[報文]好熱性糸状菌HG-1の生産する耐熱性キシラナーゼ: 沖縄地域学リポジトリ

Title

[報文]好熱性糸状菌HG-1の生産する耐熱性キシラナーゼ

Author(s)

石原, 昌信; 小野, 伸一; 赤嶺, 紀一郎; 当山, 清善

Citation

南方資源利用技術研究会誌 = Journal of the society tropical

_{resources technologists, 11(1): 1-7}

Issue Date

1995-10-20

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12001/14103

好熱性糸状菌

HG-

1の生産す る耐熱性 キシラナーゼ

石 原 昌信 ･小 野伸一 ･赤 嶺紀 一 郎 ･当 山清 書

(琉球大学農学部)

ThemostableXylanaseofThermophilicFungusHG-1

MasanobuISHIHARA,ShinichiONO,KiichiroAKAMINE,

andSeizenTOYAMA

CdlegeofAgTiculbTY,亡JniLeTSi& oftheR

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緒 言 キシランは植物細胞壁の主要成分であ り､ セ ルロースに次いで2番 目に含量の高い再生産可 能な多糖類である.同多糖 は

D

-キシロースの β-1,4 結合 を主鎖 とす るポ リマ ーで あ るが ､ 植物組織 においては側鎖 にアラビノースや ウロ ン酸等が結合 した複合多糖 として存在 している｡ 最近､アラビノースやウロン酸残基 には抗酸化 活性や抗菌活性を有 しているフェノール化合物 (フェルラ酸 や β-クマル酸等 ) が ェステル結 合 していることが明か とな り､糖 ･エステル化 合物の植物細胞壁中における機能が注 目されて いる1)｡ 他方 キシランは､近年 の石油 シ ョッ ク以来､セルロースとともに重要なバイオマス 資源 として位置づけられてお り､その資源化利 用に関す る研究が活発に推進 されている2･4･18)0 キシランの分解 には､主 として酸及び酵素 によ る方法が検討 されているが､エネルギー消費量 及び反応副産物の生成等を考えると酵素糖化法 に利点が多い｡ キシランの酵素糖化 には少な くとも2種類 の 酵素を必要 とす る｡ 即 ち､ エ ン ド-1,4-β-キ シ ラナ-ゼとβ-キシロシダーゼであ り､ 両酵素 の協同作用によって反応 は終了す る｡とりわけ､ 前者の酵素 はキシランの分解反応において最初 ◆903-01 沖縄県中頭郡西原町千原1 に基質へ作用 し､最終的にキシロースまで分解 し得 ることより､最 も重要な酵素であると考 え られている｡その中で も､微生物起源のキ シラ ナーゼは力価及び生産性の面で優れた特徴を有 して い るこ とか ら､ 広 く研究 が行 わ れ て い る3･9･12･16). しか し､ こで まで に特性が明 らか にされている酵素のほとんどが常温菌由来 であ り､好熱性菌由来の酵素に関す る報告文は比較 的少ない11･15)0 著者 ら5･ 6)は､サ トウキ ビバガス中のキ シラ ン成分の有効利用を目的 として､ コンポス ト中 か らキシラナ-ゼ高生産性の好熱性糸状菌 の分 離を行い､分離菌株の中か らHG- 1株を優良 菌株 として選抜 した｡本菌株 は､キシラナーゼ とともにセルラーゼ等を細胞外へ産生す ること が認め られたので､ これ らの酵素活性に及 ぼす 培地組成の影響及び酵素の特性について調べた｡ 実験方法

(

1

)

供試菌株 :本研究では､サ トウキ ビ葉 ･梢 頭部を原料 とす るコンポス ト中か ら分離 した好 熱性糸状菌を供試菌株 とした｡本菌株 はポテ ト 寒天培地上では白色の コロニーを形成 したが､ 胞子の形成 は認め られなか った｡供試菌株 の蘭 学的特徴の詳細については次報で述べ る｡ (2)培地組成 と菌の培養 :固体培地 は､小麦 フ スマと0.5%NaOH処理バ ガスを3:1の割合 で混

合 し､水分含量を 67%になるよ うに加えたの ち､ 120℃で20分間加圧蒸気殺菌 を行 った｡菌 の培養 は､供試菌株 の斜面培養菌体へ殺菌水 5.Oml加えて懸淘 した菌体 を固体培地へ注 ぎ込 み混合 した後､ 50℃で2日間静置 して行 った｡ 液体培地の組成 は､ 100mlあた りグル コース 0.5g､ペプ トン0.2g､燐酸第一カ リウム

0

.1g､ 燐酸第二カ リウム0.1g､酵母エキス 0.05g及 び硫酸ア ンモニウム 0.05gか ら成 り､培地 は pH6.0に調節 して用いた｡菌の培養 は､上記液 体培地100nlを振過 フラスコに採 り､常法通 り 20分間殺菌 したのち､前培養液5.Omlを接種 し､ 30℃で2日間振過 して行 ったO (3)租帝素液の調製 :酵素の抽出は､固体培養 菌体へ2倍畳の蒸留水を加え､室温で1時間保 持 して行 った.次に､ポ リエステルの布で液過 して得 られた抽出液を遠心分離により上澄液を 得､蒸留水に対 して透析を行い､粗酵素液 と し て用いたC液体培養の場合には､プフナ一波過 により得 られる濃過液を同様に透析を行 って粗 辞素液を調製 した｡ (4) 帝素活性の測定法 :アビセラーゼ活性の測 定は下記の様な手順によった｡即ち､酵素反応 の組成は､アビセルセルロース 20mg､ lM酢 酸援衝液 (pH 4.5) 0.2m1､ 0.2%窒化ナ トリウ ム0,2ml､及び適当な濃度の帝素液で総量を2.0 mlとし､ 40℃で24時間反応を行 った｡反応停 止 は､反応混液を煮沸することにより行い､冷 却後生成 された還元糖量 をSomogyi-Nelson

法により定量 した｡カルボキシメチルセルラー ゼ (CM Cア-ゼ)とキシラナーゼ活性の測定 は､基質のみを代え､その他は同一条件で行 っ た｡即ち､ 0.5% のC M Cまたはキ シラン0.8 mlにlM酢殻緩衝液 (pH4.5) 0.2ml及び酵素液 1.Omlを加えて総量を 2.Omlと した後､ 40℃で 30分間酵素反応を行 った｡次に､反応混液を10 分間煮沸することにより反応を停止 させ､冷却 後生成された還元糖量を測定 した｡各酵素活性 の1単位は､所定条件下で1時間あたり1喝の グルコースまたはキシロースを生成する酵素量 南方資源利用技術研究会誌 とした｡ 実額結果 1.酵素活性に及ぼす培養温度の影響 供試菌株の培養温度 と酵素生産性 との関係を 明 らかにする目的で､各温度で小麦フスマ培地 にて菌の培養を行い､得 られた粗酵素液につい てアビセラーゼ､ CM C ア-ゼ及びキシラナ-ゼ活性を測定 した｡ Fig.1に示 したように､供 .; : ･ .･ : ,... ' ., .: 叫 dU ＼ n .i () !^ T 3

3g

邑 N｡ 凹 30 40･50 60 70 TeTr耶 rature,℃

Fig.1 Effectofculdva丘on temper由11re On the

enzynTe production

Themx)philic fungusHGl1 which was isolated from compostheapsw耶 CulturedatvarioustemperatureforZ daysinpetridishcontainingwheatbran and0.5% NaOH treatedbaggasse(1:1),Aftx!rcultivation,theculture was

ddedtdceofdistilledwaterand dlowed to stLLnd at

room temperature for60 mi n to extEutenZyrrC.The obtaJnedextracts W redldlyzedagainstdisdHedwaterfor

ovemightandfollov爪ngenZymeaCtivides湘 reassayed,

Avicel8SeactivitywziSmeaSuredin2.0mlofa reacdon

m

ixturecontaining0.2mlof1M acetatebuffer,pH4.5.

20n唱 Ofavicelcellulose.and1.Omlofcnヱym8SOlution. Afterincubation at40 oC for24 hr,thert!actlOnW田

stoppedbyboilingforlO min and the reducing sugar formedwasdeterminedeLSglucosebytheSornogyi-Nelson method･CMC85eaCtivltyWasalso eLSSayedbyrneaSunng

t

hereducingsugarreleasedbytheactionofenzymeon carboxy-rrvthylcellulose(CMC). The LiSiSay mixture contained0.2 nlof1 M eLCetate buffer.pH4.5.0.8 ml

of0.5% CMC eLnd properly diluted enzyTTC ln atotal

voluTTB Of2.0nl.Afterincubationat40℃ for30 mi n, thereaLltionwastermi nated by bolting for10 m n in waterbath･Forxylanase acdvity.then三aCtlOn assaywas

perfomtedundercondldonsldenticalto those described

forCMCeLSebyrepleLClngSubstratefrom CMC toxyleul. Oneunitofcn町TrC eK;dvltyWasdefinedasthatamounts

ofenzymewhichproduces1 mg ofreduclng SugeLrper

hourunder仏eabovecondidons.(a)XylaneLSe (b)CMC

試菌株 は菌体外へ上記三種の酵素を産生 したが､ 何れの酵素活性 も菌を50℃で培養 した時に最 も 高 い値を示 した｡中で も､キシラナ∼ゼは他の 酵素 に比べて著 しく高 い値 を示 した ことか ら､ 分離好熱性糸状菌 はキ シラナーゼを主に生産す る菌であることがわか った｡菌の生育度及 び酵 素活性か らみた場合､本菌株の最適培養温度 は 50℃であると判断 されたので､以下の実験では 同温度 に培養温度を固定 した｡ 2.酵素活性 に及ぼす培養時間の影響 小麦 フスマ培地を用いて供試菌株の培養時間 における酵素活性の変動 につ いて調べ るため､

24

時間毎に試料を採取 し

､4

日間キシラナ-ゼ 及び CM Cア-ゼ活性 を追跡 した(Fig.2)｡両 酵素活性 は共 に培養

2

4

時間 目か ら認め られ､培 養時間の経過 とともに増大 し､培養

3

日目で最 大値に達 した｡ しか し､培養

4

日目には両酵素 活性共に低下す る傾向を示 した｡従 って､供試 菌株の固体培養における最適培養時間 は3日間 であることがわか った｡ 顎 ＼ n I倉 ^ 竃 2

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0 1 2 3 4 Cultivation.day Fig.2Effectofcltuivationtimeonthe

productionofcellulolyもcenzymes

Thefungusstran wai s incubated at50℃ for various tirres with solid culture m:dium After cultivation,CMCase and xylana鋸 aCtivitieS for eachsampleswert)m easured.(a)Ⅹylan ase(b)CM

Case

OtherconditionswerestatedinthelegendtoFig.1.

3.

帝薫活性 に及ぼす培地中のセルロース物質 の影響 一般にカビ由来のキシラナーゼやセルラーゼ は､培地へオ リゴ糖やセルロース物質を加 え る と誘導的に酵素活性が増大す ることが知 られて いる｡供試菌株において もそのようなことが認 め られるかどうかを調べた｡硝酸 アンモニ ウム を窒素源 とす る合成培地へ各種セルロース物質 を1.0%

(

W/V)

にな るよ うに加 え､50℃で 10 日間振過培養を行い､各酵素液のキシラナ-ゼ及びセルラーゼ活性 を測定 した(Table.1)0 キシラナーゼ活性は培地へバーチウッ ドキ シラ ンやサ トウキ ビバガスか ら調製 されたヘ ミセル ロースを加えた時に顕著に高い値を示 した こと より､キシラン等によって酵素が誘導 され るこ とがわか った｡ しか し､キシランの構成糖 であ るキシロース添加では活性増大 は全 くみ られな か った｡一方､ア ビセラーゼや CM Cアーゼ活 性 は用いた培地においては炭素源の違いによ っ て著 しい差異 は認め られなか ったが､バガスヘ ミセルロース含有培地で幾分高い値を示 した｡

Table1.E打ectofvariouscellulosicsubsteLnCeSin theliquidIT冶dium onenzym7Cproduction

C8血onsoul℃eS Avicelase CMCasE) Xyl8maSe

Pulveli次dbagasse 05% N80H加atedbageLSS8 Bag 貼68C811ulo誹 Baga砧￠holocellulos8 BagaBSeheZTicelluloSe BITChwoodxylan Wheatbran Xy1o岩e 1 RU 2 -1 0 0 9 4 4 . 3 2 8 1 5 1 0 0 0 0 0 1 0 0 7 Q U nO 1 2 0 4 3 2 2 2 4 3 3 ︻ 0 0 0 0 0 0 0 3 2 -1 4 3 2 0 0 0 0 0 0 o l 0 0 0 0 o o o

Therrx)ldwasculturedat50oCfor3dayswith liquidculturerredium containingindicatedcarbon

soumesundershaking.Aftercultivadon,theculture

wasfiltratedwithWhatrrwlnO.2papertoremove nwcerium anddialyzedagamstdistilledwaterfor

ovemi ght.ThecellulolyticenzyIⅧ activitieswere

4.液体培養 における酵素活性の変動 バガスヘ ミセルロースを炭素源 (1%

,

W/V)

とす る液体培養 におけ る酵素活性及 びpHの変 化について調べた(Fig.3)0 菌の生育 は培養5日目まではほぼ直線的 に増 大 したが､それ以後 は一定値を示 した｡培養液 のpHは菌の生育 に伴 って低下 し､pH5.0付近 を 推移 した｡ キ シラナ-ゼ､ ア ビセ ラーゼ及 び CM Cアーゼ活性 は菌 の生育 とともに増大 し､ 5日目で最大値を示 し､以後培養20日目まで一 定の値を維持 した｡キシラナ-ゼはセルラーゼ より培養期間を通 して高い値を示 し､培養20日 目においてはCMCア-ゼの約 2倍､アビセラー ゼの約8倍の値を示 した｡

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10 20 Cultivation.day Fig.3 TilⅧ courseOfgrDW払 andcenulolytic

enzyn7CSproductioninthehquidcultivation

Themoldwascultured at50℃ forindicated

timeswithliquidculturen℃dium containing ba･ gasse hemicellulose as a m由n carbon sources undcIちhaking.Aftercllltivation,mycerium growth, pH andenzyr陀 aCtivityweremeasured.

(a)Xylan ase(b)CMCase(C)Avicelase

5.酵素の最適反応 pH及び pH安定性 酵素の最適反応pHを調べ るため､各種pHの 緩衝液中で酵素反応を行なった｡結果を相対活 性で示 した (Fig.4-A)｡図か ら､ キ シラナー ゼの最適反応pHは5.0付近であ り､ ア ビセ ラー ゼ及びCM Cア-ゼのそれ は共 に4.0であ るこ 南方資源利用技術研究会誌 とがわか った｡ これ ら3酵素 はpH2において も約50%の活性を示 したが､ pH8以上 で は極 めて低い値であった｡次 に､酵素 を各種pHの 緩衝液中で30cc､60分間加温処理 した後､浅 存活性を&lj定す ることによ り酵素 のpH安定性 について調べた (Fig.4-B)0 図に示 した様 に､ キ シラナ-ゼは､ pH 3-7 の範囲で安定であり､pHIOにおいて も約 50% の残存活性を示 した｡一方 ､ ア ビセ ラーゼ及 び CM CアーゼはpH3-8の広 い領域 にお いて 100%の活性を保持 していたが､ pH9.5以上 の アルカ リ領域ではやや不安定であった｡ 0 0 0 5 10

%

･号

竃 a ^ ヨ a t I 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 pH pH

Fig.4 EffectofpH ontheactivityofenzymB a

nd enzymestability

Thecellulolyticenzym:activitywasassayedat

t

heindicatedpH(A).Theenjm Wasincubated

atvarious pIも md37℃ for60mi n,andtheI

℃-sidual activitywasassayedatpH 4.5(B). (a)xyknase(b)CMCase(C)Avicelase

6.

酵素の最適反応温度及び熱安定性 酵素の最適反応温度について調べるため､各 温度で常法に従 って酵素活性を測定 した｡結果 を相対活性で表示 した (Fig.5-A)｡ 図 よ り､ 3酵素の最適反応温度 は共に60℃であることが わか った｡ア ビセラーゼ及びCM Cアーゼは65 ℃において も60℃ と同程度 の活性 を示 したが､ キシラナーゼは約60%の活性であ った｡次 に､ 酵素を各温度､pH4.5で30分間加温処理 した後､ 残存活性を測定す ることによ り酵素 の熱安定 性を調べた (Fig.5-B)0 キ シラナーゼは60℃付近までは熱に対 して比

較的安定で あ ったが､ 70℃で は約70%の活性 を失 った.一方､ア ビセラーゼ及びCM Cア-ゼは 60℃ で加温処理 した後 で も100%の活性 を保持 してお り､極めて耐熱性であることがわ か った｡特にCM Cアーゼは､70℃で加温処理 した後で も高 い活性を有 してお り､耐熱性 に優 れていることが明 らかになった｡ 00 50 叩 % .含 > Tl 冶 a ^ ! 召 T au 30 40 50 60 70 80 30 LIO 50 60 70 80 Ter叩erature,℃ Terrperatu托,℃ Fig,5 Effectoftemperatureontheactivity

ofenzynTeand enzym :stability Theenzym:activltyWasa㍊ayed ai vahous temperature(A).The erLZyn!Wasincubated at varioustemperatu柁SandpH 4.5for30rrh.and theresidual activitywasassayed(B).(a)Ⅹylanase (b)CMCase(C)Avicelase

考

察

コンポス ト中か ら分離 された各種好熱性糸状 菌の粗酵素液についてキシラナ-ゼ活性を比較 した結果､HG-1菌株 に高 い活性 が認 め られた ので､同菌株の酵素生産条件 と酵素の性質 につ いて調べた｡ 本菌株 は､中温ではほとんど生育 はみ られな いが､50℃付近の高温で良好 な生育 を示 した｡ 粗酵素液 はキ シラン以外にア ビセルセルロース およびCM Cを某質 としたか､ これ らの分解率 はキシランに比べて低い値であ った｡ これ らの 酵素活性 は菌を50℃で培養 した時に最 も高い値 を示 した｡小麦 フスマ培地 への0.5%NaOH処 理バガスの添加効果 は認め られず､小麦 フスマ の含量が高い程酵素活性 も高い値を示 した｡小 麦 フスマがキシラナ-ゼ誘導に良い基質であ る ことは他の菌株 において も報告 されて い る3)0 また､木材 キシラン及 びバ ガスへ ミセル ロー ス添加でキシラナーゼ誘導が認められたが､ キ シロースでは認め られなか った｡細菌や酵母 で はキシロースによってキシラナ∼ゼが誘導 され たという報告17)もあり､菌種問で相違が あ る｡ 各種微生物 においてキシランがキシラナーゼの 誘導に最 も有効な糖類であると思われ るが､酵 素利用の観点か ら､キシランに代わる安価で調 製 が容 易 な誘 導 物 質 の検 索 が検 討 され て い る2110･13･"｡セルラ-ゼ活性はキシラン添加培地 で比較的高い値が得 られたが､添加効果は微弱 であった｡セルラーゼ活性がアルカ リ処理 バ ガ スによって誘導 された とい う報告 7)があ るが､ 供試菌株 においては顕著な添加効果 は認め られ なか った｡バガスヘ ミセルロース含有培地では､ 培養液の pH は菌の生育 に伴 って低下 し､ pH 5.0付近を推移 した0-万 ､帝素活性 は培養 5 日間ではぼ最高 となり

､2

0

日目まで同等の活性 を示 した｡ この結果か らも､ 3酵素が高温およ び酸性領域で安定であることが推測されたO キシラナーゼの最適反応 pH は5.0であ り､ ア ビセ ラーゼ及 び CM Cアーゼのそれ は共 に pH4.0であった｡また､最適反応温度 は 3酵素 共 に60℃付近 で あ った｡ これ らの 結 果 は､

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属のキ シラナ-ゼ､ セル ラーゼおよ Ulalar

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3CeS属のキシラナ-ゼ と異 な って い る日9)｡キシラナーゼは pH 3-7､ 7 ビセ ラー ゼ及びCMCアーゼ は pH 3-8 の範囲 で安定 であった｡キシラナーゼは60℃までは比較的安 定であったが､70℃以上では失活 した｡一方､ セルラーゼは著 しく耐熱性であり､特にCM C アーゼはH.Lmugm価α酵素 A)に匹敵す る熱安定 性を有 していた｡

要

約

サ トウキ ビ斐 ･梢頭部を原料 とす るコンポス トか ら分離 した好熱性糸状菌HG-1の酵素生産 性及び酵素の性質について調べた｡ 最 も生育が良好で酵素活性が高い培養温度 は 50℃ 付近であった｡粗酵素液 はバーチ ウ ッ ド キシランやバガスへ ミセルロスを良好 な基質 と

した｡ キ シラナ-ゼ活性 は､キ シラン含有培地 において誘導的 に増大 したが､キ シロース添加 培地で はその影響 は認 め られなか った｡酵素 の キ シラン､ア ビセルセルロース及 びCMC分解 反応 における最適反応温度 は共 に60℃であ り､ 最適反応 pHは 4-5であ った｡ ア ビセ ラーゼ 及 びCMCアーゼは PH 2-9の広 い領域で安定 であ ったが､キ シラナ-ゼは pH 7.0以上 で は 不安定で あ った｡ セ ル ラーゼ活性 は60℃ で30 分間加温処理 した後で も､100%の活性 を保持 していたが､キ シラナ-ゼは10%程度の失活が 認め られた｡ 引用文献

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