細胞内分解性ポリロタキサンを基盤としたニーマンピック病 C 型治療薬の開発東京医科歯科大学生体材料工学研究所有機生体材料学分野助教田村篤志教授由井伸彦

(1)

東京医科歯科大学

生体材料工学研究所有機生体材料学分野

助教田村篤志

教授由井伸彦

細胞内分解性ポリロタキサンを基盤とした

ニーマンピック病

_{C型治療薬の開発}

(2)

ライソゾーム病

分解酵素等の変異により

リソソームに脂質・

糖質等が蓄積

する疾患の総称

（50種類以上の疾患群、日本では約

30種類

が特定疾患に指定）

進行性神経後退、運動機能障害、骨形成不

全など示す難治性疾患

常染色体劣性遺伝症、X連鎖劣勢遺伝症の

ため患者数は少ない（数万人に１人程度）

(3)

ニーマンピック病

C型（NPC病）

原因：リソソーム上の

膜タンパク質NPC1

の変異による輸送障害

→ リソソームに

コレステロールが蓄積

症状：進行性神経後退、肝脾腫 → 幼児期より発症する致死的疾患

治療法：有効な治療法は確立されていない

Filipin

コレステロールの

Filipin染色

20 m

正常細胞

NPC病細胞

(4)

従来技術とその問題点

Hydroxypropyl--cyclodextrin (HP--CD) 高水溶性・低毒性の-CD誘導体

NPC病治療における

-CD誘導体の問題点

・投与後速やかに腎排泄

・血中成分、細胞膜と作用

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2377 (2009), PLoS One 4, e6951 (2009), Sci. Transl. Med. 7, 276ra26 (2015)

・高濃度では

組織障害性、急性毒性、聴力低下

を示す

（高濃度化には限界といったジレンマ）

極端に高濃度での投与が必要

(約100 gのHP-

-CDを点滴)

コレステロール包接・可溶化

コレステロール除去作用

(Filipin染色)

NPC1 fibroblast NPC1 fibroblast + 10 mM HP--CD

NPC病モデルマウスの生存期間延長

Npc1-/- _Npc1 -/-+HP--CD WT

(5)

ポリロタキサン

環状分子

シクロデキストリン

線状高分子

嵩高いキャッピング分子

A. Harada et al. Nature 356, 325 (1992)

rot

a（回転） +

ax

is =

polyrotaxane

A. Tamura, N. Yui Chem. Commun. 50, 13433 (2014)

分解性結合

分子可動性

(6)

新技術の特徴

ポリロタキサンの利点

1. CD空洞部がポリマー鎖で占有

、血中・細胞膜のコレステロールとの作用や障害性を回避

2. ポリロタキサンは

CDと比較して

高分子量

となるため、腎排泄を回避

3. 細胞内で分解

し、リソソーム内のコレステロールと作用

Hydrophilic functional group Cleavable linker

(7)

酸分解性

PRXの設計

N

-Trt基の酸分解反応

HEE-PRX

axle polymer： Pluronic P123

(M

_n,PPG

: 4000, M

_n,PEG

: 1100×2)

-CD貫通数： 14.2

HEE基修飾数: 90

M

_n

: 35,000

N

-triphenylmethyl

（N

-Trt）基

弱酸性環境でN

-Trt基が分解、ポリロタキサン骨格が崩壊し、

-CDを放出

HEE-PRX

2-hydroxyethoxyethyl(HEE)基

（水溶性の付与）

(8)

各

pHにおけるPRXの分解挙動

HEE-PRX

HEE-

-CD

PRXからのN-Trt基の脱離速度

pH 4~9、37

o

_{Cで所定時間静置後、N-Trt基の脱離量をHPLCで定量}

(pH 4~5.5: acetate buffer, pH 6~9: phosphate buffer, PRX conc.: 10 mg/mL)

0

12

24

36

48

0

20

40

60

80

100 pH 7.4

pH 6

pH 5

Cleaved N-Trt group (%)

Time (h)

pH 4

10

11

12

13

14

15 pH 9

Elution volume (mL)

pH 6

pH 5.5

pH 7

pH 6.5

pH 8

pH 7.4

pH 5

pH 4

24時間後のSECクロマトグラム

生理

pHでは長時間安定であるが、酸性pHではTrt基が脱離し超分子構造が崩壊

(9)

コレステロールの包接能

各pHで過剰量のコレステロールと混合、37

o

_{Cで24時間振とう後の溶解度をHPLCで定量}

生理条件では

PRX構造により包接が阻害、酸性pHでは

-CD放出による包接作用

0

10

20

30

40

50

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 pH 5

HP-



-CD, pH 7.4

HP-



-CD, pH 5

HEE-PRX, pH 7.4

HEE-PRX, pH 5

Solubility of cholesterol (mM)

Concentraion of



-CD (mM)

pH 7.4

pH 5

pH 7.4

(10)

PRX構造によるCDの障害性回避

赤血球の溶血

細胞生存率

Incubation: 2 h at 37o_C _{Incubation: 24 h at 37}o_C

PRXはCD空洞部を塞いだ構造のため細胞膜中のコレステロールを引き抜かず

-CDの溶血・細胞毒性を回避

細胞膜からの

コレステロール抽出

Incubation: 2 h at 37o_C 0.1 1 10 0 20 40 60 80 100 H e molysis (%) Concentration of -CD (mM) 0.1 1 10 0 20 40 60 80 100 C e ll via b ility (%) Concentration of -CD (mM) 0.01 0.1 1 10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Cho lestero l efflux (nmo l/10 5 c e lls) Concentration of -CD (mM)

PRX

HP--CD

PRX

HP--CD

PRX

HP--CD

(11)

PRXの細胞内局在

HP-

-CDは細胞膜上へ集積するのに対し、PRXは後期エンドソームへ局在

→ PRXは細胞膜成分と相互作用しないため、CDよりも取り込み効率が高い

Phase contrast

Early endosome

Late endosome

Lysosome

anti-EEA1

DAPI

anti-CD63

DAPI

anti-LAMP1

DAPI

FITC-HP-

-CD

FITC-PRX

NPC病患者由来皮膚線維芽細胞（NPC1にP237S, I1061Tの変異）

Incubation: 24 h at 37

o

_C

20 m

(12)

NPC病由来細胞におけるコレステロール量変化

コレステロールの

Filipin染色

細胞内総コレステロール量の変化

・NPC病患者由来皮膚線維芽細胞（NPC1）（P237S, I1061T）、健常者由来皮膚線維芽細胞（NHF）

・24時間接触後に染色、あるいは細胞溶解液中のコレステロール量を酵素法で定量

treatment: 24 h

normal level NPC1 level 0 120 140 160 180 200 220 240

Total cholesterol (nmol/mg of protein)

－－－－ 0.1 － 1 － 10 －－ 0.01 － 0.1 － 1 untreated untreated HP--CD (10 mM) HEE-SS-PRX (1 mM) normal fibroblasts NPC1 fibroblasts

NPC1 fibroblasts

normal NPC1

20 m

HP--CD (mM) PRX (mM-CD)

(13)

NPC病におけるオートファジー機能異常

オートファジー

：不良タンパク質やオルガネラをオートファゴソームに取り込み、リソソームで分解する機能

通常培地

貧栄養培地

2h

GFP-LC3-HeLa

GFP-LC3

基底状態：細胞機能維持のため一定レベルで発生

誘導：栄養飢餓などのストレスによって誘導

NPC病患者由来

皮膚線維芽細胞

正常皮膚線維芽細胞

anti-LC3

DAPI

NPC病では、オートリソソーム形成不全により基底

状態で細胞質にオートファゴソームが蓄積

（NPC病におけるオートファジー機能の低下は病態

の原因と指摘）

M. J. Elrick et al. Hum. Mol. Genet. 21, 4876 (2012) S. Sarkar et al. Cell Rep. 5, 1302 (2013)

(14)

オートファゴソームの形成評価

WBによる定量的評価

0 100 200 300 400 500 600 LC3-II/-actin p62/-actin Rel a ti v e ex pres s ion l e v e l normal NPC1 －－ HP--CD HEE-SS-PRX －－＋－－＋

免疫染色によるオートファゴソームの蓄積評価

treatment: 24 h untreated untreated HP--CD (10 mM) HEE-SS-PRX (1 mM) normal fibroblasts NPC1 fibroblasts

NPC1 fibroblasts

HP-

-CDとHEE-SS-PRXはオートファジーに対して正反対の作用、

PRXはオートファジーによるタンパク質分解機能を正常レベルまで改善

anti-LC3 DAPI

(15)

0

10

20

30

40

50 Number of mRF

P

+

-EG

F

P

-

puncta/cel

l

0

20

40

60

80

100 N

u

mber of mRFP

+

-EGFP

+

puncta/cell

autophagic fluxの評価

untreated

HP--CD (10 mM)

HEE-SS-PRX (1 mM)

normal fibroblasts

NPC1 fibroblasts

mRFP-EGFP-LC3

DAPI

オートリソソーム数

オートファゴソーム数

transfection for 24 h, treatment with samples for 24 h

NPC1 fibroblasts

untreated untreated HP--CD HEE-SS-PRX normal NPC1 10 m *** * * **** **** NS NS NS untreated untreated HP--CD HEE-SS-PRX normal NPC1

PRXはオートリソソーム形成を促進、正常細胞と同程度までオートファジー機能を改善

(16)

NPC病モデルマウスを用いた治療効果評価

S. K. Loftus et al. Science 277, 232 (1997)

-3 w 0 w

2 w

3 w

交配出生

皮下投与

（週１回）

Genotyping

離乳

20 w

NPC1欠損モデル（BALB/cNctr-Npc

m1N

_）

実験スケジュール

・生存期間

・体重変化

・運動機能

歩行失調等よりスコア化

(17)

NPC病モデルマウスの表現型

20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30

Body w

e

ight (g)

Age in days

20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 12

At

axia score

Age in days

0 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Survival r

a

te (%)

Age in days

体重変化

運動失調スコア

生存期間

WT mice

Npc1

-/-

mice

Npc1

-/-

mice

Npc1

-/-

mice

NPC病モデルマウスは6週齢より体重減少と運動機能の低下、

平均生存期間は71.3日

(18)

皮下投与後の薬物動態

Hilyte Fluor 680（Ex: 688 nm, Em: 700 nm）を修飾した試料をWTマウス（5w, ♂）に皮下投与

所定時間経過後の蛍光強度をIVIS Lumina XRMS Series IIIで測定（n=5）

1 h

2 h

5 h

24 h

Hily

te

Fluor

680-

HP--CD

Hily

te

Fluor

680-HEE-PRX

1 2 3 4 ×1010 _([p/sec/cm2/sr]/[W/cm2_])

48 h

HEE-PRXはHP-

-CDよりも投与部位からの消失が遅く、体内に長くとどまる

0 12 24 36 48 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 R a diat ion ef fi c ienc y (x10 12 [p /se c /cm 2 /sr]/[  W/c m 2 ]) Time (h) Hilyte680-HP--CD Hilyte680-HEE-PRX

(19)

24時間後の組織分布

brain heart lung spleen

liver kidney

Hilyte Fluor 680-HP-

-CD

Hilyte Fluor 680-HEE-PRX

brain heart lung spleen

liver kidney

PRXは

-CDと比較して肺、腎臓への集積が低下

（

PRXも腎排泄を受けるが、

-CDよりも程度が低い）

治療に重要な能や肝臓への集積は

-CDと同程度

組織重量あたりの蛍光強度（24h）

brain heart lung spleen liver kidney

0

5

10

15

20

25

30

35

40 HP-



-CD

HEE-PRX

R

a

diat

ion ef

fi

ciency/

g

ra

m

of

t

issue

(20)

NPC病モデルマウスに対するPRXの効果

•PRXはNPC病モデルマウスの体重減少、運動機能の

低下を遅延

•PRXはシクロデキストリン単体よりも低濃度でNPC病

モデルマウスの生存期間を有意に延長

(21)

想定される用途

•シクロデキストリン単体よりも低濃度で作用するニーマン

細胞内分解性ポリロタキサンを基盤とした ニーマンピック病 C 型治療薬の開発 東京医科歯科大学生体材料工学研究所有機生体材料学分野 助教田村篤志教授由井伸彦

東京医科歯科大学

生体材料工学研究所 有機生体材料学分野

助教 田村 篤志

教授 由井 伸彦

細胞内分解性ポリロタキサンを基盤とした

ニーマンピック病

C型治療薬の開発

ライソゾーム病

分解酵素等の変異により

リソソームに脂質・

糖質等が蓄積

する疾患の総称

（50種類以上の疾患群、日本では約

30種類

が特定疾患に指定）

進行性神経後退、運動機能障害、骨形成不

全など示す難治性疾患

常染色体劣性遺伝症、X連鎖劣勢遺伝症の

ため患者数は少ない （数万人に１人程度）

ニーマンピック病

C型 （NPC病）

原因： リソソーム上の

膜タンパク質NPC1

の変異による輸送障害

→ リソソームに

コレステロールが蓄積

症状： 進行性神経後退、肝脾腫 → 幼児期より発症する致死的疾患

治療法： 有効な治療法は確立されていない

Filipin

コレステロールの

Filipin染色

正常細胞

NPC病細胞

従来技術とその問題点

NPC病治療における

-CD誘導体の問題点

・ 投与後速やかに腎排泄

・ 血中成分、細胞膜と作用

・ 高濃度では

組織障害性、急性毒性、聴力低下

を示す

（高濃度化には限界といったジレンマ）

極端に高濃度での投与が必要

(約100 gのHP-

-CDを点滴)

コレステロール除去作用

(Filipin染色)

NPC病モデルマウスの生存期間延長

ポリロタキサン

環状分子

シクロデキストリン

線状高分子

嵩高いキャッピング分子

A. Harada et al. Nature 356, 325 (1992)

rot

a（回転） +

ax

is =

polyrotaxane

A. Tamura, N. Yui Chem. Commun. 50, 13433 (2014)

分解性結合

分子可動性

新技術の特徴

ポリロタキサンの利点

1.

CD空洞部がポリマー鎖で占有

、血中・細胞膜のコレステロールとの作用や障害性を回避

2. ポリロタキサンは

CDと比較して

高分子量

となるため、腎排泄を回避

3.

細胞内で分解

し、リソソーム内のコレステロールと作用

酸分解性

PRXの設計

N

-Trt基の酸分解反応

HEE-PRX

細胞内分解性ポリロタキサンを基盤としたニーマンピック病 C 型治療薬の開発東京医科歯科大学生体材料工学研究所有機生体材料学分野助教田村篤志教授由井伸彦

生体材料工学研究所有機生体材料学分野

助教田村篤志

教授由井伸彦

_{C型治療薬の開発}

ため患者数は少ない（数万人に１人程度）

C型（NPC病）

原因：リソソーム上の

症状：進行性神経後退、肝脾腫 → 幼児期より発症する致死的疾患

治療法：有効な治療法は確立されていない

・投与後速やかに腎排泄

・血中成分、細胞膜と作用

・高濃度では

_{Cで所定時間静置後、N-Trt基の脱離量をHPLCで定量}

_{Cで24時間振とう後の溶解度をHPLCで定量}