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免疫を活性化する核酸医薬の効果をナノ粒子で増強する技術を開発
アレルギー疾患や感染症の治療への応用に期待 解禁日：平成24 年 7 月 26 日（木） 午後 10 時 平成24 年 7 月 24 日 独立行政法人 物質・材料研究機構 概要 1． 独立行政法人物質・材料研究機構（理事長：潮田資勝）ナノテクノロジー融合ステーション （ステーション長：花方信孝）は、免疫を活性化する核酸医薬の作用をナノ粒子によって増 強させる技術の開発に成功した。 2． 核酸医薬とは、DNA や RNA で作られた薬で、特定のタンパク質や塩基配列をピンポイント で狙う最先端の分子標的薬である。ガンやウィルス感染症、自己免疫疾患、花粉症などのア レルギー治療薬として期待が高い。今回の研究は、免疫の活性化作用を持つ核酸医薬の効果 をナノ粒子によって増強させる技術で、花粉症治療などへの応用を目指している。 3． 既に開発されている CpG ODN1)という核酸医薬には主に２つのタイプがある。ひとつは、 主にインターフェロン 2)を誘導するタイプ（インターフェロン型）であり、もうひとつは、 インターロイキン 6 3)を誘導するタイプ（インターロイキン型）である。インターフェロン やインターロイキン6 は、免疫活性化にかかわる物質である。ところが、免疫効果を高める 目的でこれら２つのタイプのCpG ODN を同時に使用しても、従来の方法では、インターフ ェロンとインターロイキン6 を同時に誘導することは不可能であった。 4． 今回の研究では、CpG ODN のインターロイキン型のみを用い、シリコンのナノ粒子に２つ の異なる結合方法で搭載し、この２つを同時に使用した。その結果、インターフェロンとイ ンターロイキン6 を同時に高いレベルで活性化させることに世界で初めて成功した。 5． ナノ粒子に薬剤を搭載して治療に応用する方法は、ドラッグデリバリーと呼ばれている。従 来、ドラッグデリバリーにおけるナノ粒子は、薬剤を目的の細胞や組織に送達し、そこで薬 剤を放出することが主な役割であった。今回の研究では、ナノ粒子が薬剤の搬送・放出機能 だけではなく、薬剤の効果の発現自体を制御可能という重要な役割をも担っている。 6． この成果は、感染症の治療、癌の免疫治療および花粉症などのアレルギー疾患の治療への応 用の可能性とともに、CpG ODN 以外の他の核酸医薬への応用も期待できる。 7． 本研究成果は、日本時間平成 24 年 7 月 26 日(木)22：00 に英国ネイチャー出版グループのオ ンラインジャーナルScientific Reports に公開される。 8． 本研究は、文部科学省のナノテクノロジーネットワーク事業として、インド・アンナ大学医 学物理部門との共同研究として行われた。ナノテクノロジーネットワーク事業は、施設・設 備の共用化による研究支援事業であり平成24 年 3 月で終了した。平成 24 年 7 月からは文部 科学省の新たな研究支援事業であるナノテクノロジープラットフォームが開始されている。2 研究の背景 核酸医薬は、核酸（DNA や RNA）が十数個から数十個つながった鎖状の構造をした薬である。 特定のタンパク質や塩基配列を認識して、病気の原因となる分子だけにピンポイントで作用する 分子標的薬という最先端の技術である。 その中のひとつに、CpG オリゴデオキシヌクレオチド（以下、CpG ODN と略す）というもの がある。これは外敵であるウィルスや細菌に特有の塩基配列、C-G を含むように合成された核酸 医薬の１つで、人間の免疫作用の活性化を目的とした薬である。人体はC-G を含む DNA 配列が 体内に入ると、細菌やウィルスが侵入したとみなし、免疫を活性化させることを利用している。 免疫システムを活性化する核酸医薬CpG ODN は、感染症の治療をはじめ、アレルギー疾患の治 療や、癌の免疫治療への応用が期待されている。 CpG ODN には主に２つのタイプがある。１つは体内でインターフェロンという物質を誘導し、 これが免疫細胞（マクロファージやナチュラルキラー細胞4）など外敵を貪欲に食べる細胞）を活 性化するタイプ。もう１つは、インターロイキン６という物質を誘導し、多くの抗体を作りだす タイプである。 しかしながら、CpG ODN の治療への応用には、大きな問題があった。人体の免疫作用を充分 に活性化させるためには、インターフェロンとインターロイキン 6 の２つを同時に誘導させるこ とが効果的である。そこで従来から、２つのタイプのCpG ODN を併用して、インターフェロン とインターロイキン6 の両方を同時に誘導させようと試みられているが、これまで不可能であり、 同時使用の場合に誘導されるのはインターロイキン６のみであった。 成果の内容 今回の研究では２つのCpG ODN のうち、インターロイキン 6 を誘導するタイプだけを用いた。 核酸医薬を体内に長く留まらせるにはナノ粒子に搭載させることが効果的であることがわかっ ており、本研究ではCpG ODN をシリコンナノ粒子と結合させた。この際、結合方法を 2 種類用 意したが、この違いにより、1 種類の CpG ODN を使ってインターロイキン６を誘導させたり、 反対にインターフェロンを誘導させることが可能であることを発見した。 １つの結合は、シリコンナノ粒子の表面をマレイミド 5)で修飾し、CpG ODN の一端のみをチ オール化6)して架橋させた（図1）。この場合、CpG ODN は図 1 で示すとおり、髪の毛のような 形状でナノ粒子と結合した。そして、インターロイキン6 のみが誘導された（図 3 右図）。 もう一つの結合として、シリコンナノ粒子の表面をアリルアミンで修飾し、CpG ODN を静電 的7)に結合させた（図2）。この場合は、図 2 のように、CpG ODN はシリコンナノ粒子に巻き付 くような形状をとった。そしてこの場合、本来なら、インターロイキン6 を誘導するはずの CpG ODN が、インターフェロンを誘導するようになった（図 3、中央図）。つまり、おなじ CpG ODN を用いても、ナノ粒子への結合の仕方によって、インターフェロンを誘導するか、あるいはイン ターロイキン6 を誘導するかを制御できることを意味している。すなわち、ナノ粒子との結合形 態により、CpG ODN の効果を変換できることを発見した。 さらに、この２つの異なる結合方式でシリコンナノ粒子と結合させたCpG ODN を混ぜて併用 すると、インターフェロンとインターロイキン6 を同時に誘導することができた。（図 4e）。この
3 ２つを同時に高いレベルで活性化させることに成功したのは世界で初めての成果である。 本研究で使用したシリコンナノ粒子は、量子ドット 8)の性質を有しているため、紫外線を照射 することで蛍光を発することができる。この性質を利用して、シリコンナノ粒子に結合したCpG ODN の細胞内での所在を観察することができる。その結果、静電的に結合させた CpG ODN は、 細胞内でエンドソーム 9)に局在し（図 4b）、一方、シリコンナノ粒子表面のマレイミドに架橋し たCpG ODN は、細胞内でライソソーム10)に局在することを見出した（図4c）。したがって、CpG ODN 分子のシリコンナノ粒子の表面への結合の違いは、細胞内での局在に影響を及ぼし、その局 在の違いが、インターフェロンを誘導するか、あるいはインターロイキン6 を誘導するかを決定 していると考えられる。 波及効果と今後の展開 本研究は、ナノ粒子と組み合わせることによって、CpG ODN という核酸医薬の効果を変化さ せることができることを示している。いくつかのCpG ODN は、米国において、臨床試験の段階 にある。今回の成果は、インターフェロンとインターロイキン6 を同時に誘導することによって、 遊離のCpG ODN を単独で使用した場合と比べて、より大きな免疫活性化効果が期待でき、感染 症やアレルギー疾患への応用、あるいは癌の免疫療法への応用が考えられる。 用語解説 1) CpG オリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN） シトシン‐グアニンのジヌクレオチド。バクテリアやウイルスの DNA 中に高頻度に認められる配 列で、TLR9 はこの配列を認識して活性化する。ヒトを含む哺乳動物の DNA には、CpG はほとん どないため、TLR9 による CpG の認識は免疫活性化の最初のステップとなる。 2) インターフェロン ウイルス抑制因子とも言い、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、マクロファージやナチュラルキラー 細胞を活性化させる作用を有する。B 型および C 型肝炎や悪性リンパ腫などの治療に用いられて いる。 3) インターロイキン 6 B 細胞を分化させて抗体生産を促進する作用する。炎症性の原因となる物質でもある。 4) マクロファージ、ナチュラルキラー細胞 マクロファージ：免疫細胞の一種で、ウイルスや細菌に感染すると、最初にマクロファージが これらを捕食する。樹状細胞と同様に、病原体を感染組織でからリンパ組織へ運搬し、抗体生 産などによる適応免疫誘導のための情報伝達を行う細胞。 ナチュラルキラー細胞：ウイルスに感染した細胞や腫瘍細胞を殺傷する作用を有する細胞。
4 5) マレイミド マレイン酸がイミド化した化合物で、チオールと結合する性質をもっている。 6) チオール化 水素化された硫黄(-SH)を末端にもつ化合物。 7) 静電的結合 正の電荷をもつ物質と負の電荷をもつ物質が引き寄せられて起こる結合。核酸は負の電荷をもっ ている。アリルアミンは正の電荷をもっているので、お互いに引き寄せられ結合することができ る。 8) 量子ドット 半導体無機材料をナノメートルサイズにして、原子が数百個から数千個集まった粒子。光を吸収 することにより粒子サイズに依存した発光特性を示す。 9) エンドソーム 細胞外の物質を取り込んでできる細胞内の小胞。 10) ライソソーム エンドソームと同様な細胞内の小胞であるが、細胞外から取り込まれた物質は、ライソソームで 分解される。 11) 樹状細胞 免疫細胞の一種で、体内の組織に定住するマクロファージと類似した特徴を有する星型細胞。病 原体あるいは分解された病原体を感染組織でからリンパ組織へ運搬し、抗体生産などによる適応 免疫誘導のための情報伝達を行う細胞。 12) B 細胞 免疫細胞の一種で、活性化することによって抗体を生産する細胞。 13) トールライクレセプター9（Toll-like receptor 9） ヒトでは、B 細胞と樹状細胞のエンドソームに存在し、分解により遊離した病原体の DNA と結合 し活性化する受容体。この受容体の活性化により、α 型インターフェロン、インターロイキン 12 を誘導する。
5 本件に関する問い合わせ先 （研究内容に関すること） 独立行政法人物質・材料研究機構 ナノテクノロジー融合ステーション ステーション長 花方 信孝（はながた のぶたか） E-mail: [email protected] TEL: 029-860-4774 （報道担当） 独立行政法人 物質・材料研究機構 企画部門 広報室 〒305-0047 茨城県つくば市千現 1-2-1 TEL: 029-859-2026, FAX: 029-859-2017 【より専門的な解説】 ①CpG ODN の作用機序について CpG オリゴデオキシヌクレオチドは、シトシン(C)‐グアニン(G)のジヌクレオチド配列を含む 短い1 本鎖 DNA のことである。この C-G のジヌクレオチド配列を CpG と呼んでいる。ウイル スや細菌のDNA には、多くの C-G ジヌクレオチド配列（すなわち CpG）が含まれている。ヒト の免疫細胞である樹状細胞11）とB 細胞12）は、このCpG を認識するトールライクレセプター9 13） (Toll-like receptor 9、TLR9)というタンパク質をもっている。樹状細胞や B 細胞のエンドソーム あるいはライソソームに存在するTLR9 が CpG を認識すると、それはウイルスあるいは細菌がヒ トに感染しているという合図になり、インターロイキン 6 やインターフェロンの誘導を促し、そ れらが他の免疫細胞を活性化することによって免疫システムが働く。CpG ODN によっても、ウ イルスや細菌に感染したときと同じように免疫システムを活性化することができるので、CpG ODN は、感染症の治療をはじめ、アレルギー疾患の治療や、癌の免疫治療への応用が期待されて いる。 ②CpG ODN の従来の問題点について しかしながら、CpG ODN の治療への応用には、いくつかの問題がある。そのひとつは、DNA で あるCpG ODN を投与すると、血液中に含まれる DNA 分解酵素によって分解されてしまうこと である。他の問題は、CpG ODN を投与しても、体内から素早く排出されてしまうことである。 DNA 分解酵素による分解から CpG ODN を保護するために、修飾型の CpG ODN が開発されて いる。これまでに開発されたほとんどのCpG ODN は、修飾型 CpG ODN である。しかし、修飾 型CpG ODN には、副作用の心配があることが指摘されている。物質・材料研究機構では、修飾 されていない天然型の CpG ODN を開発し、2011 年に発表している。（”Nuclease-resistant immunostimulatory phosphodiester CpG oligodeoxynucleotides as human Toll-like receptor 9 agonist”, BMC Biotechnology, 2011, 11:88）
6 また、CpG ODN が、体内から素早く排除されてしまうという問題は、CpG ODN をナノ粒子 に搭載することによって体内での滞留時間を延長することができると考えられている。 本成果は、物質・材料研究機構で開発した天然型CpG ODN をナノ粒子に搭載し、遊離の CpG ODN よりも体内での滞留時間を延長し、かつ大量の CpG ODN を細胞に送達することによって 効果を増強することを目的に行われた研究の過程で見出された。 ③CpG ODN の阻害作用について シリコンナノ粒子に静電的に結合させインターフェロンを誘導するようになったCpG ODN と、 インターロイキン6 を誘導する遊離の天然型 CpG ODN を併用しても、インターロイキン 6 とイ ンターフェロンを同時誘導することはできない（図 4d）。しかしながら、シリコンナノ粒子に静 電的に結合させてインターフェロンを誘導するようになったCpG ODN と、シリコンナノ粒子表 面のマレイミドに架橋することによってインターロイキン6 を誘導するようになった CpG ODN を併用すると、インターフェロンとインターロイキン6 を同時に誘導するようになった（図 3e）。 これは、天然型CpG ODN をシリコンナノ粒子表面のマレイミドに架橋することによって、イン ターフェロン誘導を阻害するという遊離のCpG ODN の負の性質を消すことができたためと考え られる。
7 図1 マレイミドで表面修飾したシリコンナノ粒子と、一端をチオール化した CpG ODN を混 合するとCpG ODN はシリコンナノ粒子表面に髪の毛のような結合状態を形成する。 図2 アリルアミンで表面修飾したシリコンナノ粒子と CpG ODN を混合すると静電的に巻き つくように結合する。写真は、シリコンナノ粒子(黒丸)に静電的に結合した CpG ODN 分子(矢印 で示した白い層)の透過電子顕微鏡写真。シリコンナノ粒子の表面に CpG ODN が巻きつくように 結合しているのがわかる。
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図3 CpG ODN のナノ粒子による効果の変化。遊離の CpG ODN 分子は TLR9 と相互 作用してインターロイキン6 (IL-6)を誘導する(左図)。シリコンナノ粒子(青丸)に静電的 に結合させたCpG ODN はインターフェロン(IFN)を誘導するようになる（中央図）。シ リコンナノ粒子に一端のみを結合したCpG ODN は遊離の CpG ODN と同様に IL-6 を 誘導する（右図）。
9 図4．(a) 遊離の CpG ODN はインターロイキン 6 のみを誘導する。(b) インターロイキ ン6 のみを誘導する CpG ODN をシリコンナノ粒子表面に巻きつくように静電的に結合 させるとインターフェロンを誘導するようになる。(c) インターロイキン 6 のみを誘導 するCpG ODN をシリコンナノ粒子表面に髪の毛のような結合をさせると、インターロ イキン6 のみを誘導し、インターフェロンは誘導しなくなる。(d)シリコンナノ粒子表面 に巻きつくように結合させたCpG ODN と遊離の CpG ODN を併用してもインターロイ キン6 のみ誘導され、インターフェロンとインターロイキン 6 を同時に誘導できない。 (d) シリコンナノ粒子表面に巻きつくように結合させた CpG ODN とシリコンナノ粒子 表面に髪の毛のように結合させたCpG ODN を併用すると、インターロイキン 6 とイン ターフェロンを同時に誘導するようになる。
