博 士 （ 工 学 ） 岩 井 良 輔
学 位 論 文 題 名
遺伝子導入した間葉系幹細胞を用いた 関節軟骨再生に関する生物工学的研究
学位論文内容の要旨
関節軟骨は自己修復能カの非常に乏しい組織であり、一度損傷された軟骨組織は自然治癒によっ て完全には再生し誼い。そこで、軟骨損傷に対する治療法として、人工関節置換術や自家軟骨移植 等の治療法が行われてきたが、それぞれ欠点を有し満足できる治療法は未だに確立されてい教い。
そのよう教背景の中で近年、間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell: MSC)を関節軟骨の欠損部に 移植する方法が有望顔軟骨再生治療法として提案されたが、MSCを軟骨欠損部に移植するだけで は完全教軟骨組織を再生させることはできをかった。これは、移植先の環境下でMSCの軟骨分化 を促進するタンパク質（サイトカイン）の濃度が不十分であるため、MSCが完全教軟骨細胞に分化 でき教かったことが原因と考えられた。そこで本研究では、サイトカイン遺伝子を導入したMSC を移植することで、MSC自身をサイトカインの供給源として軟骨再生効果を高めるてとを考えた。
ここで、本治療法の実現のためには、発がん性や免疫拒絶反応の危険性が顔い安全で高効率教遺 伝子導入法の検討、および導入遺伝子を高発現させるプロモーターの設計が必須である。さらに は、サイトカイン遺伝子を高発現可能をMSCの軟骨再生に対する有効性を、実験動物（加vivo)を 用いず組織培養下(ex vivo)で簡便に評価する必要もあった。
したがって、本論文では、MSCに対する安全で高効率顔遺伝子導入法の検討、およびMSCに 対して高発現教新規のプロモーターの構築と評価を行った。また、遺伝子導入MSCの軟骨再生に 対する効果をハイスループットに評価できるex vr,vo軟骨欠損モデルを構築し、新規プロモーター を用いた遺伝子導入MSCの評価を行った。
第1章は序論であり、本研究の背景と目的を明らかにした。
第2章では、安全教非ウイルス遺伝子導入法の中で、一般的に導入効率が高いとされるりポフェ クション法とヌクレオフェクション法のヒトMSCに対する遺伝子導入手段としての有効性を比較 した。その結果、ヌクレオフェクション法の方がりポフェクション法よりも約9倍も高い遺伝子発 現量が得られた。さらに、細胞回収率を考慮に入れた遺伝子発現の収量においてもヌクレオフェク ション法の方が約7倍の遺伝子発現量が得られた。また、ヌクレオフェクション法では、移植を想 定し異誼るドナーのMSCや異誼る分裂回数のMSCヘ遺伝子導入しても安定して40u/o以上の高い 遺伝子導入効率が得られた。したがって、ヌクレオフェクション法が本治療法において有効毅遺伝 子導入法であることが明らかと顔った。
第3章では、MSCに対して高発現が得られる高活性教プロモーターの構築を行うとともに、
それ らのMSCの軟骨分化に対する有効性を評価した。最初に、MSCの単層増殖培養下におい て種々のプロモーターの発現効率を比較した。その結果、サイトメガロウイルスDNA由来の ―679―
エ ン ハ ン サ ー(CMVE)に ヒ トI型 コ ラ ー ゲ ンal鎖 プ ロ モ ー タ ー(CollAlp)を 連 結 し た 新 規 の CMVE‑CollAlpが 従来 のサ イ トメ ガロ ウイ ルス プ ロモ ータ ー(CMVp)よ りも 高発 現が 得 られ るこ と が確認され た。次に、種々のプロモー ターに軟骨分化を促進するサ イトカインであるTGF‑p3遺 伝 子 を 連 結 し た べ ク タ ーDNAを 構 築 し、 これ ら のべ クタ ーを 導入 し たMSCを3次元 軟 骨分 化培 養 する こ とで 、プ ロモ ー ター がTGFー ．邱 産生 とMSCの軟骨分化に及 ばす影響を調べた。その結 果 、CMVEに ヒ トI型 コ ラ ー ゲ ンa2鎖 プ ロ モ ー タ ー(C011A2p)を 連 結 し たCMVE‑C011A2pの 下 流 にTGF‑f13遺伝 子 を連 結し たpCMVE‑C011A2p卩GF・ ア3ベク ター をMSCに 導入 する と 、従 来の pCMVp/TGF03ベ ク ター を導 入するよりもTGF‐．邱を高発現できると ともに、従来のTGF‐ 邱タ ンパ クの添加による軟骨分化法よ り顕著に軟骨分化を促進できることが確認きれた。したがって、
pCMVE‐ConA2p′rGF03ベ ク ター が軟 骨再 生に 最 も有 望教 プロ モー タ ーで ある と考 え られ た。
第4章で は、 軟 骨欠 損の 再生を評価す るのに、実際の移植環境下に 近い甜vfvD軟骨欠損モデル の 作製を検討 した。初めに、ブタ足関節 軟骨組織上への軟骨欠損の作 製方法を検討した。その結 果、 グラインダーで高速回転させ た極小の球状カッターを用いることで軟骨細胞や軟骨マトリクス の流 出放どをほとんど伴わずに欠 損を作製できることが確認された。次に、軟骨欠損内におけるヒ トMSCの最 適を 培 養方 法を 検討した。そ の結果、プタ骨軟骨ディスク に作製した欠損内ではヒト MSCは 分解 され 軟 骨様 組織 は形 成さ れ 没い が、 骨を 分離した軟骨デ ィスク上の欠損内でヒトMSC は 十分 次 軟骨 様組 織を 形 成できることが 確認された。したがって、 異種のヒトMSCでも欠損内で 軟 骨 様 組 織 を 形 成 さ せ る こ と が 可 能 を 軟 骨 欠 損 モ デ ル の 構 築 に 成 功 し た 。 第5章で は、 第4章で 構 築し た軟 骨欠 損モ デ ルの 培養 系を 用い て 、MSC移 植に用いるサイトカ イ ンや サ イト カイ ン遺 伝 子を 導入 したMSCの軟 骨再 生 に対 する 効果 の評 価 が可能であるかを検 討 した。初め に、サイトカイン濃度、種 類に関して評価を行った。そ の結果、TGFア3を添加して い 顔い 増 殖培 地でMSCを播 種し た軟 骨 欠損 モデ ルを 培 養す ると 、軟 骨マ ト リクスの少をい組織 が 欠損内に形 成されたのに対し、TGFl邱 を含む従来の軟骨分化培地で 培養すると豊富ぬ軟骨マ卜 リ クスを含む 軟骨様組織の形成が認めら れた。この結果は動物実験に おいて過去に示された結果 と 一致したこ とから、本軟骨欠損モデル によって動物実験を再現でき る可能性が示唆された。ま た 、軟 骨 分化 培地 で培 養 したMSCは 欠 損の 表層 で繊 維 芽状 、欠 損の 深部 で 球状の細胞形態を示 し、 これらの形態は天然の軟骨組織の表層（繊維芽状）と中間層（球状）に見られる軟骨細胞の形態 と それぞれ類 似していた。これらの結果 から、本軟骨欠損モデルは移 植下の微小環境を良く反映 し たモデルで あると考えられた。次にこ のモデルを用いて、軟骨再生 を促進するサイトカインの 一 種 で あ るFGF・2お よびMSCの軟 骨再 生 に対 する 効果 の 評価 を試 みた 。そ の 結果 、FGF12を添 加 した 軟 骨分 化培 地でMSCを播 種し た 軟骨 欠損 モデ ル を培 養す ると 、欠 損 内に天然の軟骨組織 の2倍 以 上の 高細 胞 密度 の繊 維性 の軟 骨 様組 織が 形成 し た。 この 結果 から 、MSCをFGF・2とと も に移 植 する と本 来の 軟 骨組織が再生で き顔い可能性が示唆された 。最後に、第3章で構築した pCMVE―C011A2p卩GFザ3ベク ター を導 入 したMSCの軟 骨再 生に 対す る 効果 の評 価を 行 った 。そ の 結 果 、pCMVE←C011A2p′rGF邱 ベ ク タ ー を 導 入 し たMSCは 従来 のTGFザ3を 添加 し た軟 骨分 化 培地 で 培養 したMSCより も明らかに豊 富を軟骨マトリクスを含む軟 骨様組織を欠損内に形成し た 。 こ の 結 果か ら、pCMVE‐C011A2p何GFア3ベク ター が 遺伝 子導 入MSCを 用い た軟 骨 再生 治療 法に 有用塩ベクターDNAと教り得 ることが明らかとをった。
第6章は、本研究の総括である 。本研究では、麒vfv0軟骨欠 損モデルの構築に成功したことで、
動 物 実 験 を 行う こと をくpCMVEーConA2p′rGF邱 ベク ター の有 効性 を 明ら かに した 。 した がっ て 、 今 後 のpCMVE−C011A2p屈GF03ベ ク タ ー の 早 期 の 臨 床 利 用 が 期 待 さ れ る 。
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
遺伝子導入した問葉系幹細胞を用いた 関節軟骨再生に関する生物工学的研究
近 年、 軟骨 細胞 へ の分化能を有する間葉系幹 細胞(MSC)を関節軟骨の欠損 部に移植する方法が 有望 教軟 骨再 生治 療 法として提案されたが、MSCを軟骨欠損部に移植するだ けでは移植先の環境 下でMSCの軟 骨分 化を 促進するタンパク（サイ トカイン）の濃度が不十分で あるため、完全を軟 骨組織を再生させることは でき教かった。そこで本研究 では、サイトカインの遺伝 子を導入した MSCを 移 植す るこ とで 、MSC自 身を サ イト カイ ンの供給源とし軟骨再生効果 を高めることを考え た。ここで、本治療法の実 現のためには、安全で高効率誼遺伝子導入法の検討、および遺伝子を高 発現 させ るプ ロモ ー ターの設計が必須である。 さらには、サイトカイン遺 伝子を導入したMSCの 軟骨再生に対する有効性を 、実験動物(in vivo)を用いず組織培養下(ex vivo)で簡便に評価する必 要もある。
し たが って 、本 論 文で は、MSCに対 する 安全 で 高効 率誼 遺伝 子 導入 法の 検討 、お よ びMSCに 対し て高 発現 を新 規 のプロモーターの構築と評 価を行った。また、MSCの軟 骨再生に対する効果 を評価できるex vlvo軟骨欠 損モデルを構築し、新規プ ロモーターを用いたサイトカイン遺伝子導 入MSCの評価を行った。
第1章は序論であり、本研 究の背景と目的を明らかに した。
第2章では、遺伝子導入法 の中でも安全性と導入効率 が高いとされるりポフェクション法とヌク レオ フェ クシ ョン 法 のヒトMSCに対する有効性 を比較した。その結果、ヌク レオフェクション法 の方がりポフェクション法 よりも約7倍も高い遺伝子導 入効率が得られ、ヌクレオフェクション法 がMSCに対して有効教遺伝子 導入法であることが確認さ れた。
第3章 では 、MSCに 対し て高 発現 が 得ら れる 高活 性顔 プ ロモ ータ ーの 構築 を 行う とと もに 、 そ れ ら のMSCの 軟 骨 分 化 に 対 す る 効 果 を 評 価 し た 。 その 結果 、 新規 に構 築し たCMVE‑C011A2 プ ロ モ ー タ ー に サ イ ト カ イ ン で あ るTCF‑B3の 遺 伝 子 を 連 結 し たpCMVE―C011A2p卩GF− ロ3 ベ ク タ ー をMSCに 導 入 す る と 、MSCは30nガml以 上 のTGF・ ロ3産 生 を 伴 っ て 従 来 のTGF‐ p3タ ンパ クの 添加 （10ng／川 ）に よ る軟 骨分 化法より顕著を軟骨分化を示 した。したがって、
pCMVE‐C011A2p屈 （ 預―p3ベ クタ ー は軟 骨再 生に 有望 橡 プロ モー ター であ る と考 えら れた 。 第4章 では 、実 際の 移植環境下に近いeXvlvo軟骨欠損モデルの作製を検討 した。その結果、ブ
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タ骨軟骨ディスクに作製した欠損内ではヒトMSCは分解されたが、骨を分離した軟骨ディスク上 の欠損内でヒトMSCは十分誼軟骨様組織を形成できることが確認された。したがって、異種のヒ トMSCでも評価可能誼軟骨欠損モデルの構築に成功した。
第5章では、第4章で構築した軟骨欠損モデルを用いてTGF‑ロ3遺伝子を導入したMSCの軟 骨再生に対する効果の評価を行った。最初に、TGF‑ロ3を添加してい顔い培地で軟骨ディスクを 培養すると、欠損内のMSCは軟骨マトリクスの少をい組織を形成したのに対し、TGF‑ガ3を含 む培地で培養するとMSCは豊富教軟骨マトリクスを含む軟骨様組織を形成した。この結果は過去 の動物実験での結果と一致したことから、本軟骨欠損モデルによって動物実験を再現できる可能性 が示唆された。また、軟骨分化培地で培養したMSCは欠損の表層で繊維芽状、欠損の深部で球状 の細胞形態を示し、これらの形態は天然の軟骨組織の表層と中間層に見られる軟骨細胞の形態とそ れぞれ類似していた。この結果から、本軟骨欠損モデルは移植下の微小環境を良く反映したモデル であると考えられた。最後に、第3章で構築したpCMVE‑C011A2p/TGF一ロ3ベクターを導入した MSCの軟骨再生に対する効果の評価を行った結果、pCMVE．C011A2p門（〕F‐グ3ベクターを導入 したMSCはTGF‐ロ3を添加した培地で培養したMSCよりも明らかに本来の軟骨に近い軟骨様 組織を形成した。この結果から、pCMVE‐C011A2p′rGF一ロ3ベクターが遺伝子導入MSCを用い た軟 骨再生 治療法に 有用極 ベクターDNAと教り得ることが組織レベルで明らかとをった。
これを要するに、軟骨再生に適したpCMVE‐ConA2p．パGFlロ3ベクターを構築するとともに、ex viVo軟骨欠損モデルの構築にも成功したことで、動物実験を行うこと教くpCMVE―C011A2p/TGF一 ロ3ベクターの有効性を明らかにしたものであり、動物細胞培養工学および再生医療工学に貢献す るところ大汝るものがある。よって著者は、北海道大学博士（工学）の学位を授与される資格ある ものと認める。
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