緒 言
イネ（Oryza sativa L.）の穎果はそのほとんどがデンプ ンで構成されていることから，イネにおいて，登熟とは穎 果へのデンプンの蓄積であると言える．デンプンは，主と してソース器官（主に葉身）に由来する光合成生産物がショ 糖に変換された後，篩部を通り葉鞘および稈（茎）を経由 して転流し，出穂開花後はこの時期において主要なシンク 器官である穎果へと蓄積される．しかしながら，出穂前に は，このショ糖は茎中で一旦 unloading され，デンプンと して変換，蓄積される．このような茎中でのデンプンの蓄 積は一時的であり，出穂後には再びショ糖に変換され，篩 部へ loading されて穂へと転流し，再度デンプンとして蓄 積する．このように，茎は出穂前まではシンク器官として， 出穂後にはこの時期での最大のシンク器官である穎果へと 同化産物を供給するソース器官として機能する． イネの育種目標のうち最重要課題の 1 つである多収性を達 成するため，これまでに穂当たり穎果数を増大する方策が専 ら採られ，ハイブリッドライスおよび New Plant Type 等の 極穂重型品種が多数育成されてきた（Peng et al. 1999）．一 方で，これら極穂重型品種では，2 次枝梗上穎果のような 登熟程度の低い弱勢穎果が主として増加したため，穂全体 としての登熟程度が低下し，このことが原因となって極穂 重型イネのもつ多収ポテンシャルを十分に発揮できない場 合がある（Kato and Takeda 1996, Kato et al. 2010）．このよ うな極穂重型品種の登熟程度向上には，シンク機能の改良 とともに（Kato et al. 2010）ソース器官からの同化産物供 給を増大することが肝要である．この場合，出穂後の茎に 蓄積されたデンプンは，可能な限りショ糖へと変換され穎 果へと転流されることが望まれる． 一方で，イネ植物体全体をホールクロップサイレージと する飼料イネの場合，穎果中のデンプンは籾の状態で供与 されるため消化性が低く（Kato et al. 2009），そのため消化 性に優る茎中へデンプンを蓄積させた状態を保つことが期 待される．この場合は，茎中のデンプンはショ糖へと変換 されないことが望ましい． このように，茎中でのショ糖−デンプン−ショ糖の代謝 およびその制御は重要な意味をもつが，これまでには，日 本晴などの単一品種について止葉節を含む上位節の炭水化 物代謝および代謝関連遺伝子発現の推移についての報告が あるものの（Hirose et al. 1999, Takahashi et al. 2005, Hiranoet al. 2011），茎中の炭水化物代謝等に関する遺伝子型の違 いについては十分に検討されていない．一方，加藤（2009） は通常の品種間変異では得られないような遺伝変異を検討 するため，選抜の加わっていないイネ組換え近交系 19 系 統を用い，出穂後の茎中非構造性炭水化物（NSC）含量の 推移について検討した．その結果，NSC 含量の推移には 明らかな系統間差異，すなわち遺伝的変異が存在すること， およびこの NSC 含量の推移に関する遺伝変異は登熟程度 等のシンク能力の遺伝変異と関連することを報告した．こ のような遺伝的差異を生み出す機構を明らかにすること で，茎中のデンプン代謝を遺伝的に制御する道が拓け，出 穂後に茎中のデンプンを効率的に穎果へと転流させること が出来れば極穂重型品種の登熟不良改善へ，また，茎中に
イネ組換え近交系の出穂後の稈におけるデンプン含量および
デンプン代謝関連遺伝子発現量の推移
久保竜一・堀端 章・加藤恒雄
近畿大学生物理工学部（〒 649 − 6493 和歌山県紀の川市西三谷 930） 要旨：出穂前のイネの茎中には同化産物がデンプンの形で蓄積されていて，出穂後にショ糖へ変換，穂へと 転流する．この時，茎中のデンプンを効率的に穂へと転流させることが出来れば，極穂重型品種で問題とな る登熟不良の解決に繋がると考えられる．また，逆にデンプンが茎に蓄積した状態を保つことが出来れば， 稲体をホールクロップサイレージとして活用することが期待できる．本研究では，出穂後の茎中非構造性炭 水化物含量について特徴的な推移を見せたイネ組換え近交系 9 系統（中生新千本／密陽 23 号由来）を用い， 出穂後の止葉直下第 1 節上の稈についてデンプン含量の推移を 3 カ年にわたって調査した．この内，年次変 動の少なかった 3 系統について，各種デンプン代謝・転流関連遺伝子の発現について調査した結果，出穂後 42 日目にデンプン含量が増加する系統では，登熟後期においてデンプン合成に関連する遺伝子である可溶 性デンプン合成酵素（SSIIIB）およびショ糖合成酵素（RSUS1）の発現が高くなる傾向が明らかになった． したがって，これらの遺伝子の発現は止葉直下第 1 節上稈におけるデンプンの再蓄積に寄与しており，その 発現を制御することは飼料イネ品種の開発にも貢献しうることが示唆された． キーワード：遺伝子発現，イネ組換え近交系，稈，定量 RT-PCR，デンプン代謝 2013 年 12 月 4 日受理 連絡責任者：加藤恒雄（[email protected]）デンプンを蓄積させた状態を保つことができればホールク ロップサイレージとしての飼料イネ品種育成へとつなげる ことが可能である． 本研究では，加藤（2009）が示したイネ組換え近交系 （RILs）のうち NSC 含量について特徴的な推移を示した 9 系統を用い，出穂後の茎中のデンプン含量の推移を 2009 年，2010 年および 2012 年の 3 カ年に亘り調査した．この うち年次を通じて安定した推移傾向を示した系統につい て，2012 年には 8 種類のデンプン代謝および転流関連遺 伝子の発現量の推移を併せて検討した．これによって，茎 中の炭水化物動態に関わる遺伝変異の機構解明を目指し た．
材料および方法
植物材料 上記のように，イネ品種間交雑，中生新千本／密陽 23 号 F2由来 RILs のうち，出穂後の茎中 NSC 含量の推移に 関して特徴的な 9 系統を材料とした．両親の一つである中 生新千本は日本型の穂数型品種，他の密陽 23 号はインド 型の極穂重型品種であり，前者は後者に比べて出穂期が約 1 週間遅い． これらの 9 系統を 2009 年，2010 年および 2012 年のい ずれも 5 月中旬に粒状培土（粒状培土 2 号，宇部興産）を 充填した播種箱に播種し，無加温のガラスハウス内で育苗 した後，6 月中旬に近畿大学生物理工学部実験水田へ移植 した．栽植密度は株間 15cm，条間 30cm の 1 株 1 本植，1 系統 5 列，25 株／列とした．反復は設けず，系統をランダ ムに配置した．施肥量は 3 年ともに基肥として N:P:K を 6:6:6 g／m2，追肥として同じく 6 月下旬に 3:0:0 g／m2，7 月下旬に 3:4:4 g／m2施用した．水管理に関しては成熟期 まで灌水状態とし，病害虫防除に関しては慣行に従い適宜 行った． 3 年とも成育中に出穂日を系統単位で調査した．出穂後， 0，14，28，42 日目に，各系統から 2 株を地際から採取し， 各株内の大型の茎 1 本を 90℃で 3 日間乾燥させ保存した． 2012 年には，後述のように 3 系統についてのみ，上記の 採取と同時に他の 2 株について止葉直下第 1 節上の稈（止 葉節と止葉直下第 1 節の間の稈）を圃場から採取後，速や かに氷中で保存し直ちに液体窒素で冷却後，−80℃で保存 した．また，2012 年には供試系統について，成熟後の 5 株に関する農業形質を計測した． デンプン含量の測定 2009 年及び 2010 年においては，止葉節と止葉直下第 1 節上の葉鞘および稈について，また 2012 年には後述のよ うに止葉直下第 1 節上の稈のみについてデンプン含量を調 査した．前述の乾燥後の試料をミキサーミル（MM 301， Retche）によって粉砕し，約 60mg を精秤後，80℃から 85℃下で 20 分間 80％エタノール（v／v）によってエタノー ル可溶性画分を 3 回除去し，残渣を乾固させ，この試料を基 に Starch Assay（GO／P）Kit（STA-20，Sigma-Aldrich）を用 いて，キットの使用説明書に従って乾物重当たりデンプン 含量（％，w／w）を測定した． RNA 抽出および cDNA 合成 2012 年に採取，凍結保存した 3 系統の止葉直下第 1 節 上の稈について， RNeasy Plant Mini Kit（74904，QIAGEN） を用い，使用説明書に従って全 RNA を抽出した．抽出は 各系統，各採取時期の 2 株からそれぞれ行い 2 回反復とし た．得られた全 RNA を PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （RR047A，TAKARA BIO INC.）により使用説 明書に従ってゲノム DNA を除去した後に cDNA を合成し た． 定量 RT-PCR 合成した cDNA を鋳型として定量 RT（Real Time）-PCR を 行い，稈で働くと考えられるデンプン代謝関連酵素遺伝子， すなわち ADP グルコースピロホスホリラーゼ小サブユ ニット 2a（AGPS2a），ADP グルコースピロホスホリラー ゼ大サブユニット 3（AGPL3），可溶性デンプン合成酵素 IIIB（SSIIIB）， ショ糖合成酵素 1（RSUS1），ショ糖リン酸 合成酵素 1（SPS1），フルクトース−1，6−二リン酸合成酵 素（FBPase）（Ohdan et al. 2005）および β−アミラーゼ 3 （BAM3）（Hirano et al. 2011），そして茎中でのショ糖の loading と unloading に関与していると考えられるショ糖ト ランスポーター 1 遺伝子（SUT1）（Hirose et al. 1997）につ いて出穂後の発現量の推移を調査した．また，標準遺伝子 として，ハウスキーピング遺伝子であるイネポリユビキチ ン 1 遺伝子（RUBQ1）（Wang et al. 2000）を用いた．以上 の遺伝子およびプライマー配列を第 1 表に示す．プライ マー設計は，タカラバイオ社のリアルタイム PCR プライ マー設計ガイドライン（http://www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/ prt3-1.pdf） に 従 っ た． 定 量 RT-PCR 反 応 に は SYBR® Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（RR041A，TAKARA BIO INC.）を用い，使用説明書に従って反応液を調整した．そ の後 Applied Biosystems 7300（Applied Biosystems，Inc.） により，定量 RT-PCR 反応を行った．定量 RT-PCR の反応 温度の設定は PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser （RR047A， TAKARA BIO INC.）の使用説明書を基準とし， サイクル数を 50 回，反応液の量を 20μl に変更した．実験 結果は，反応後の融解曲線で非特異的増幅が見られないこ とを確認した後，それぞれのサンプルの発現量を比較する 上で最適な時点での Ct 値（反応サイクル数）を求めた． RUBQ1 の Ct 値を S，対象遺伝子の Ct 値を T とし，各遺 伝子の RUBQ1 に対する相対発現量を 2S／2Tとして算出し た．結果および考察
第 2 表に，供試 RILs9 系統の 2012 年における農業形質 を示す．農業形質中の多くは系統間で大きく異なっていた ものの，到穂日数についてはいずれの系統も極端に異なる 値を示さなかった．これらの系統の出穂後のデンプン含量 の推移を解析するに当たり，まず，稈と葉鞘の推移をみた ところ，稈の方がより顕著な系統間差異を示した（データ 省略）．さらに，止葉節上および止葉直下第 1 節上の稈の 各採取時期でのデンプン含量について 2009 年と 2010 年の 間の年次間相関係数を求めた（n＝36）．その結果，年次 間相関係数は止葉節上稈で r＝0.397（P＝0.0166），それに 対して止葉直下第 1 節上稈で r＝0.616（P＜0.0001）と， 止葉直下第 1 節上稈においてより高い年次間相関係数が得 られた．したがって，出穂後の稈のデンプン含量の推移は 止葉直下第 1 節上稈において年次変動が小さく，遺伝的要 因により制御されている可能性が高いことが示唆された． これらに基づき，2012 年は止葉直下第 1 節上稈のデンプ ン含量の推移に関してのみ調査を行った． 以上のようにして得られた 2009 年，2010 年および 2012 年，3 カ年における供試 9 系統の止葉直下第 1 節上稈のデ ンプン含量の推移を第１図に示す．このように，RILs9 系 統間には，加藤（2009）が，茎全体の NSC 含量で認めた ような変異が，デンプン含量の推移に関しても観察された． すなわち，デンプン含量は出穂後継続的に減少を続けるも の（系統 236，254），出穂後 14 日目で最大に達した後に 減少に転ずるもの（2012 年の系統 251，252，2009 年の 281），出穂期以降減少するが出穂後 42 日目に増加するも の（系統 243，2010 年の 248，258），出穂後 14 日目で最 大に達し減少するが出穂後 42 日目に再び増加するもの （2012 年の系統 248，281，2010 年の 252）そして出穂後か ら増加を続けるもの（2012 年の系統 258）等が見られた． 中でも系統 236，243，254 は，デンプン含量の推移に関し て 3 カ年を通してほぼ一定の傾向を示した．上記のように， デンプン含量は系統 236 および 254 では出穂後継続的に減 少するものの，系統 243では出穂後42日目に増加していた． 出穂後 42 日目には穎果の成長は完了しているので，系統 243 のようにこの時期にデンプン含量が増加する系統は， 茎に同化産物を蓄積する飼料イネに，それに対して系統 236 および 254 のようにこの時期に増加しない系統は穎果 へと同化産物のほとんどを転流させる多収イネに，それぞ れ対応すると考えられる．そこで，デンプン含量の推移に 第 1 表 イネ止葉直下第 1 節上稈における遺伝子発現量を調査した遺伝子1［F］；Forward primer，［R］；Reverse primer，） 2）標準遺伝子として用いた．
全て 5 回反復の平均値．括弧内は標準誤差を示す． 第 2 表 2012 年に供試したイネ RILs9 系統の農業形質
関して年次間変動が少なく特徴的な推移を示すこれら 3 系 統について，デンプン代謝関連酵素遺伝子および転流関連 遺伝子の発現を検討した． 2012 年におけるこれら 3 系統の出穂後の止葉直下第 1 節 上 稈 に お け る デ ン プ ン 代 謝・ 転 流 関 連 遺 伝 子 等 の RUBQ1 相対発現量の推移を第 2 図に示す．その結果，8 種 の遺伝子の中で相対発現量が特に高いものは RSUS1 と
SSIIIB であった．この RSUS1 と SSIIIB は，いずれもショ
糖からデンプンを合成する代謝経路において機能し，前者 はショ糖からグルコース−1−リン酸へ，後者は ADP グルコー スからデンプンへ，すなわち代謝経路のそれぞれ最初と最 後の段階に関与する．系統 236 および 254 は，出穂後継続 的にデンプン含量が減少した系統であるが，これら系統で は SSIIIB の相対発現量が全期間を通して低い水準で推移し た．これに対して，出穂後 42 日目にデンプン含量が増加 した系統 243 においては，上記の SSIIIB 相対発現量は他の 2 系統に比べ，出穂後 28 日目および 42 日目において大き く増加した．また RSUS1 に関しても，系統 243 において は出穂後 28 日目でのみ本遺伝子の相対発現量が増加する 傾向にあった．以上の結果から，系統 243 において，系統 236 および 254 と比べて登熟後期もしくは粒重増加期終了 後に稈のデンプン含量が増加するのは，この時期において デンプン合成関連遺伝子である RSUS1 および SSIIIB の発 現量増加と関連すると考えられる．RSUS1 の発現に関して 第 1 図 イネ RILs9 系統の出穂後の止葉直下第 1 節上稈におけるデンプン含量の推移． 2009 年， 2010 年， 2012 年 全て 2 回反復の平均値．エラーバーは標準誤差を示す．
は，稈のデンプン含量が増加しない系統 254 においても出 穂後 42 日目にやや増加していたが，この原因については 不明である． なお，相対発現量は前述の 2 遺伝子に比べ非常に低いも のの，同じくデンプン合成関連遺伝子である AGPL3 にお いても系統 243 で出穂後 42 日目に増加する傾向がみられ た．デンプン分解に関わる BAM3 の発現が出穂後 28 日目 の系統 243 において増加したが，この点についても不明で ある． 本実験の結果では，止葉直下第 1 節上稈においては， RSUS1 および SSIIIB 以外の遺伝子の発現量は標準遺伝子に 比べて極めて低くなっていた．一方，Hirose et al.（1999）お よび Ohdan et al.（2005）は，β−アミラーゼ，ショ糖リン 酸合成酵素等，デンプンの分解，ショ糖合成に関する遺伝 子が出穂後に発現することを報告している．しかし，これ らの結果はすべて葉鞘を材料として得られたもので，本実 験のような稈における結果ではない．したがって，今後は 稈とともに葉鞘における遺伝子発現およびデンプン含量の 推移についても検討する必要がある．さらに，デンプン含 量および SSIIIB と RSUS1 の発現量に関して特徴的な推移 がみられた系統 243 と 236 および 254，あるいは RILs の 両親である中生新千本と密陽 23 号の間で，これら遺伝子 のコード領域および発現制御領域での塩基配列多型が存在 するかを検討する必要がある．
引用文献
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第 2 図 イネ RILs3 系統の出穂後の止葉直下第 1 節上稈における 8 種のデンプン代謝・ 転流関連遺伝子発現量の推移．
；236， ；243， ；254 全て 2 回反復の平均値．エラーバーは標準誤差を示す．
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Dynamics of Starch Content and the Expression Profile of the Genes Involved in Starch
Metabolism in Culms of Rice Recombinant Inbred Lines after Heading.
Ryuichi Kubo, Akira Horibata and Tsuneo Kato
Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kinki University
（930 Nishimitani, Kinokawa, Wakayama 649−6493, Japan）
Summary: Photoassimilates are accumulated as starch at rice stems before heading, are converted to sucrose, and are translocated to panicles after heading. Efficient translocation of photoassimilates to panicles should be a key to improve poor grain filling of rice cultivars with numerous spikelets per panicle. On the other hand, rice cultivars accumulating photoassimilates at stems should be utilized in the development of forage cultivars as whole crop silage. In this study, we investigated the starch content of the culms on the first node below frag leaf after heading for three years (in 2009, 2010 and 2012), using 9 rice recombinant inbred lines (RILs) (derived from Nakateshinsenbon / Milyang 23) which showed characteristic dynamics of non-structural carbohydrate contents after heading. Among these RILs, we selected three RILs showing stable dynamics in starch contents in culms among different years, and examined the expression of genes involved in starch metabolism in this organ. Results showed that one RIL, which increased the starch content at later stages of grain filling, tended to increase the expression levels of genes for soluble starch synthase (SSIIIB) and sucrose synthase (RSUS1), both of which are involved in starch synthesis pathway. However, other two RILs, which did not show such re-accumulation of the starch content, also showed no increase in the expression levels of these two genes. These results suggested that the expression of these two genes would contribute to the re-accumulation of starch content at the first node culm, and could be available to develop forage rice cultivars.
Key words: Culm, Gene expression, Quantitative RT-PCR, Rice recombinant inbred line, Starch metabolism
Journal of Crop Research 59 : 17 − 22（2014） Correspondence : Tsuneo Kato（[email protected]）
