博 士 （ 医 学 ） 荒 浪 利 昌
学 位 論 文 題 名
同系混合リンパ球反応(SMLR) 性T 細胞 サブセットの解析
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
T細 胞 は 胸 腺 内 で 正 ， 及 び 負 の 選 択 を 受 け ， 末 梢 リ ン バ 組 織 に 到 達 す る 段 階 で 自 己 抗 原 に 反 応 し な い よ う に コ ン ト 口 ー ル さ れ て い る ． し か し ， ヒ ト や マ ウ ス に お い て ， 末 梢 成 熟T細 胞 をin vitroで 自 己 ， 又 は 同 系 の 非T細 胞 と 培 養 す る と ， 増 殖 反 応 を 起 こ す こ と が 知 ら れ て お り， 自己 又は 同系 混合 リン パ球 反応(AMLRまた はSMLR)と 呼ば れる ．
SMLRは 健 常 人 ， お よ び 正 常 マ ウ ス に お い て 認 め ら れ る が ， 生 体 内 に お け る 生 理 的 意 義 は 未 だ 不 明 で あ る ． 但 し ， 一 部 の 自 己 免 疫 疾 患 患 者 や ， 自 己 免 疫 自 然 発 症 マ ウ ス 系 統 に お い て ．SMLRが 減 弱 し て い る と の 報 告 が あ り ， 免 疫 系 の 制 御 に 何 ら か の 役 割 を 果 た し て い る こ と が示 唆さ れて いる ．
最 近 ， 刺 激 細 胞 で あ る 非T細 胞 の う ち 樹 状 細 胞(DC)が ，T細 胞 刺 激 活 性 の 高 い ユ ニ ー ク な 能 カ を 持 つ こ と が 判 明 し た ． 本 研 究 で は ， 末 梢T細 胞 と 同 系DCに よ るSMLRを 行 い ， SMLRに 関与 するT細 胞 亜群 を解 析し た．
最 初 に ナ イ 口 ン ウ ー ル 精 製 脾T細 胞 を 反 応 細 胞 ， 脾 臓DCを 刺 激 細 胞 と し てSMLRを 行 い ， ま た 同 時 にCD4(十)T細 胞 と ，CD8(十)T細 胞 サ ブ セ ッ ト の 反 応 性 を 調 べ た ．SMLR4日 後 に ， 未 分 画T細 胞 は ， 有 意 な 増 殖 反 応 を 示 し た が ，CD4(‑)T細 胞 分 画 を 反 応 細 胞 と す る と 明 ら か に 増 殖 反 応 は 低 下 し た ． 一 方 ，CD8く‑)T細 胞 分 画 は ， 未 分 画T細 胞 の 場 合 と 同 等 ， 或 い は そ れ 以上 の増 殖反 応を 示し た．
SMLRの 増 殖 反 応 は ， 抗MHCク ラ スH単 ク □ ー ン 抗 体(mAb） に よ り 約40％ に 抑 制 さ れ た ，一 方， 抗CDlmAbはSMLRに 対し て影 響を 示さ な かっ た．
次 にSMLR4日 目 の 時 点 で の 活 性 化 マ ー カ ー お よ び 細 胞 分 裂 の 状 態 を 解 析 す る と ，CD4（ 十 ） T細 胞 に 比 べ ，CD8（ 十 ）T細 胞 中 に ， 活 性 化 マ ー カ ー を 発 現 し ， 分 裂 し て い る細 胞の 割合 が高 か っ た ． し か し ， 2日 目 で は CD4（ 十 ） T細 胞 中 に 活 性 化 細 胞 が 多 か っ た ． ヒ トAMLRに お い て ，CD4（ 十 ）CD62L（ 十 ）T細 胞 が 顕 著 に 反 応 す る と の 報 告が あり ，マ ウス SMLRに お い て こ の 点 を 検 討 し た ．CD62L（ 十 ）T細 胞 は 単 独 で 増 殖 可 能 で ， 未 分 画T細 胞 よ り も 高 い 反 応 性 を 示 し た が ，CD62Lくl）T細 胞 で は 増 殖 反 応 が 有 意 に 低 下 し て い た ， し か し ， 固 相 化 抗a/pT細 胞 受 容 体 （TCR）mAb刺 激 の 場 合 は ，CD62Lくl）T細 胞 の 増 殖 反 応 が ， 他 分 画 に 比 べ 常 に 高 か っ た ．SMLR4日 目 で 見 る と ，CD62L（ 十 ）T細 胞 サ ブ セ ッ ト で 分 裂 し て い る細 胞の 大部 分が ，CD8（十 ）T細胞 であ った ．
近 年NK亅T細 胞 が 自 己 免 疫 制 御 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る ．SMLRに お い て ， NK1．1（十 ）細 胞を 除く と， 未分 画のもの に比べて高反応性を示した．しかし，NK1．1（十）細胞
をNKl.1(‑)脾T細胞に加えてSMLRを行ったところ，直接の抑制効果は確認できなかった．
こ の結果は，NK−・T細 胞の拘束分 子に対する抗CDl mAbが，SMLRに何ら影響を与えな かった結果と一致する．
最 後にD○11.10トラン スジェニッ クマウス(tg)(BALB/c/¥ックグラ ウンド）を用い てSMLRを行った．このマウスのT細胞は全て，I―Acl拘束性，OVAベプチド特異的TCRを発 現 す る．BALB/cマ ウスではC57BL/6と同じくT細胞 の増殖反応(SMLR)が 見られたが ， D011.10 tgT細胞においては増殖が全く見られなかった．
SMLRの生理的意義については不明だが，MHC不適合骨髄キメラより得たT細胞は，骨髄 ド ナ‑MHCに対 す るSMLRを 欠 く． 又 この キ メラT細胞は ，ホストMHCに対してMHC拘束 特異性を獲得し，SMLR様の反応性を示すことが報告されている．従って，SMLRは胸腺上 皮 に 発現 し て いるMHC分 子に よ る正 の 選択 を 遺 残的に示 す反応系と も考えられ る．
本研究では，未知の自己抗原に対する反応と考えられるSMLRに関与するT細胞亜群につ いて検討した．そしてCD4(十)T細胞は単独で増殖出来るが，CD8(十)T細胞はCD4(十)T細胞 非存在下では増殖が弱いことが判明した．
しかし，活性化マーカー及び細胞分裂状態の解析により，SMLR4日目の時点では，むし ろCD8(十)T細胞が活性化し，分裂していることが判明した．これまでSMLRにおいて主とし て増殖するのは，CD4(十)T細胞であり，長期間の培養が必要と報告されている．現在のと ころ，今回の結果とこれらの報告との違いの理由は不明だが，刺激細胞としてDCを用いた ことが影響しているかもしれない，CD8(十)T細胞の増殖がCD4(十)T細胞に依存することを 考えると，SMLR3日目以前に反応増殖するCD4(十)T細胞によるへルプ，恐らくサイトカイ ン ， の 存 在 下 で ， 3− 4日 目 に CD8(十 )T細 胞 が 増 殖 す る と 考 え ら れ た ． 次 にSMLRにおけるCD62L(十)T細胞と，CD62L(−)T細胞の反応性の解析より，SMLR早 期において単独で増殖可能なのは，CD4(十)CD62L(十)T細胞サブセッ卜であり，SMLR後期 で分裂・増殖している細胞はCD8(十)CD62L(十)T細胞サブセッ卜であることが示唆された．
ア口MLRでは，CD4(十)CD62Lく‑)T細胞が反応することから，SMLRが他の反応系と全く異 なる免疫応答であることを示すものと考えられた．
最 後にD011.10 tgT細胞はSMLRで全く反応しなかった．このtgT細胞はH―2dマウスの 胸腺内で正の選択を受ける．従って，上で述べたように，SMLRがT細胞の正の選択を反映 するならば，BALB/c (H−2d) DCに対してtgT細胞も反応すると考えられたが，逆の結果 が得られた． D011.10 tgT細胞の正の選択には特定のりガンドが必要であり，DCはこのり ガンドを提示できなかったか，あるいは，胸腺内の正の選択で働くりガンドとは異なるべプ チ ドが，末梢T細胞の増殖には必要という可能性も考えられる．さらにD011.10 tgでは CD8(十)T細胞の正の選択が誘導されない，今回示したように，CD4(十)T細胞に続くCD8(十）
T細胞の反応が，SMLRには重要なのかもしれない，
今回，ア□MLRと異なり，SMLRを誘導するT細胞の中でCD8（十）CD62L(十)T細胞が重要 な役割を果たすという結果を得た．これは，SMLRの生理的意義を考える上で貴重な手がか りとなると考える．
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
同 系 混 合 リ ン パ 球 反 応 (SMLR) 性 T 細 胞 サ ブ セ ッ ト の 解 析
T細胞は胸腺 内で正， 及び負の 選択を受 け，末梢 リンパ組 織に到達す る段階においては自 己抗原に反 応しない ようにコ ント口ー ルされている．しかし，ヒトやマウスにおいて，末梢 成熟T細胞をin vitroで自己， 又は同系 の非T細胞と培養すると，増殖反応を起こすことが知 ら れ て お り ， 自 己 又 は 同 系 混 合 リ ン パ 球 反 応(AMLR， ま た はSMLR)と 呼 ば れ る ． 最 近， 刺 激 細胞 で ある 非T細 胞 のう ち 樹状 細 胞(DC)が，T細 胞 刺激 活性 の高いユ ニーク な能 カ を持 つ こ とが 判 明し た ． 本研 究 では， 末梢T細胞 と同系DCに よる改良 型SMLRを開発 し，SMLRに関与 するT細胞 亜群を解 析した，
脾 臓よ り 得 た未 分 画T細胞 は ， 同系DCに対して有 意な増殖 反応を示 したが，CD4陽性T細 胞除 去 分画 を反応 細胞とす ると，明 らかに増殖 反応は低 下した． 一方，CD8陽 性T細胞除 去 分画 は ，未 分 画T細 胞の 場 合と 同 等 ，或 いはそ れ以上の 増殖反応 を示した ．また，SMLRの 増 殖 反 応 は ， 抗MHCク ラ スII単 ク □ ー ン 抗 体(mAb)を 加え る こと で 有 意に 抑 制さ れ た ． こ れ よ り ，SMLRに お い て ，CD4陽 性T細 胞 は 単 独 で 増 殖 可 能 で あ る が ，CD8陽 性T細 胞 は ，CD4T細 胞 依存 性 で ある こ と が示 唆 され た ． また ，CD4陽 性T細 胞 は，MHCクラ スII分 子を 認 識し て い ると 考 えら れ た ．次 にSMLR4日目の 時点での 活性化マ ーカー， および細 胞 分裂 の 状態 を 解 析す る と，CD4陽 性T細胞 に 比べ ，CD8陽性T細 胞 中に ，活 性化マー カーを 発現し，分 裂してい る細胞の 割合が高 かった．
近 年NK−T細 胞が 自 己免 疫 制 御に 関 与 しているこ とが示唆 されてい る．SMLRにお いて，
NKl.1陽性 細 胞 を除 く と， 未 分 画の も の に比 べ て高 反 応 性を 示 した ． しかし，NKl.1陽性 細胞 をNKl.1陰 性T細胞 に 加え てSMLRを 行っ た とこ ろ ， 直接 の 抑制 効 果は確 認できな かっ た．
ヒ トAMLRに お い て ，CD4陽 性CD62L陽 性T細 胞 が 顕 著 に 反 応 す る と の 報 告が あ り， マ ウスSMLRに おい て こ れを 検 証し た ．CD62L陽性 分 画 は未 分 画T細胞 よ りも高 い反応性 を示 した が ，CD62L陰性 分 画は 増 殖 反応 が 有 意に低下し てしゝた ．しかし ，固相化 抗a/BT細胞 受 容 体(TCR)mAb刺 激 の 場 合 は ，CD62L陰 性 分 画 の 増 殖 反 応 が ， 他 分 画 に 比 ベ 常 に 高 かっ た ，そ こで再 び細胞分 裂の状態 を解析する と，CD4陽性T細胞に関 しては， それほど 差
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が 無 いが ，CD8陽 性T細 胞ではCD62L陽性分画に 比ベ，CD62L陰性分画の 分裂が弱く ， SMLRにお いてCD62L陰 性T細胞 の増殖が弱 いのは，主 としてSMLR後期 におけるCD8陽性 CD62L陰性T細胞の増殖が弱いことに依ることが判明した，
最後 にD011.10トラン スジ工二ッ クマウス(tg)(BALB/cバックグ ラウンド） を用い てSMLRを行った，このマウスのT細胞は全て，I―Acl拘束性，○VAペプチド特異的TCRを発 現 す る．BALB/cお よびD011.10のT細 胞をBALB/cのDCと培養 すると，BALB/cマ ウスで はC57BL/6と同じく 増殖反応(SMLR)が 見られたが ，D011.10 tgT細胞に おいては，Iー Ad分子に対して増殖が全く見られなかった．
口頭発表に際し，副査の上出教授から，自己免疫疾患における免疫反応の異常を検出す る手 段としてAMLRを行う場合，CD4陽性，CD8陽性T細胞のどちらが重要かとの質問があ り，また，副査の西村教授からは，ここでのSMLRは，培養液中に存在するウシ胎児血清中 の蛋白が関与しているのではないのか，今回の結果では，CD8陽性T細胞の増殖が目立っ が，過去の報告との関連をどう考えるかとの質問があった．主査の小野江からは，今回の結 果とは逆に，ア口MLRの場合は，CD62L陰性分画の増殖が強いのをどう考えるかとの質問 があった，これらの質問に対して，申請者は，自分の実験結果，過去の報告などを引用し，
おおむね適切に回答した．
本研究は，SMLRに関与するT細胞亜群を解析し，時期により反応細胞が異なること，ま たCD8陽性CD62L陽性T細胞が，後期の反応には重要な役割を果たすことを初めて明らかに した．これらの結果はSMLRの生理的意義を明らかにする上で，貴重な手がかりとなると考 えられる．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や単位取得なども 併せ 申請者が博 士（医学） の学位を受 けるのに十分な資格を有するものと判定した，
