電子顕 微 鏡的観察 腹膜 中 皮細胞 再 生 光 学 顕 微 鏡的及

9 9 2 金 沢大 学 十全 医学 会 稚 誌 第9 1巻 第6 号 9 9 2‑1 0 0 6 (1 982)

ラ ッ ト^の

腹 膜 中 皮 細胞

再 ^生

^光 学 顕 微 鏡 的 及

電 子 顕 微 鏡 的観 察

金 沢 大 学 医学 部病理学 第^一満座 ( 主任^: 梶川欽 ^一郎 教 授)

桃 井 文 夫

(昭和^{5 7}年^{1 2}月⁷ 日受付)

中皮の再 生機 序を解 明す る目 的^で, ゲラ チ^{ン ー フ}イ^{ル ム}法で ラッ トの体 壁 腹 膜^に中皮の欠 損 (5 ^× 5 m m ²) を作 成し, その修 復 過 程を 1 ^〜1 4 日にわ た り光 顕 的及 び電顕 的^に観 察し た▲ 中 皮 剥離 後1 日 で創 面は大食細 胞で被 覆さ れ, 2 ^〜 3日 後^には創 緑^に近 接す る既 存の中皮 細 胞の核 分裂と創 面^にお け る中皮細 胞の移 植が認め ら れ た. 同 時^に下 部 結 合組 織に線 推 芽細 胞の増 殖が観 察さ れ た^･ 創傷7 日 以後は創 面は下 部に薄^い癖痕を残し て完 全に再 生 中皮で被 覆さ れ た^{･ こ}の修 復 過程に お^いて･ 超 微構 造 的^にも細胞 化 学的

にも大 食 細 胞又 は線 推 芽 細 胞が中 皮細 胞^に転 化す る^こと を 示唆す る証 拠は得ら れ な^{か っ}た‑ これ らの所見

から, 中皮の欠 損は創 緑か ら の中 皮細 胞の移 動 及び創 面に移 植さ れ た中 皮細 胞の増 殖^によ^って修 復さ れ る も の と結論さ れ た^.

K ey ^{w o r}ds M e s othelial c e11, Reg^{e n e r a}tio n, L i_ght mic r o s c op y,

E le ctr o n mic r o s c op y^.

腹膜 表 面の創 傷は速や かに修 復さ れ る^こと は よく 知 ら れ て お り, これ ま での研 究で創 面は早期に大 食 細 胞 で被わ れ, 次^いで再 生 中皮の被 覆で置 換さ れ る^こと が 明ら かにさ れ て^いる. し か し, 再生中皮 細 胞^の起 源^に

つ いて は意 見が分か れ,様々 な仮 説が提 唱さ れ ている^. これ らの主 熟ま, 再 生 中 皮 細胞は他^の間葉 細 胞か らの

転 化^によ る と^いう 見解と, 既 存の中 皮細 胞^に由来す る と^いう 見解に大 別さ れ る. 前 者の説の中^には, 中皮 細 胞は溶 出し た大 食 細 胞か ら転 化す る と^いう説^1卜5)と,下 部 結合 組 織の線 維 芽 細胞か ら転 化す る と^いう説^6)･7)があ る^. 既 存の中皮細 胞か ら中 皮が再生さ れ る と す る見解 の中^では, 腹 膜^の他の部 位か ら創 面^に移 植さ れ た中皮 細 胞の増 殖^によ る と^いう考え が多く の支 持を得て^い る^{8卜1 0)}.創 繚^に近 接す る既 存の中 皮細 胞の分裂 増 殖^によ

って連 続 性^に中皮が再 生さ れ る可 能 性が指摘さ れて い る が, 腹 膜 創傷は非 常^に速や か^に修 復さ れ, し か も中 皮^の再 生は創 面全 域^に平 等^に進 行す ること か ら^{1) 胡}, こ の ような既 存 中 皮^から の連 続性 再 生は限ら れ た範 囲^に

止 ま る も の と考え ら れ て^いる^3)･9).

これ ら の意 見^の相 違^の原 因^のひ と^つ は研 究 方法の差

に基 づ く も^のと思わ れ る^. た と え ば, 広く, 且^つ深^い 創 傷^では炎症 細 胞の浸 潤や そ れ^に続く結 合組 織細胞^の 反 応が強 く, これ ら の細 胞と再 生 中 皮細 胞との関係^の 解 析は困 難^にな る で あ ろ う^. 又, 他^の細 胞が中皮細胞

へ転 化す る か否か は超 微 構 造 的 及び細 胞化 学的特徴^の 比較が有 力な手 段と な る で あ ろ う^. さ らに_, 中 皮の再 生が既存の中皮か ら連 続 性^に行わ れ る^か, あ る^いは不 連 続 性^に行わ れ る かについて は, 小皮 標 本や走査型電 子顕 微 鏡 (以下走査電 顛と略す) ^によ る創 面^の細胞分 布の検 討が重 要な手 掛り を与え る で あ ろ う^.

本 研 究はこれ らの諸 点を考 慮し て,W at te r sら^{8 )}のゲ ラ テンー^{フイル ム法に従って腹 膜 中 皮の みを剥 離し,} 光学 顕 微 鏡 (以下 光 顕と略す), 透 過 型 電子顕微鏡 似 下 透過 電 顕と略す), 走 査電 顕な ど, 様々 な観 察手段^を 併用 し, 中皮 細 胞^の再 生 機 序を解 明し よ う と試み たも のである.

M e s othelial R eg^{e n e r a}tio n of the Rat Pe ri_to n e u m : Ligh ^{t a nd Ele ctr o n M i}c r o s c op^lC o bs e rv atio n^. Fu mio M o m o n oi_, Dep^{a r}tm e nt of Path olog y (^Ⅰ)^,(^{D ir e cto r ‥P r of･ K･ Ka}j^i･ k a w a), Scho ol of M edi^cin e

, K a n a z a w a U ⁿiv e r si_{t y}･

..^: .^∴

･∴

..‑

‥

腹 膜 中皮 細 胞^の再 生 ^{9 9 3}

材 料 及 び方 法 Sp^{r a}g^{u e}

‑ D^{a w}ley 系ラット( 体重2 0 0g) を塩 酸ケ タ^{ミ ン}(^｢ケ タ ラ^{ー ル→}三共) の麻酔 下^で開 腹し, 体 壁 瞑膜^{に5m m} 平 方の ゲ ラ テ^{ンー フ}イ^{ル ム} (日本アップ ジ^ヨン社)を10 秒間 貼 布 後 除去す ること に よ^って中 皮 を剥離^{し て}創 傷を作 成し た･ 剥離 後1 , 2, 3, 4,

5, 7, 9 ,1 4 日に組織を切 出し た･ 腹部 切 開の み を 行^った も の を対 照と し た･

1) 透過 電顕 的 観 察^: 細 切し た組 織を 2^･5 % グ^ルタ

ールア^ルデヒド(0^.1 M カコ ジ^ル酸ソ ^ー ダ緩 衝 軌 pH 7^.4) で 4⁰C, 60 分間 固 定後, さ らに2 % オスミ ウム酸

(0^.1 M カ^コ ジル酸ソ^ー ダ緩 衝 液, pH 7･4) で 4⁰C,

90 分間 固定^{し た.} 試 料は^エタ ノ ^{ー ル}系 列で脱 水し,

E P O E 81 2 に包埋 し た.超 薄 切 片はダイ ヤモ ンド ナ イフ を用^いL K B ウ^ルト ラ ト^ー ム で作 製^し,酢 酸ウ ラ^{ニ ール･} 硝酸鉛^{の 二}重 染 色を行った^.超薄 切 片は 日立H ^‑5 0 0 型 電子顕微鏡を用^い直 接倍率^{1,2 0 0〜1 5,0 0 0}倍^で撮影し た.

2) 走 査電 顕 的観 察^: 創傷 後1 , 2, 3, 4 日 の材 料をダ^ルク ^{ー ル}ア^ルデヒド^･ オスミ ウム酸の重 固 定を 行^い, 酢 酸イ^ソア ミルで置 換, 臨 界 点 乾燥 後, 金 ^一パ

ラ ジウ^ム蒸 着を施し た^. 試 料は 日立H F S ^‑2形 電 界 放 射型走査電子顕 微 鏡を使用 し,直接 倍 率2 0 ^〜1 0,0 0 0倍 で撮影し た^.

3) 光 顕的 観察^:1 0 % 中性^{ホ ルマ}リ^ンで固 定さ れ た 組織を^パラフ ィ ン切 片と し, H ^･ E, V a n G ie s o n 及び 鍍鍍染色を施し た^.

4) ゲ ラ テン^【 フイ^{ル ム}剥 離標 本 ( 以 下剥 離 標 本と 略す) ^:創 傷後2, 3, 4 日 の材 料か ら T ^{s uts u} mi らの

方法^{1 1)に}準じて次の よ う に剥 離標 本を作 製し た.1 5 m m

平方の ゲ ラ テンー^{フイル ム (日}本アップ ジヨ ン社) を 創傷を含む腹 膜 面^に約1 0 秒 間密 着 圧迫し,フイ^{ル ム}面

に細胞を貼布さ せ た^{. フ}イ^{ル ム}は 1 0% 中 性ホルマリン で固定し, フイ ^ルム自 身^の染 色性を防ぐ た め市販の セ

ロテ^ー プ を貼 布し, 鉄^{へ マ}ト キ^シリンで染 色し た^{. こ}

のよ う な方法で作 製さ れ た 正常 腹膜 標 本^には紡錘 形^の

中皮細胞^の敷石状^の配 列が観察さ れ,中 皮^のe n fa c e観

察に有効で あ ること が確か め ら れ た.

5) 酵素 細胞 化 学 的観 察^: 創傷 後1 , 2 , 3, 4 日 の組織を Ka r n o v sk_y 固 定 液で固 定し, Vibr ato me で 20 0 ^〜3 0 0F^L に薄切し,Go m o ri法^{1 2)に}よ る酸性^{ホ ス ファ} タ^ー ゼ反応,勝田 らの方 法^{1 3)に}よ る^ペルオ キ^シダ^ー ゼ反 応を行^い, 上記と同様な方 法で電 顕 試 料を作 製し た.

6) 貪食実 験^: ミリ ポ アフィ^ルタ^ー で炉 過した India n

ink(Pelika n 社)2 ml を創傷2 時 間後^に腹 腔 内^に注 射 し, 1, 2 , 3, 4 , 5 , 7, 9 , 1 4 日 の間 隔で組 織

を採 取し, 上記の方 法^で光顕用組 織切 片 及び電顕用超 薄 切 片を作 製し た.

結 果

Ⅰ 肉眼所見

中皮 剥離1 日目で は創 面は白 色^に混 濁し, 透 明滑 沢 な 正常 腹膜 面と明 瞭^に境さ れ る^. そ の後4 日目ま で創 面の混 濁は増 加す る が, 5 日以 後か ら徐々に混 濁は減 少し 14 日 で は 正常 腹膜^の外 観^に回復し た. 4 日目ま で 極く少 量^の透明な腹 水が認め ら れ た が, 5 日以後は ほ と ん ど消失し, 又, 腹 膜の癒 着は全く認め ら れ な か ^っ た^.

ⅠⅠ 正常腹 膜^の構 造 正常 状 態^の腹 膜は光顕 的に は,

一層^の扁平な中皮 珊

胞で被わ れ, そ の直 下^に結 合組 織^の薄 層を隔て て弾 力 板が認め ら れ る. 弾 力板と腹 筋と の間は撤 密な線 推性 結 合 組織で占め ら れ る. 線 維 束^の間^に長^い細胞 突 起を 延ば し た線 推 芽細 胞が散 在し, 腹 筋の近くには毛 細 血 管が配 列す る.

透 過 電 顕で は. 中 皮細 胞は腹 膜 表 面を被覆す る屑平 な細 胞と し て認め ら れ, 細 胞は 互に tigh ^tju n ctio n 又 は デ^{ス モ}ソ ^ー ム によ^って接 着す る^. 細 胞の自 由表 面は は梶棒 状の微絨 毛が認め ら れ, 基底面は連 続性の基 底 膜で包ま れ る^. 細 胞 小 器 官の特 徴は比 較 的乏^{し く,} 断 片状の粗面 小 胞体, ゴ ルジ装 置, 糸粒 体 及び小 胞が認 め ら れ る. 時に_, 多 房体が認め ら れ る が d^{e n s e}body 型

のリ ソゾ^{ー ム}は ほ と ん ど存 在し な^い. 核は輪郭の不 整 な楕 円形を呈し, ク^{ロ マ}チ^ンは少な^{い. ペ ル}オ キシダ

ーゼ活 性は陰性で あ る.

中 皮細 胞の基 底膜^の下^には, mi c r o飢ril と少 数の細

い膠 原線 椎を含む結合 粗 織が存 在し, 下 部の線 維性 結 合組 織との間は弾 力線 維^によ^って境さ れ る. 弾 力線 推 は腹膜 表 面^に平 行^に走る板 状の配 列を 示 す が, 所々に fe n e str atio n が存 在す る^. 弾 力 線 維の周 囲は mic r o^一

丘bril で包ま れ る. 弾力 板と申皮との間^には遊 離状^の細 胞は認め ら れ な^い.

弾力 板^の下 郡は膠 原綿 推 束で満た さ れ, 線 維 束^の間

には, 線 推芽 細 胞が介在す る. 線 推 芽細 胞は粗 面 小胞 体が豊寓^で, 樹 枝 状^の細 長^い細胞 突 起を線推 束^の間^に 延ば し て^いる. 腹筋^の近くには毛 細 血管が配 列し, リ

ン パ管も か な り多く認め ら れ る.

走 査 電頗^では中 皮細 胞は密^に配 列し た多 角形細 胞と し て認め ら れ, 表 面^には剛 直性 徴 絨毛 の密 生が観 察さ れ る^.

上述^のよ う に, 腹 膜は弾 力 板を境と し て, そ の内 層 と下 層で は構 造 的^に異^って^いる ので, 本論 文で は, 弾 力板よ り内層を腹 膜 固有 層, 下層を腹 膜下 層と呼び分

9 9 4

け て記載す る^.

Ⅱl 腹 膜^の修 復 1 ^. 光 顕 的 所見 1 ^‑ 2 日^:

露 出した腹 膜 固 有 層の表 面は大食 細 胞で被わ れ,所々 大 食 細 胞, 好 中球, 線維 素か ら成る溶 出物が付 着す る^･ 大 食細 胞^{にはInd ian ink の}貪食を認め る^こと が で き る.

腹 膜 下 層で は腹 筋^に近 接す る毛 細 血 管の周 囲^に少 数の

大食 細 胞と好 中球^の浸 潤が認め ら れ, 線 維 芽 細 胞は軽 度の増 殖を 示 す.

剥 離 標本で は創傷2 日 で創 面は多 数の大 食 細 胞で被 わ れ, 創緑の中皮細 胞の配 列は不 規 則と な り, 多数の 核分 裂が認め ら れ る(F ig^.1) . 被 覆は その間に侵入 す る中皮 細胞^によ^って不規 則^に分 断さ れ る.

3 ^‑ 4 日^:

腹 膜 固 有 層は細 胞 増殖^によっ て肥 厚す る. 構 成 細 胞 の大 部 分は India n iⁿk の貪食を示さ な^い紡 錘 形 細 胞 で, Indi an ink を摂 取し た大食 細 胞は腹 膜 固 有 層^の深 部^に集 在す る(F ig^.2)^. 腹膜 下 層^{で は}大 食 細 胞の浸 潤 と線 推 芽 細 胞の増 殖が認め ら れ, 緑 綬 芽 細 胞は腹膜 固 有 層^に侵入 す る.

剥 離標 本で は創 面^の大部分は中 皮細 胞^で被わ れ, そ の中に大 食 細 胞が付 着し た創 面が島状^に残っ ている.

Fig^.1. Gelatin ^‑fi lm stripp iⁿg pr epa r atio n fr o m the w o u nd m a rgin at2 days afte r m e s otheliu m ^‑ r e m o v al, Sho wing mito s e s of the m e s othelial

c ells.Ir o n he m ato xylin stai^{n. ×}9 0 0.

F i_g^.2^. Ce ntr al pa rt of a w o u nd at 3 days･ T he s u rfa c e c ells fo r T n a d is c o ntin u o u s laye r^･ T h^e

u nde rl_ying c o n n e ctiv e tis s u e c o ntain s n u m e r o u s c ellula r c o mpo n e nts,in clud ing India n iⁿk‑

phago cy tiz ed m a c r ophage s(a r r o w s)^. H.E. ×9 0 0.

‡

■ t

腹膜 中皮 細胞^の再 生 9 9 5

Fig^.3･ Gelatin一^{色Im stri}p ping pr epa r atio n fr o m the c e ntr al pa rt of a w o u nd at 3 days^･ M a c r o^‑ phage ^‑ C O V e r ed a r e a s a r e s e e n a si^{r r e}gul a rislets

betw e e n r eg^{e n e r a}ting m e s othelial c e11s･ A r r o w

indic ate s mito sis of a m e s othelial c ell. Ir o n

he m ato xylin stain. ×4 5 0^･

中皮細胞には所々核 分 裂が認め ら れ る(F ig^.3). 中皮 細胞が別線か ら求 心 性^に創 面を被 覆す る^こと を 示唆す る所見は認め ら れ な^い.

5 ^‑ 6 日^:

腹膜 固有層の増殖 細 胞は減 少す る. 表 面は ^一 列^に並 ぶ扁平な細胞の被 覆があり, 下 部には紡 錘 形 細 胞が平 行^に配 列し,好 餌線 推の増 加が認め ら れ る.Ind ia nink を摂 取す る大食 細 胞は腹 膜 固有 層深部に散 在 性^に認め ら れ るにすぎない. 腹 膜 下 層で は線維 芽 細 胞の増 殖は

な^お続^いて^いる が, 大 食細 胞^は減 少す る.

7 ^‑ 9 日^:

創面は完 全^に一 層^の中 皮細 胞で被 覆さ れ, 腹 膜 固有 層に軽度の膠 原 線 維^の増加が認め られ る.少 数の Ind ia n

ink の貪食を 示 す大 食細 胞が散在す る^.腹 膜 下 層の線 維 芽細胞は減 少す る.

14日^:

腹膜は ほ と ん ど 正常 構 造^に回復す る^. 腹 膜は扁 平な 中皮細 胞で被覆さ れ創 傷^の痕 跡は ほ と ん ど確 認で き な いが, よ く注 意す る と, 中皮 下^に膠 原線 推^の増 加が残

って^いる所がある.

2 . 電 顕 的所 見 1‑ 2 日^:

中皮の欠 損 部には基 底 膜が露 出し, 腹 膜 固 有 層^には 軽 度の水 腫と少 数の好 中球の浸潤が認め ら れ る｡ 露 出 し た基底 膜の表 面は渉 出細 胞が付 着 する^. 溶 出細 胞の 大 部 分^は大 食 細 胞^である が, 少 数の好 中 球と肥 満細 胞 が混 在し て お り, 中皮 細 胞も散 在性^に認め ら れ る^.

大 食細 胞は ク^{ロ マ}チンの粗 大な陥凹 のある核を有し,

細 胞 表面^に多 数の細偽 足を出し, 広^い原 形 質に は小 胞 及 び空胞が多く, 酸 性ホス フ ァタ^ー ゼ が陽性の リ ソゾ

ー ムが認め ら れ る.粗 面小 脇 体の発育の程 度は様^々で,

数 層^に並 ぷ細 管 状 粗面 小 胞 体が認め ら れ ること がある.

ゴルジ装 置は中等 度^に発 育し層^{板と小 脇で}構成さ れ る.

ペ ルオ キ^シダ^ー ゼ活 性が核 膜, 粗 面小 胞 体, 原 形 質 頼 粒 及び リ ソゾ^{ー ム に}証 明さ れ る細 胞と, 原 形質 顆 粒や リ ソ ゾ^ームの みに証 明さ れ る細 胞が混 在 する(Fig^.4).

中皮 細 胞は原 形 質を延 ばし て創 面^に付 着し, 遊 離 面

には微 絨 毛が認め ら れ る^. 基底膜の形成は不 完全で あ る(Fi_g^.5). 核の輪 郭は不 整で ク^{ロ マ}チンは微 細であ る. 時々核 小 体が み ら れ る. 正常の中 皮細 胞^に比^べて 粗 面 小胞 体と ゴ^ルジ装 置の発育が良 好で, しば_{し ば}多 房 体が認め ら れ る. 原 形質 周辺^{に マ}イ ク^{ロ フ}ィ ラ メン

トが集在す る.

ペ ルオ キシダ^ー ゼ反 応は陰性である.

リ ソゾ^{ー ム}は乏し く, 酸性フ ォ ス フ ァタ^ー ゼ反 応は ゴ ルジ装 置及 び多 房 体^に証 明さ れ る. 創緑で は中皮 細 胞 に時々核 分裂が認め ら れ,細 胞 間の結合が ゆ る く な り,

腹 腔 内^への剥 離が認め ら れ る (Fig^.6, 7).

腹 膜 下 層には軽 度の水 腫と, 好 中 球や大 食細 胞の浸 潤が認め ら れ る^. 線 推 芽 細胞は軽 度の増 殖を 示 し, 弾 力 板の間 隙か ら腹 膜 固 有 層^へ侵入 す る像に遭 遇す る

(F ig^.5).

走 査電 顕で は創 面^に多数の大食 細 胞の付 着が認め ら れ る^. 大食 細 胞は中 皮細 胞よ り小さ く, 丸み を帯び,

細 胞 表 面^にう ねった ひ だ状の細 偽足が認め ら れ る^. 創 緑の中 皮細 胞は配 列が乱れ る が, 多数の微 絨 毛を持^つ 大型の扁 平な細 胞と し て大 食 細 胞と容 易^に区別さ れ る (F i_g^.8).創 中央 部^にも大 食 細胞の間^に原形 質を延 ば し た中皮 細 胞が散在 性^に認め ら れ る(Fig^.9).

3 ^‑ 4 日^:

この時期で は光顕 的^に観 察さ れ る よう^に, 著 明な細 胞 増 殖の た め腹 膜 固 有 層の細胞の構 成は複 雑と な る.

主要な増殖 細 胞は中 皮細 胞, 大食 細 胞及び緑 綬 芽細 胞 である.

創 面は大 食 細 胞 及び中皮 細 胞で被わ れ る が, 中 皮細 胞^の占め る割 合が増 加す る^. これ は走 査 電顕^によって も確か め ら れ る(Fig^.1 0). 中皮 細胞は隣 接す る大 食種