
33
い る 脳 由 来 神 経 栄 養 因 子 （ Brain-derived neurotrophic factor: BDNF） は 神 経 細 胞 の 生 存 ・ 分 化 ， 神 経 回 路 の 発 達 ・ 機 能 な ど の 調 節 に 必 須 な 分 泌 性 の ポ リ ペ プ チ ド で う つ 病 ， 統 合 失 調 症 ， 発 達 障 害 ， ア ル ツ ハ イ マ ー な ど の 精 神 神 経 疾 患 と の 関 連 も 示 唆 さ れ る 物 質 で あ る 5 6 )． そ の た め ， BDNF は ， 海 馬 歯 状 回 に お け る 細 胞 新 生 機 構 に 影 響 を 与 え て い る と い わ れ て い る 5 6 )． 妊 娠 ス ト レ ス 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 仔 の BDNF の 発 現 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ る と と も に ， 仔 の HPA 系 の 正 常 化 機 構 を 明 ら か に し ， 動 態 を 解 析 す る こ と が 今 後 の 課 題 で あ る ．
34
結 論
ddY マ ウ ス を 用 い て ，妊 娠 中 の 咀 嚼 様 刺 激 が 新 生 仔 （ 4 か 月 齢 ） の 母 体 ス ト レ ス 性 脳 機 能 障 害 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 結 果 ， 以 下 の 結 論 を 得 た ． 1） AVPmRNA の 発 現 率 は ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル
群 の 母 マ ウ ス と の 間 で 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 の 母 マ ウ ス は 有 意 に 増 加 し た ．
2） 血 中 CO 濃 度 は ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 の 母 マ ウ ス と の 間 で 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 の 母 マ ウ ス は 有 意 に 増 加 し た ．
3） ホ ー ル ボ ー ド 試 験 は ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 穴 を 覗 く 回 数 に 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 で は 有 意 に 減 少 し た ．
4） Morris 水 迷 路 学 習 テ ス ト を 行 い ， 新 生 仔 の 空 間 認 知 能 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 結 果 ， プ ラ ッ ト フ ォ ー ム へ の 到 達 時 間 は ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 で は 有 意 に 増 加 し た ．
5） 新 生 細 胞 増 殖 数 は ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 で は 有 意 に 減 少 し た ．
6） 新 生 細 胞 の 誕 生 21 日 後 の 生 存 数 は ， 咀 嚼 群 と
35
コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 で は 有 意 に 減 少 し た ．
7） 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 は ， 咀 嚼 群 と コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 差 は な か っ た が ， ス ト レ ス 群 で は 有 意 に 減 少 し た ． 星 状 膠 細 胞 へ の 分 化 率 は 3 群 間 で 差 は な か っ た ．
以 上 の 結 果 か ら ， ス ト レ ス 下 に あ る 妊 娠 母 体 に 咀 嚼 運 動 を 行 わ せ る こ と で 子 の 脳 機 能 障 害 が 予 防 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．
36
引 用 文 献
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