西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた遅延発色反応による銅(II)の定量

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(1)Title. 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた遅延発色反応による銅(II)の定量. Author(s). 森田, みゆき; 谷, 道子. Citation. 北海道教育大学紀要. 自然科学編, 57(2): 13-18. Issue Date. 2007-02. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/630. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 北海道教育大学紀要（自然科学編）第57巻第2号 JournalofHokkaidoUniversityofEducation（NaturalSciences）Vol．57，No．2. 平成19年2月 February，2007. 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた遅延発色反応による銅（Ⅱ）の定量森田みゆき・谷道子＊. 北海道教育大学札幌枚被服学・生活環境工学研究室＊札幌市厚別区在住. DeterminationofCopper（II）UtilizingaDelayed Color Development Reaction ThroughtheUseofHorseradishPeroxidase MORITAMiyukiandTANIMichiko＊ DepartmentofTextileandEnvironmentalSciences，SapporoCampus，HokkaidoUniversityofEducation，SapporoOO2−8502. ＊Atubetu−ku，Sapporo，004−0002. ABSTRACT. AspectrophotometricdeterminationmethodandvisualdeterminationmethodofCopper（II）were developedbycombiningthecatalyticoxidationreactionofthiolandthecolordevelopmentreactionusing. Cu（II）andHRP． Thespectrophotometricdeterminationmethodwasoptimizedsothatthecolordevelopmentis. strongestforpH9．0．BothTOOSandMAOS（Trindar’sreagent）canbeused．Moreover，tOimprove themeasuringsensitivity，theratioofthesamplesolutiontothereactivesolutionwaschosentobe 33．3％．Inaddition，0Ⅹygenbubblingisrequiredwhilereacting．. TherangeofthedeterminationofCu（II）wasfrom6．0×10￣7Mtol．0×10r5Mwhenthecalibra−. tioncurvewasmadeusingthespectrophotometricmethod．Therelativestandarddeviationfor3．0×10￣6 MCu（II）was3．3％（n＝5）．. Therangeofthevisualmethoddeterminationwasfrom8．0×10r7Mtol．0×10r5M．Therelative standarddeviationfor3．0×10r6MCu（II）wasl．2％（n＝5）．. 1 緒言近年，環境分析分野はもとより，材料科学など. 多くの領域で金属イオンの分析が行われている。中でも，銅イオンは電子伝達能を有するため，材. 科科学では注目を集めている元素である。この金属を高価な装置を使用せずに，安価で簡便に測定できる方法の開発が求められている。. 一方，銅（Ⅲ）とペルオキシダーゼ（POD）の接触酸化により，チオールは過酸化水素と二硫化. 13.

(3) 森田みゆき・谷. 物を生成する。Kataya皿aら（1）は，この反応とルミノール発光反応を組み合わせることにより，銅（Ⅲ）とPODが優先的にチオールの酸化に関与す. るため，発光が遅延して出現することを見出した。. 2．2 装置吸光度および吸収スペクトルの測定には島津. この現象に着目し，本研究ではルミノール発光反. Ⅶ）S−2000自記分光光度計を用い，光路長1c皿の. 応の代わりに発色反応を組み合わせ，分光光度計. 石英セルで測定した。なお，撹拝の影響の検討の. で発色遅延時間を測定することにより銅（Ⅲ）を. 際の吸光度の経時変化はP−RAS5000を用い，光路. 定量することを試みた。さらに，簡便な方法とし. 長1c皿の石英セルを用いて測定した。pHの調製. て目視定量法の開発を試みた。. には，HORIBApHMETERM8Eを用いた。. 2 実験 2．1 試薬. 銅（Ⅲ）溶液は，硝酸銅（Ⅲ）・3水和物（関. 2．3 操作過酸化水素の生成：バイアル瓶に嬢衝溶液. （CAPSpH9．0）1．8ml，1．0×10r4M銅（II）溶液を加え，撹拝および酸素バブリングを行う。そ. 東化学製）により調製した母液（1．0×10￣2M）. こに4．0×10￣3Mシステイン溶液1．0皿1を加える。. を使用直前に希釈して使用した。. この溶液を試料溶液とし，0．9皿1を分取して，過. 4−アミノアンチピリン（4−AAP），トリンダー試薬は同仁化学の特級品を用い，それぞれ水で1．0. ×10￣2Mに調製した。トリンダー試薬には，N−. 酸化水素の生成量を測定した。過酸化水素の生成量の測定は，鉄−phen法（2）によって行った。銅（Ⅲ）の検量線の作成：石英セルに銅（Ⅲ）溶. エチルーN−（2−ヒドロキシルー3−スルホプロピル）. 液1．0皿1を入れ，横衝溶液（CAPSpH9．0）1．4皿1，. −M−トルイジン（TOOS：最大吸収波長555n皿）お. 1．0×10￣2M4−A肝溶液0．1皿1，1．0×10￣2MMAOS. よびN−エチルー（2−ヒドロキシ）−3−スルホプロ. 溶液0．1皿1，Ⅰ狽P溶液0．1皿1を加え，撹拝および酸. ピルー3，5−ジメチルアニリン（鮎OS：最大吸収波. 素バブリングを行う。次に3．0×102Mシステイ. 長630n皿）を用いた。. ン溶液0．3皿1を加え630n皿における吸光度の測定. 西洋ワサビPOD（Ⅰ丑P）はシグマ社製の市販品を. 特に精製せずに用い，水で調製した母液をそれぞ. れの横衝溶液で1．05×10￣5Mに調製して用いた。媛衝溶液は同仁化学製のグッド媛衝剤を0．1M. を開始し，遅延時間を測定した。目視法による検量線の作成：バイアル瓶に銅（II）溶液1．Omlを入れ，横衝溶液（CAPS pH9．0）. 1．4皿1，1．0×10￣2M4−A肝溶液0．1ml，1．0×10￣2. となるように水で溶解し，0．1Mの水酸化ナトリ. M MAOS溶液0．1皿1，Ⅰ狽P溶液0．1皿1を加え，撹拝お. ウム溶液でそれぞれのpHに調製した。チオール. よび酸素バブリングを行う。次に3．0×10￣2Mシ. は関東化学製のシステイン（特級）を用い，その. ステイン溶液0．3皿1を加え反応を開始させる。シ. 都度水で3．0×10￣2Mに調製した。. ステイン溶液注入直後から急激に発色し始めるま. 鉄（II）溶液は，母液をpHl．O HCl／KClで希釈し1．0×10￣3Mとした。母液は関東化学製の硫. での時間をストップウオッチで測定した。目視法における個人差：目視法における分析方. 化鉄（Ⅲ）を用い，2％の硫酸溶液で1．0×10￣1. 法に従い，被験者5人に測定を行ってもらった。. Mに調製した。1，10−フェナントロリン（phen）. 銅（Ⅲ）溶液は8．0×10￣6Mと3．0×10￣6Mとした。. 溶液は，関東化学製の1，10−フェナントロリン塩. 測定は被験者1人と基準者の2人ずつで行い，各. 酸塩を用い，0．1Mの塩酸溶液で0．1Mに調製した。. 銅（Ⅲ）濃度とも2回ずつ測定した。被験者によ. その他，試薬はすべて市販の特級品を用いた。水はすべてイオン交換水を2回蒸留したものを用. 14. る各濃度の相対標準偏差（1濃度2回×5人＝10 回分の実験）とそれに対する基準者の相対標準偏.

(4) 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた遅延発色反応による銅（Ⅲ）の定量. 示す。低いpH範囲では過酸化水素はほとんど生. 差を比較した。. 成せず，pH7．0付近から生成量が急激に増大し， pH9．0で過酸化水素の生成量は最大となった。な. 3 結果および考察. お，旺PESを用いた場合，過酸化水素の生成量がほかと比べて低かった。これは，ピベラジン環を. 3．1 遅延反応の定義遅延反応を行った際の吸光度の経時変化を. 持つグッド横衝剤からはラジカルを生成する（3）. Fig．1に示す。システイン注入直後からしばらく. といった報告もあることから，緩衝剤そのものの. の間，吸光度はほぼ0を示した。しかし，1分過. 性質が影響しているものと考えられる。以上，トリンダー試薬の発色反応および過酸化. ぎから吸光度は急激に上昇し始め，やがて一定の. 水素の生成量の検討から，最適pHを9．0とした。. 値となった。この結果から，システイン注入直後から吸光度が上昇し始めるまで時間を遅延時間と定義した。. ぜか、uO芦巾∈﹂○−mOm〓. ︹J. ︹∠. 山Uum上﹂0川上く. 6 0. 1. 2. 3. 4. 5. byCu（II）andHRP．［4−AAP］＝1．0×10￣2 M，［MAOS］＝1．0×10￣2M，［HRP］＝1．05× 10￣5M，［Cysteine］＝3．0×10￣2M，［Cu（II）］. 8. 9. 10. PH. Reactiontime／min. Fig．1Timescanoncatalyticoxidationofcysteine. 7. 6. Fig．2 EfEectofpHonH202formation． ▲：MES，●：MOPS，［］：HEPES，○：CAPS，. △：CarmodyBuffer，［Cysteine］＝4．0×10￣3. M，［Cu（II）］＝1．0×10￣4M．. ＝2．0×10￣6M，pH9．0，）＝630nm．. 3．2．3 トリンダー試薬種の検討 3．2 定量のための最適条件の検討 3．2．1トリンダー試薬の発色反応における最適pHの検討. 横衝溶液は，それぞれpH5．5−6．5はMES，PH. 1．0×10￣2Mトリンダー試薬溶液（TOOSまたは鮎OS）を用いて銅（Ⅱ）濃度を変化させたときの遅. 延時間の変化をFig．3に示す。TOOS，MAOS共に銅（Ⅱ）濃度1．0×10￣5M付近から遅延時間の変化. 7．0−8．0はMOPS，PH7．5−8．5はIiEPES，PH9．0 が急激に小さくなった。また，検出限界は両試薬 −9．5はCAPSを用いて検討した。PH範囲（pH5．5. とも8．0×10￣7Mであった。このことから，吸光. −9．5）においてTOOS，MOSともにほぼ一定の吸. 度による遅延時間測定の場合はTOOS，MOSのど. 光度を示した。このことから，トリンダー試薬の. ちらの試薬を用いても定量範囲は同じであると考. 発色反応における最適pHはpH5．5−9．5と考え. えられる。しかし，目視では着色後の溶液が青色. られる。. となる鮎OS（最大吸収波長630ⅠⅧ）の方がTOOS（着. 3．2．2 過酸化水素の生成における最適pH. 色後：紫，最大吸収波長555ⅠⅦ）より変色点を判. の検討. 各pHにおける過酸化水素の生成量をFig．2に. 別しやすかった。以上のことから，トリンダー試薬は鮎OSを用いることとした。. 15.

(5) 森田みゆき・谷. 道子. がやや短かったものの，大きな差は見られなかった。また，それぞれの場合の4回の繰り返し実験罰 0. 3．67％，撹拝を行わなかった場合で3．42％であった。このことから，本分析法においては撹拝の影. 0. 響はほとんどないと考えられる。これは，システ. インの酸化反応に撹拝の必要がないというのでは. 0 0 1. UむS 、む ∈ 芋訂一む凸. における相対標準偏差は撹拝を行った場合で. なく，酸素バブリングだけで撹拝効果が十分であるためと考えられる。以上のことから，分光光度 10￣6. 0￣7. 10￣5. 10￣4. Cu（ll〕concent「ationlM Fig．3 Variationofdclaytimcwithcoppcr（II） conccntration．△：TOOS，○：MAOS，. ［4−AAP］＝1．0×102M，［Trindcr，s rcagcnt］＝1．0×102M，［HRP］＝1．05×. 計による測定の場合は，より幅広い分光光度計に対応できるよう，撹拝なしの一定条件で行うこととした。また，目視による測定の場合は吸光度が. 高く，目で確認しやすい撹拝ありの条件で行うこととした。. 105M，［Cystcinc］＝2．0×102M，pH9．0． 3．3 銅（Ⅰ）の検量線の作成 3．2．4 容量此の検討. 標準操作における横衝溶液（CAPS pH9．0）を1．5. 検討の結果得られた方法に従い，銅（Ⅲ）の検量線を作成した。結果をFig．4に示す。本方法に. 皿1（反応溶液に対する試料溶液の割合：30．3％）. おける定量範囲は6．0×10￣7Mから1．0×10￣5M. または1．4皿1（反応溶液に対する試料溶液の割合：. であった。銅（Ⅲ）濃度3．0×10￣6Mにおける5. 33．3％）とし，また，2．0×10￣2Mシステイン溶. 回の実験での相対標準偏差は3．3％であった。. 液0．5皿1（試料溶液割合30．3％）または3．0×10￣2 Mシステイン溶液0．3ml（試料溶液割合33．3％）と. ∩︶ ∩︶罰 10. 10￣7Mであった。このことから，反応溶液に対. 罰. 33．3％となる場合の銅（Ⅲ）の検出限界は6．0×. 亜. た。一方，反応溶液に対する試料溶液の割合が. ∩︶. る場合の銅（Ⅲ）の検出限界は8．0×10￣7Mであっ. 0. 反応溶液に対する試料溶液の割合が30．3％とな. UむS、む∈事訂一む凸. 変化させ，反応溶液の容量比の影響を調べた。. する試料溶液の割合が33．3％となるような分析方. 2．0×10￣6M銅（Ⅲ）溶液を用いて遅延反応と. ∩︶. 3．2．5 撹拝の影響. ∩︶1. 法で行うこととした。. Cu（ll）concentration／M. Fig．4 Calibrationcurvebyspectrophotometric. 同様の操作を行い，撹拝ありとなしの場合の吸光. method．［4−AAP］＝1．0×10￣2M，［MAOS］＝1．0×10ZM，［HRP］＝1．05×10￣5M，. 度の経時変化を測定した。反応の際の吸光度は，. ［Cysteine］＝3．0×10￣2M，pH9．0．. 撹拝を行った場合のほうが若干高かった。これは， 4−AAPとMOSの酸化縮合生成物が不安定で退色が速い（4）ことから，撹拝を行った場合のほうが. 3．4 共存物質の影響銅（Ⅲ）と適量の他のイオンをそれぞれ共存さ. より効率よく酸化縮合するためと考えられる。一. せて試料溶液とし，共存物質の影響の検討を行っ. 方，遅延時間については撹拝を行った場合のほう. た。試科溶液の銅（Ⅲ）濃度は5．0×10￣6Mとし. 16.

(6) 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた遅延発色反応による銅（Ⅲ）の定量. Tablel EfEectofforeignion．. 差は1．2％であった。. 3．5．2 測定における個人差. Ion tasted. Tolerated ratio. Na＋. 100. 結果をTable2に示す。銅（II）濃度8．0×10rU. K＋. 1000. Mにおける被験者の相対標準偏差は2．93％，それ. Mg2＋. 100. に対する基準者の相対標準偏差は2．69％であっ. Ca2＋. 1000. た。また，銅（Ⅲ）濃度3．0×10￣6Mの場合はそ. Cr3＋ Mn2＋. 1. 1. れぞれ3．89％と4．05％であった。以上のように，. 被験者による相対標準偏差と基準者の相対標準偏. Fe3＋. ＞1. 差にほとんど差がなかったことから目視法におけ. Co2＋. 100. る個人差はないと考えられる。. Ni2＋. ＞1. Zn2＋. 10. Cd2＋ NH4＋. ＞1 1. 100. ［4−AAP］＝1．0×10￣2M，［MAOS］＝1．0×10￣2M，. ［HRP］＝1．05×105M，［Cysteine］＝3．0×102M，［Cu（II）］＝5．0×10￣6M，pH9．0．. ≡、の∈〒詠一の凸. Ag＋. 01. た。測定した遅延時間の誤差が銅（Ⅲ）だけの場. については銅（Ⅲ）濃度の1000倍でも影響は見られなかった。ナトリウム，マグネシウム，コバル. トアンモニウムイオンについては100倍で，亜. 10■. 10￣5. Cu（”）concentration／M. 合の5％以内であれば影響がないものとした。. 結果をTablelに示す。カリウム，カルシウム. 10￣6. 0￣7. Fig．5 Calibration curve by visualmethod．. ［4−AAP］＝1．0×10￣2M，［MAOS］＝1．0×. 10￣2M，［HRP］＝1．05×10￣5M，［Cysteine］＝3．0×10￣2M，［Cu（II）］＝2．0×10￣6M，pH 9．0．. 鉛は10倍，クロム，マンガン，カドミウムについては1倍で影響が見られなかった。ただし，コバルトは遅延時間では100倍まで影響が見られなかったものの，反応後の溶液の色は通常の青色ではなく黄緑色で，吸光度への影響は大きいと考えられる。これは，コバルトが錯イオンを形成しや. すい性質を持っていることから，他の物質と何らかの錯イオンを形成するためと考えられる。. 3．5 目視法の検討. 3．5．1 目視法による銅（Ⅰ）の検量線の作成分析方法に従い得られた銅（Ⅲ）の検量線を. Table2 RelativeStandardDeviation．. Cu（II）conc 丘vepersons OneperSOn. 8．0×106M. 3．0×106M. 2．93％. 3．89％. 2．69％. 4．05％. ［4−AAP］＝1．0×10￣2M，［MAOS］1．0×10￣2M，［HRP］＝1．05×10￣5M，［Cysteine］＝3．0×10￣2M， pH9．0．. 4 総括銅（Ⅲ）とⅠ狽Pによるチオールの接触酸化と発. Fig．5に示す。本方法における定量範囲は8．0×. 色反応を組み合わせ，発色遅延時間を測定するこ. 10￣7Mから1．0×10￣5Mであった。銅（Ⅲ）濃度 3．0×10￣6Mにおける5回の実験での相対標準偏. とによる銅（Ⅲ）の定量法およびその目視定量法の開発を行った。. 17.

(7) 森田みゆき・谷道子. トリンダー試薬はTOOSおよび鮎OSのいずれも pH5．5−9．5の範囲で用いることが可能であったが，目視定量に適している鮎OSを用いることとし，過酸化水素の生成量が最大となるpH9．0で測定することとした。反応溶液に対する試料溶液の割合は33．3％とし. た。反応溶液は撹拝することで吸光度は増大するが，酸素バブリングだけでも効果が認められた。このことから分光光度計による測定の際は撹拝な. しとし，目視法の場合は着色の程度が定量範囲を大きく左右することから，撹拝を行うこととした。分光光度計による銅（Ⅲ）の定量範囲は6．0×. 10￣7Mから1．0×10￣5M，銅（Ⅲ）濃度3．0×10￣6 Mにおける5回のくりかえし測定での相対標準偏差は3．3％であった。共存物質は，カリウム，カルシウムについては銅（Ⅲ）濃度の1000倍，ナトリウム，マグネシウム，コバルトアンモニウムイオンについては100倍で，亜鉛は10倍，クロム，. マンガン，カドミウムについては1倍で影響が見られなかった。目視法による銅（Ⅲ）の定量範囲は8．0×10￣7. Mから1．0×10￣5M，銅（Ⅲ）濃度3．0×10￣6Mにおける5回のくりかえし測定での相対標準偏差は 1．2％であった。目視法による個人差を検討したところ個人差は認められなかった。. 引用文献. 1．A．Katayama，T．Kamidate，H．Watanabe，Bull． Chem．Soc．Jn．，65，2501（1992） 2．A．Huseyin，A．Resat，T．Izzet，Analyst，l15，99 （1978）. 3．K．JohnGrady，N．DennisChasteen，C．DantelHar− ris，AnalyticalBiochemistry，173，111（1988） 4．K．Yamaoku，K．Ueno，K．Akiura，Y．Ohkaura， Chem．Pharm．Bull，30（7），2492（1982）. （森田みゆき札幌校教授）（谷道子札幌市厚別区在住）. 18.

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