2017-3
サーモフィッシャーサイエンティフィック ライフテクノロジーズジャパン テクニカルサポート
目次
Ion Reporter
概要とメタゲノム解析
Ion16S Metagenome Kit
データ解析概略
解析実行手順
解析実行結果
カスタムプライマー利用時の
Workflow
作成
サポート情報
p.3
p.9
p.14
p.19
p.26
p.35
IonReporter
™Software
• シーケンサとのダイレクトな統合
• 簡便なグラフィカルユーザインタフェース(GUI)
単一サンプルの解析 単一サンプルの解析 単一サンプルの解析 単一サンプルの解析 – リファレンス配列との相違 ペアサンプル解析 ペアサンプル解析 ペアサンプル解析 ペアサンプル解析 – 二つのサンプル間の変異箇所の差異と共通性 癌の体細胞変異ペアサンプル解析 癌の体細胞変異ペアサンプル解析 癌の体細胞変異ペアサンプル解析 癌の体細胞変異ペアサンプル解析 – 正常細胞と共通する変異を除外して、癌細胞特異的な変異を抽出 遺伝性疾患のトリオ解析 遺伝性疾患のトリオ解析 遺伝性疾患のトリオ解析 遺伝性疾患のトリオ解析 – 家族内の変異解析
CNV （（（（Copy Number Variation）））） 解析解析解析解析
– 単一サンプル/ペアサンプルのCNVの検出 融合遺伝子解析 融合遺伝子解析 融合遺伝子解析 融合遺伝子解析 – 癌細胞特異的な融合遺伝子を検出可能 ※カスタムデザインにも対応 16Sメタゲノム解析メタゲノム解析メタゲノム解析メタゲノム解析 – 細菌の属/種レベルでの分類
IonReporter
™が対象にする解析
IonReporter
の画面構成
Help資料 タブ：機能の選択 使用データ容量 Passwordの変更など 主な機能へのショートカット サポートへのリンク、フィードバックなどトレントサーバから直接データデータアップロード
・ランの完了後、専用のプラグインからデータを安全にクラウドに送信 ・共同研究者と解析データのシェアも可能 VARIANTS and ANNOTATIONS 共同研究者と結果のシェア IonReporterUploderプラグインプラグインプラグインプラグイン 自動もしくは手動でデータアップロード BAMファイル手元の
PC
からデータアップロード
・解析結果のBAMファイルが自PCのみにしかない場合に有効 （BAMファイルの転送には、IonReporterUploaderスタンドアローン版とコマンド操作が必要） VARIANTS and ANNOTATIONS ファイルの手動 アップロード可能 User PCIon16S Metagenomics Kit
＆データ解析
・ サンプル調製：チューブ2本で複数の可変領域を増幅（V2,4,6 & V3,6,9） ・ データ解析 : Ion Reporter による専用パイプラインと２つのデータベースとの連携 ・ メタゲノム解析のポイントとなる２プロセスのソリューションを提供 16Sメタゲノムのライブラリ作製～解析をトータルサポートメタゲノムのライブラリ作製～解析をトータルサポートメタゲノムのライブラリ作製～解析をトータルサポートメタゲノムのライブラリ作製～解析をトータルサポート プライマーセット & 増幅試薬 V6 1 200 400 600 800 1000 1200 1400 1542 V 1 V2 V3 V4 V 5 V 7 V 8 V 9 メタゲノム解析パイプライン & データベースデータセットとの連携
・キャピラリーで実績のあるMicroSEQ®ID ・公的データベースのGreenGenes ２つの参照配列データセットを提供 ２つの参照配列データセットを提供２つの参照配列データセットを提供 ２つの参照配列データセットを提供 1. MicroSEQ® ID 2. GreenGenes • Trusted gold-standard• Full length 16S sequences
• > 15,000 Organisms
• Manually curated for
• Sequence quality
• Length
• Annotation
• Phylogeny
• Taxonomy updates
• Public 16S data resource
• Commonly used in 16S studies
• Minimal curation
• Over 1.2 million entries
Ion Reporter™ 16S
メタゲノム解析機能
Kronaによるパイチャート作成機能 分類法の各階層における割合の表示 (class,order,familyなど) 解析データのダウンロード［領域ごと］
［全領域］ 全領域 全領域 全領域 全領域またはまたはまたはまたは、、、、領域領域領域領域ごとのごとの細菌ごとのごとの細菌細菌細菌ののの同定の同定同定同定 存在比率 存在比率存在比率 存在比率のののの結果結果結果結果をををを表示表示表示表示QIIMEの解析アルゴリズムの利用、各プライマー別の結果の出力が可能にの解析アルゴリズムの利用、各プライマー別の結果の出力が可能にの解析アルゴリズムの利用、各プライマー別の結果の出力が可能にの解析アルゴリズムの利用、各プライマー別の結果の出力が可能に
Alpha diversity
Species, Genus, Familyレベルでの
希薄化曲線（rarefaction curve）作成
Beta diversity
複数サンプル間の相対比較
Primer set-specific results export
Ion™ 16S Metagenomics kitにおける 各プライマー別の結果の出力
解析の実行
（複数通りの実行方法あり）
②Analysesタブ⇒Launch を選択、またはLaunch Analysis⇒Manual ① Homeタブの画面からAnalysesのLaunch analysisをクリック
Application>Metagenomicsで検索・絞り込みを行い、
Metagenomics 16S ワークフローを選択して、Nextをクリック
解析の対象にするサンプルのチェックボックスをオンにして、Nextボタンをクリック ※複数サンプルの比較する場合、複数個にチェックをいれる
解析の開始
Analysis Nameを入力し、設定を確認して、Launch Analysisをクリック
解析の進捗は、AnalysesタブのOverviewで確認可能 （解析が完了するとメールで通知）
進捗の確認
AnalysesタブのOverviewで、 解析のStatusがSuccessfulになっていることを確認し、
Analysis名をクリック
結果の参照例
※FAQ
Slash call : 複数種に割り当てられて区別できないリードの数
Valid read: リードの長さが十分にあり、リードの量が十分にあると判断できるリード
結果の参照例
α
diversity
X軸：出力リード数
Y軸：各分類階層での検出数
結果の参照例
β
diversity
主な算出値が出力されます。(4サンプル間解析の場合の出力例) Eigvals(固有値) 1406098704.33 741647189.944 402247094.472 9.03382897377e-08 Proportion explained(寄与率) 0.551412772717 0.290842834947 0.157744392336 3.54268776958e-17 Site(各成分のスコア) S001 -24144.7007804 -7258.51383869 10312.0764465 0.000150281643704 S002 -4043.21694563 -9018.07516874 -15902.8334439 0.000150281643704 S003 -215.219527503 23552.1164209 -904.606662561 0.000150281643704 S004 28403.1372536 -7275.52741348 6495.36365991 0.000150281643704 各サンプルで得られたリード情報を元に、主成分分析により、 サンプル間の特徴の違いを評価します。 参考資料； 主成分分析とは http://www.macromill.com/landing/words/b007.html http://home.a02.itscom.net/coffee/tako04Annex01.html以下のような場合に、Workflowの作成やコピーを行う
Workflow
の作成とコピー
• Workflowの作成 - カスタムプライマー利用時やAmpliSeqカスタムパネルの解析するとき - パラメータを変更した新規のWorkflowを作成したいとき • Workflowのコピー - 既存のWorkflowの設定を利用したいとき ⇒ 作成・コピーしたWorkflowの設定は後で編集が可能 Workflowの管理は、Workflowsタブから行う(1) Workflowsタブから、Create Workflow をクリック
Workflow
の作成（１）
(3) リファレンスを選択し、Next をクリック（２種類を選択の場合はCtrlボタンを押しながら選択ください。）
※始めは両方を選択して実行を推奨
(3) 利用したプライマー情報を入力し、Next をクリック
※この際、FASTAファイルのUploadか直接入力のどちらかの方法で入力します
Workflow
の作成（３）
※ForwardとReverseをセットで入力してください。
(7) メタゲノム解析におけるパラメータ設定を確認したら、Next をクリック
※始めはデフォルトパラメータでの実行を推奨
(8) Workflow 名を入力し、Save Workflowをクリック
Workflow
の作成（５）
(1) 編集したいWorkflow 名を選択し、Actions⇒Edit をクリック
Workflow
の編集
Workflow
のコピー
(1) コピーしたいWorkflow 名を選択し、Actions⇒Copy をクリック
IonReporter Help
資料
ログイン画面の右上にある“Help”から、IonReporter の詳細な操作手順書を閲覧可能
Technical Support
Call 0120-477-392
jptech@thermofisher.com
営業時間：午前
9
時から午後
6
時まで
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弊社テクニカルサポートまで
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