論文 内 容の 要旨
医 薬 品 開 発 の 観 点 か ら 難 吸 収 性 薬 物 の 腸 管 吸 収 の 改 善 は 古 く か ら の 重 要 な 研 究 課 題 と さ れ て き た 。 こ れ ま で の 取 り 組 み の 内 で 、 そ の 改 善 方 法 の 一 つ と し て 、 薬 物 の 消 化 管 粘 膜 透 過 性 を 上 昇 さ せ る 吸 収 促 進 剤 の 利 用 が あ る 。 し か し 、 吸 収 促 進 剤 の 多 く は 細 胞 膜 障 害 性 が 高 く 、 不 可 逆 的 な 消 化 管 粘 膜 の 機 能 障 害 を 惹 起 す る た め 、 臨 床 応 用 さ れ た 例 は ご く わ ず か に 限 ら れ る 。 し か し 近 年 、 有 効 濃 度 域 に お い て 粘 膜 障 害 性 が 低 く 、 さ ら に 従 来 の 吸 収 促 進 剤 に 比 べ て 部 位 特 異 性 の 低 い 、 一 酸 化 窒 素 （NO） 供 与 体 を 吸 収 促 進 剤 と し て 利 用 す る 試 み が 注 目 を 集 め て い る 。 こ れ ま で に NO 供 与 体 と 水 溶 性 高 分 子 化 合 物 や ペ プ チ ド 性 医 薬 品 な ど を 併 用 投 与 す る こ と で 腸 管 か ら の 吸 収 率 が 増 大 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 こ の NO に よ る 吸 収 促 進 効 果 は 、 消 化 管 上 皮 細 胞 の 密 着 結 合 （tight junction） 開 口 を 介 し た 細 胞 間 隙 経 路 （ paracellular route） の 透 過 性 の 上 昇 と 考 え ら れ 、 主 に 難 吸 収 性 水 溶 性 薬 物 の 膜 透 過 性 改 善 に 対 す る 効 果 と 応 用 が 期 待 さ れ て い る 。 し か し 、 詳 細 な 吸 収 促 進 機 構 は 未 だ 明 ら か に さ れ て お ら ず 、 実 用 化 に 至 っ て い な い 。ま た 、NO に よ る 吸 収 促 進 に 関 す る 研 究 は 、paracellular route を 介 し た 薬 物 吸 収 に お い て の み 展 開 さ れ て き て い る 一 方 、 細 胞 内 経 路 （transcellular route） を 介 し た 薬 物 吸 収 へ の 影 響 は 検 討 さ れ て い な い 現 状 で あ る 。溶 性 薬 物 の 腸 管 粘 膜 透 過 に 及 ぼ す SNP の 影 響 を 評 価 し た 。 第 1 節 SNP の 腸 管 粘 膜 に 及 ぼ す 影 響 ： SNP の 吸 収 促 進 効 果 を 検 討 す る 前 段 階 と し て 、SNP が 腸 管 粘 膜 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 、ラ ッ ト 腸 管 を 用 い て 生 化 学 的 及 び 組 織 学 的 な 検 討 を 行 っ た 。 腸 管 loop 内 へ 投 与 さ れ た SNP は 用 量 依 存 的 に NO を 放 出 す る こ と が 示 さ れ た 。ま た 、SNP は 1 mg/kg 及 び 10 mg/kg の 用 量 で は 有 意 な 粘 膜 障 害 性 が 認 め ら れ な か っ た が 、100 mg/kg の 高 用 量 に お い て 、 粘 膜 中 の 総 タ ン パ ク 含 量 の 有 意 な 減 少 は 無 い も の の 、 粘 膜 構 造 の 変 化 及 び リ ン 脂 質 の 脱 落 増 加 を 伴 う 粘 膜 障 害 が 示 さ れ た 。 第 2 節 SNP に よ る 吸 収 促 進 効 果 ： SNP に よ る 吸 収 促 進 効 果 を 明 ら か に す る た め 、 SNP 併 用 時 に お け る 薬 物 の 吸 収 量 変 化 を 検 討 し た（ Fig. 1）。Paracellular route を 介 し て 吸 収 さ れ る fluorescein isothiocyanate–dextran 4000 (FD-4) の 吸 収 は 、SNP 併 用 に よ っ て 増 大 す る こ と が 示 さ れ た 。 こ の 効 果 は 、 吸 収 促 進 効 果 が あ る と 報 告 さ れ て い る 他 の NO 供 与 体 併 用 時 に お い て も 同 様 に 観 察 さ れ 、 さ ら に sodium ferrocyanide (SFC) 投 与 群 と の 比 較 に よ り 、 NO を 介 し た paracellular route の 透 過 性 亢 進 に 起 因 す る と 考 え ら れ た 。 ま た 、tight junction 構 成 タ ン パ ク 質 の 一 種 で あ る claudin の タ ン パ ク 質 発 現 量 解 析 の 結 果 、NO の 効 果 は tight junction 構 成 タ ン パ ク 質 の 直 接 的 な 発 現 低 下 に よ る も の で は な い こ と が 示 さ れ た 。 一 方 で 、SNP 除 去 後 は 細 胞 膜 電 気 抵 抗 に 影 響 が な く 、吸 収 促 進 効 果 が 速 や か に 減 弱 す る こ と が 示 さ れ 、SNP に よ る 吸 収 促 進 作 用 は 可 逆 的 か つ 短 期 的 な 作 用 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 以 上 よ り 、SNP の 可 逆 的 な 吸 収 促 進 作 用 は 、 安 全 性 が 高 く 、 吸 収 促 進 剤 と し て 有 用 性 が 高 い と 考 え ら れ た 。 第 2 章 難 溶 解 性 脂 溶 性 薬 物 の 腸 管 粘 膜 透 過 に 及 ぼ す NO の 影 響 近 年 の 医 薬 品 開 発 の 進 展 に 伴 い 、 開 発 さ れ た 候 補 化 合 物 の 多 く は 難 溶 解 性 ・ 高 脂 溶 性 を 示 す Biopharmaceutics Classification System (BCS) Class II に 分 類 さ れ る 化 合 物 が 急 増 し て い る の が 現 状 で あ る 。 こ れ ら 化 合 物 の 腸 管 粘 膜 透 過 機 構 は 、 一 般 に transcellular route を 介 し た 受 動 拡 散 に よ る も の と 考 え ら れ て い る が 、吸 収 改 善 の 方 策 は 溶 解 速 度 の 向 上 や 微 粒 子 化 な ど の 製 剤 的 手 法 に 限 ら れ る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 transcellular route を 介 し た 薬 物 吸 収 に 対 す る NO の 影 響 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し 、 難 溶 解 性 脂 溶 性 薬 物 の 腸 管 粘 膜 透 過 に 及 ぼ す NO の 影 響 を 検 討 し た 。 特 に 、受 動 拡 散 及 び 排 出 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー に 対 す る 影 響 に 焦 点 を 置 き な が ら 、 吸 収 促 進 剤 と
Fig. 1 E ffect o f SNP o n A UC0 - 6 0 (a) and AUC1 2 0 - 1 8 0 (b) o f
し て 有 用 性 拡 大 の 可 能 性 を 検 討 し た 。
第 1 節 受 動 拡 散 に 対 す る NO の 影 響 ： NO 供 与 体 と し て 1-hydroxy-2-oxo-3-(N- methyl-3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene (NOC7) を 、transcellular route の モ デ ル 薬 物 と し て 脂 溶 性 及 び 膜 透 過 性 が 高 い griseofulvin (logP = 2.18) を 選 択 し 、in vitro の 評 価 系 を 用 い て 難 溶 解 性 脂 溶 性 薬 物 の 腸 管 膜 透 過 性 に 対 す る NO 供 与 体 処 理 の 影 響 を 検 討 し た （Table 1）。 Griseofulvin の 膜 透 過 性 に 対 す る NO の 影 響 は 、 十 二 指 腸 部 で 特 異 的 で あ る こ と が 示 さ れ 、paracellular route に 対 す る 作 用 機 序 と transcellular route に 対 す る 作 用 機 序 が 異 な る こ と が 示 唆 さ れ た 。続 い て 、十 二 指 腸 部 を 用 い て 脂 溶 性 の 異 な る 各 種 化 合 物 に 対 す る NO の 効 果 を 検 討 し た と こ ろ 、 NO に よ る 膜 透 過 性 の 変 化 率 は griseofulvin > diclofenac (logP = 1.13) > antipyrine (logP = 0.38) > theophylline (logP = -0.02) の 順 と な り 、脂 溶 性 が 高 い 薬 物 ほ ど NO に よ る 膜 透 過 性 亢 進 作 用 を 受 け 易 い こ と が 示 さ れ た （Fig. 2）。 一 方 、 FD-4 の 膜 透 過 性 に 対 し 、NOC7 前 処 理 に よ る 影 響 は 認 め ら れ ず 、 paracellular route に 対 し て 影 響 を 与 え な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ の よ う に 、 脂 溶 性 の 大 き さ に 応 じ て 効 果 が 強 く な る こ と か ら 、NO は transcellular route を 介 し た 受 動 拡 散 に よ る 腸 管 膜 透 過 を 制 御 す る 何 ら か の 因 子 に 対 し て 影 響 を 及 ぼ し て い る こ と が 示 さ れ た 。 腸 管 粘 膜 表 面 に は 水 溶 性 の 粘 液 層 で 構 成 さ れ る 非 攪 拌 水 層 の 存 在 が 知 ら れ て お り 、 難 溶 解 性 脂 溶 性 薬 物 の 膜 透 過 に 対 し て 制 御 因 子 と な る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 非 攪 拌 水 層 除 去 剤 で あ る dithiothreitol (DTT) 単 独 前 処 理 に よ る griseofulvin の 膜 透 過 性 は 上 昇 し 、 そ の 程 度 は NOC7 単 独 前 処 理 時 と 同 等 で あ っ た 。 こ れ に 対 し NOC7 と DTT の 併 用 前 処 理 時 に お い て は 併 用 に よ る 相 加 効 果 は 認 め ら れ な か っ た （Fig. 3a）。 さ ら に 、FD-4 の 膜 透 過 性 に 対 し 、NOC7 及 び DTT に よ る 影 響 は 認 め ら れ な か っ た（ Fig. 3b）。 DTT に よ る griseofulvin の 吸 収 促 進 効 果 は NO に よ る 効 果 と 同 様 に 腸 管 上 部 で 特 異 的 で あ る 傾 向 を 示 し 、DTT が 非 攪 拌 水 層 を 除 去 す る こ と に よ り 薬 物 の 膜 透 過 性 を 亢 進 す る こ と か ら 、NO と DTT の 作 用 点 が 共 に 非 攪 拌 水 層 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
Fig. 2 E ffect o f NOC 7 o n t he Pa p p of
hydropho bic drugs in r at duo de num.
Table 1 E ffect of NOC7 o n t he A UC0 - 1 2 0 and Pa p p of
十 二 指 腸 で の griseofulvin の 吸 収 に 対 す る NOC7 前 処 理 に よ る 吸 収 促 進 効 果 は 、ラ ッ ト whole body を 用 い た in situ の 評 価 系 に お い て も 認 め ら れ た （Fig. 4）。
以 上 の 結 果 よ り 、NO は transcellular route を 介 し た 受 動 拡 散 に よ る 薬 物 吸 収 に 対 し て 吸 収 促 進 効 果 を 有 す る こ と が 示 さ れ た 。 さ ら に 、 そ の 吸 収 促 進 機 構 と し て 、NO が 非 攪 拌 水 層 に 対 し て 影 響 を 与 え る こ と に よ っ て 、transcellular route を 介 し た 難 溶 解 性 脂 溶 性 薬 物 の 膜 透 過 性 を 増 大 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 非 攪 拌 水 層 の 透 過 性 を 制 御 す る こ と で 部 位 特 異 的 な 吸 収 促 進 効 果 が 望 め る と い う 新 た な 知 見 を 見 出 す こ と が で き た 。 第 2 節 P-glycoprotein（P-gp） に 対 す る NO 供 与 体 の 影 響 ： 排 出 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー に 対 し て は 、腸 管 上 皮 細 胞 膜 上 に 局 在 す る P-gp の 輸 送 活 性 に 対 す る SNP の 影 響 を 検 討 し た（Table 2）。P-gp 基 質 で あ る rhodamine 123 (Rho123) の 膜 透 過 性 に 対 す る SNP 併 用 の 影 響 を 評 価 し た と こ ろ 、 P-gp 非 依 存 的 に 膜 透 過 亢 進 作 用 を 有 す る こ と が 示 さ れ た 。 こ の こ と か ら 、SNP は P-gp 機 能 に 対 し て 影 響 を 及 ぼ さ な い こ と が 示 さ れ た 。 総 括 本 研 究 で は 、難 吸 収 性 水 溶 性 薬 物 の 腸 管 粘 膜 透 過 に 対 し て 、SNP が 吸 収 促 進 効 果 を 示 し 、 そ の 効 果 は NO に 起 因 す る paracellular route の 透 過 性 亢 進 で あ る こ と が 明 ら
Fig. 3 E ffect o f NOC 7 or DTT o n the Pa p p of (a) gris eofulvin and (b) FD -4 in rat duode num.
Fig. 4 E ffect of NOC7 on the duode nal abs orptio n of (a) griseofulvin and (b) FD-4.
か と な っ た 。 さ ら に 、 そ の 効 果 は 可 逆 的 か つ 短 期 的 な 作 用 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、NO は paracellular route だ け で な く 、 transcellular route に よ る 薬 物 吸 収 に 対 し て も 吸 収 促 進 効 果 を 有 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 特 に 、 非 攪 拌 水 層 の 拡 散 律 速 に よ り 腸 管 粘 膜 透 過 性 が 制 限 さ れ て い る 難 溶 解 性 脂 溶 性 薬 物 に 対 し 、 そ の 粘 膜 透 過 性 を 向 上 さ せ る こ と が で き る 新 規 の 吸 収 促 進 作 用 を 示 し た 。 以 上 、 本 検 討 で 得 ら れ た 成 果 は 、 新 規 吸 収 促 進 技 術 の 発 展 及 び 有 用 性 拡 大 に 有 益 な 情 報 と な る と 考 え ら れ る 。
【 研 究 結 果 の 掲 載 誌 】
1) Eur J Pharm Sci. 49:664-670 (2013)
2) Int J Pharm. 450:31-35 (2013).
論 文 審 査 の結 果 の要 旨
本 論 文 は 、 難 吸 収 性 薬 物 の 腸 管 吸 収 を 改 善 す る こ と を 目 的 と し て 、 細 胞 膜 非 透 過 性 の 水 溶 性 薬 物 に 対 し て 吸 収 促 進 効 果 が 認 め ら れ て い る 一 酸 化 窒 素（ NO）の 臨 床 応 用 の 可 能 性 な ら び に 細 胞 膜 透 過 性 の 脂 溶 性 薬 物 に 対 す る 新 た な 吸 収 促 進 剤 と し て の 有 用 性 に つ い て 検 討 し た も の で あ る 。
