温熱感受性の異なる培養細胞の DNA 合成に対する温熱効果―フローサイトメトリーによる研究―

温熱感 受性 の異 な る培養 細胞 の

DNA合

成 に対 す る温熱 効果

フ ロ ー サ イ ト メ ト リー に よ る 研 究

岡山大 学 医学部 放射 線 医学教 室(指 導:平 木祥 夫教 授)

田

中

聖

了

(平成5年2月25日

受 稿)

Key words: Flowcytometry, DNA synthesis, Heating, BUdR

緒 言 温 熱 療 法 は 放 射 線 療 法 や 化 学 療 法 と併 用 す る こ とに よ り相 乗 的 治 療 効 果 を与 え る こ とか ら 癌 の 集 学 的 治 療 法 と して 注 目 さ れ て い る1-3).腫 瘍 に 温 熱 処 理 を行 っ て も そ の 腫 瘍 の お か れ て い る 環 境(血 流 状 態,pH,栄 養 状 態,酸 素 状 態 な ど) の 違 い か ら腫 瘍 の 反 応 は 一 定 で な い4-8).ま た, 細 胞 周 期 で も熱 耐 性 が 異 な る9-11).この よ うな 問 題 を解 明 す る た め に,培 養 細 胞 を使 用 し温 熱 の 作 用 機 構 に つ い て 検 討 が な さ れ て きた12-21). 増 殖 中 の 腫 瘍 は 異 な っ た 細 胞 周 期 の 細 胞 集 団 か ら構 成 さ れ て い る.細 胞 周 期 はG1, S, G2, Mの4つ の 期 に 分 け られ る.放 射 線 に はG1/S 境 界 期 の 細 胞 が 高 感 受 性 を 示 し,DNA合 成 が 始 ま る と抵 抗 性 に な る22).温熱 に 対 して はS期(特 にlate S)の 細 胞 が 高 感 受 性 で あ る こ とが 報 告 さ れ て い る20-22).す な わ ち,細 胞 周 期 に よ っ て 細 胞 の 放 射 線 と温 熱 に 対 す る感 受 性 が 異 な り, 致 死 作 用 が 異 な る こ と が 指 摘 さ れ て い る.対 数 増 殖 期 に あ る細 胞 集 団(腫 瘍)に 対 し て 両 者 を 併 用 す れ ば,作 用 時期 が 異 な る た め 両 者 が 相 補 的 に 作 用 し,殺 細 胞効 果 を増 強 す る こ とが 報 告 さ れ て い る22). 41℃ の 加 温 を 長 時 間 行 う とG1期 か らS期 へ の 細 胞 の 進 行 が 抑 制 され るこ とが 認 め られ る23)こ とか ら,細 胞 周 期 のS期 に お き るDNA合 成 に 対 す る温 熱 の効 果 を観 察 す る こ とは,温 熱 の 作 用 起 点 を 明 ら か に す る上 で 大 切 な こ と と考 え ら れ る. 著 者 は 細 胞DNA合 成 に対 す る温 熱 の 作 用 を, 温 熱 感 受 性 の 異 な る細 胞 を用 い て,そ のDNA合 成 に 対 す る作 用 を検 討 し た. 研 究 方 法 (細 胞) 細 胞 は4種 の 培 養 細 胞 で,エ ー ル リ ッ ヒ腹 水 癌 細 胞,L-5細 胞,HeLa S3細 胞, NIH3T3細 胞 を使 用 した.培 養 液 はDulbecco' s modified Eagle medium (DMEM)(日 水 製 薬)に10%仔 牛 血 清(Hyclone),ペ ニ シ リン(100 単 位/ml),ス トレ プ トマ イ シ ン(100μg/ml)を 加 え た もの を使 用 し た.培 養 はCO2イ ン キ ュ ベ ー タ ー で行 っ た_. (温 熱 処 理) 加 温 は 恒 温 水 槽(Taitec)を 使 用 した.25及 び75cm2フ ラ ス コ(Falcon)に 細 胞 を播 種 し,約48時 間 後 に43℃, 44℃, 45℃ の 水 槽 中 で細 胞 を処 理 した.温 度 は 設 定 温 度 ±0.05℃ 範 囲 内 で行 っ た. (生 存 率) エ ー ル リ ッ ヒ腹 水 癌 細 胞 の 生 存 率 は 二 重 軟 寒 天 培 養 で の コ ロ ニ ー 形 成 率 を み た. 他 の 細 胞 の 生 存 率 は 温 熱 処 理 後 の 細 胞 を0.25%

ト リプ シ ン(Difco)で 処 理 しsingle cellsと し, コ ロ ニ ー 数 が50個/シ ャ ー レ(Falcon 3002)以 下 に な る よ うに 適 当 な 細 胞 数 を ま き,10∼14日 間 培 養 後,ホ ル マ リ ン 固 定 後,ギ ム ザ 染 色 し, 1つ の コ ロ ニ ー 当 た り50個 以 上 の 細 胞 の 集 団 を コ ロ ニ ー と して 計 測 した.各 細 胞 系 の 無 処 理 群 を対 照(100%)と し,そ の 数 値 で 除 し て 生 存 率 771

772 田 中 聖 了

曲 線 を 求 め た.

(BUdRに よ るDNA合 成 能 の 測 定 及 びS期 細 胞 の 標 識) DNA合 成 能 はBUdR (Sigma) の 取 り込 み で 計 測 し た24).BUdR処 理 は い ず れ の 場 合 も30μg/mlの 濃 度 で37℃10分 間 ラベ ル し た.DNA合 成 に 対 す る43℃ 温 熱 の 効 果 を観 察 す る場 合 に は,温 熱 処 理 を,0, 30, 60, 120分 間 行 い,温 熱 処 理 直 後 にBUdR処 理 を10分 間 行 っ た.温 熱 処 理 後 のDNA合 成 の 変 動 を観 察 す る 場 合 に は43℃, 60分 間 処 理 後0, 3, 6, 9時 間 後 にBUdR処 理 を10分 間 行 っ た.S期 細 胞 の 動 態 に 対 す る 温 熱 の 効 果 を み る場 合 に は, BUdR標 識 直 後 に43℃60分 間 温 熱 処 理 を 行 っ た. (BUdRの 染 色) 細 胞 は ト リプ シ ン 処 理 で single cellsと し,70%冷 エ タ ノー ル で 固定 し た. 20℃ で 保 存 後4℃ Phosphate Buffer Solu tion (PBS)で3回 洗 滌 し,室 温 で2N塩 酸 処 理 を30分 間行 っ た.そ の 後0.05Mホ ウ 砂-0.2 Mホ ウ 酸(容 積 比 で9:1で 使 用 直 前 に 作 成 し 氷 中 で 冷 や し た も の)で 中 和 後3回 冷PBSで 洗 滌 後,1%牛 血 清 ア ル ブ ミ ン(三 光 純 薬)と 1% tween 20 (Sigma)を 含 むPBS中 で 抗 BUdRマ ウ ス 抗 体(Becton-Dickinson)で 室 温 で60分 間 処 理 した.そ の 後3回 冷PBSで 洗 滌 後,FITC-抗 マ ウ ス 抗 体(Chapel)で 染 色 し た. そ の 後,冷PBSに て3回 洗 滌 し,37℃ で1%

RNase (Sigma)で 処 理 後,Propidium Iodide (PI)(Sigma)でDNA染 色 を 行 っ た.蛍 光 量 は フ ロー サ イ ト メー タ ー で 計 測 し,細 胞 あ た り のBUdRの 取 り込 み 量 とDNA量 を解 析 し た.

表1 4種 類 の細 胞の 温熱 に 対す る生 存率 曲線 か ら 求 め たDo及 びDq (min)値

※ Ehrlich ascites tumor cells

研 究 結 果 1. 4種 の 細 胞 の 温 熱 感 受 性 43℃, 44℃, 45℃ 処 理 に 対 す る エ ー ル リ ッ ヒ 腹 水 癌 細 胞,L-5細 胞,HeLa S3細 胞,NIH 3T3細 胞 の 生 存 率 曲 線 か らDo(生 存 率 曲線 の 勾 配;生 存 率37%の 温 熱 処 理 時 間),Dq(Y軸 が 100%の とこ ろ の生 存 率 曲 線 の 直 線 部 分 との交 点 ま で の 温 熱 処 理 時 間)を 求 め た(表1).4種 類 の 細 胞 の45℃ で の 温 熱 感 受 性 を 高 い順 に並 べ る と エ ー ル リ ッ ヒ腹 水 癌 細 胞(Do, 2.7分)>L-5 細 胞(Do, 4.3分)>HeLa S3細 胞(Do, 5.8分)> NIH3T3細 胞(Do, 6.0分)で あ っ た. 以 上 の 成 績 よ り,DNA合 成 の 温 熱 効 果 を,感 受 性 の 低 いHeLa S3細 胞,感 受 性 の 高 いL-5 を用 い て さ ら に 詳 し く調 べ た. 図1 HeLa S3細 胞 のS期 の 分 別 図2の デ ー タ を解 析 す る た め コ ン ピー タか ら 呼 び 出 し,S期 の 細 胞 をearly S (SE), mid S (SM), late S (SL)の3つ に 分 割 し た. 横 軸 はDNA量,縦 軸 はBUdRの 取 り込 み 量 2. 細 胞 周 期 とDNA合 成 速 度 HeLa S3細 胞 を37℃ でBUdR (30μg/ml) 10 分 間 処 理 し た場 合 のBUdRの 取 り込 み 量 と DNA量 と の 関 係 を示 す.横 軸 はDNA量,縦 軸 はBUdR量 を示 して い る.こ の 図 か ら細 胞 周 期 のS期 を大 き く3つ に分 割 し た(図1).す

late S (SL)に 分 割 さ れ る.S期 の 細 胞 の 中 で も各 時 期 の 細 胞 でBUdRの 取 り込 む 割 合 が こ と な り,SM細 胞 が 一 番 多 くDNA合 成 が 盛 ん で あ る こ と を示 して い る. 表2 HeLa S3細 胞 のDNA合 成 に 対す る43℃ の 影 響 BUdRの 取 り込 み 量 を免 疫 蛍 光 抗 体 法 で 染 色 し,フ ロー サ イ ト メ ト リー に て 測 定 し た.蛍 光 量 を 平 均 チ ャ ン ネ ル数 で 示 し た. ()はcontrolを100%と し た 割 合 を示 し た. 図2 HeLa S3細 胞 の43℃, 120分 処 理 のDNA合 成 の 変 化 上 段;control下 段;43℃120分 温 熱 処 理 左 図;平 均 値 右 図;標 準 誤 差 表3 加 温(43℃, 60分)後 のHeLa S3細 胞 の DNA合 成 の 変 動 BUdRの 取 り込 み 量 を免 疫 蛍 光 抗 体 法 で 染 色 し,フ ロー サ イ トメ トリー に て 測 定 し た.蛍 光 量 を平 均 チ ャ ンネ ル 数 で示 した.()はcontrolをl00%と した 割 合 を示 し た. 表4 L-5細 胞 のDNA合 成 に 対す る43℃ の影 響 BUdRの 取 り込 み 量 を 免 疫 蛍 光 抗 体 法 で 染 色 し,フ ロ ー サ イ ト メ ト リー に て 測 定 し た.蛍 光 量 を平 均 チ ャ ン ネ ル 数 で示 し た. ()はcontrolを100%と し た 割 合 を 示 し た. 3. HeLa S3細 胞 のDNA合 成 に 対 す る温 熱 の 影 響 1) 43℃ 加 温 に よ るDNA合 成 の 変 動 対 数 増 殖 期 のHeLa S3細 胞 を43℃ の 加 温 を 0, 30, 60, 120分 間 行 っ た 直 後BUdRで 標 識 し,DNA合 成 率 を観 察 し た.対 照 と比 較 して DNA合 成 が 抑 制 さ れ る こ と が 認 め ら れ,120分 温 熱 処 理 で も っ と も強 く抑 制 さ れ る.特 にlate S (SL)期 のDNA合 成 が 強 く抑 制 され る こ と が 認 め ら れ た(表2).30, 60分 の 温 熱 処 理 で も, SLのDNA合 成 率 が 抑 制 さ れ て い る こ とが 認 め られ た.120分 処 理 群 と対 照 群 のS期 の 平 均 DNA合 成 率 曲 線 を さ らに 詳 し く解 析 す る と図2 の 如 く,SLのDNA合 成 が 温 熱 に よ り強 く抑 制 さ れ て い る こ とが 認 め られ た. 2) 温 熱 処 理 後 のDNA合 成 の 経 時 的 変 動 対 数 増 殖 期 のHeLa S3細 胞 を43℃60分 間 加 温,0, 3, 6, 9時 間 培 養 後 にBUdR標 識 し, DNA合 成 率 を 測 定 し た(表3).DNA合 成 は 比 較 的 長 く抑 制 さ れ る が 温 熱 処 理 後9時 間 に は controlの レベ ル に 回 復 し た. 4. L-5細 胞 のDNA合 成 に 対 す る温 熱 の 影 響 1) 43℃ 加 温 のDNA合 成 の 変 動 温 熱 に 感 受 性 の 高 いL-5細 胞 を,対 数 増 殖 期 に43℃, 0, 30, 60, 120分 間 加 温 処 理 した 後DNA 合 成 率 を 測 定 し た(表4).43℃30分 でDNA合

774 田 中 聖 了 図3 L-5細 胞 の43℃,60分 処 理 後 のDNA合 成 の 変 化 43℃60分 処 理 後0, 3, 6, 9時 間 のDNA 合 成 を 示 す.BUdR (30μg/ml, 10分)は 温 熱 処 理 後 に 行 っ た. 図4 温 熱 処 理(43℃, 60分)後 のS期 細 胞 の 動 態 対 数 増 殖 期 のL-5細 胞 をBUdR (30μg/ml, 10分)で 標 識 し た 後,43℃60分 間 温 熱 処 理 を し た.処 理 後0, 3, 6, 9時 間 のBUdR標 識 細 胞 の 動 態 を フ ロー サ イ トメー ター で 測 定 し た. 成 はSLが53%, SMが80%と 抑 制 さ れ た.処 理 時 間 が 長 く な る とSLのDNA合 成 が もっ と も 著 し く抑 制 され,つ い で,SMのDNA合 成 が 抑 制 され た.SEのDNA合 成 抑 制 が 最 も低 か

っ た.た と え ば,43℃120分 処 理 で はSL 40%, SM 69%, SE 76%に 抑 制 さ れ た. 2) 温 熱 処 理 後 のDNA合 成 の 経 時 的 変 動 対 数 増 殖 期 のL-5細 胞 に43℃, 60分 間 温 熱 処 理 を し,37℃ で0, 3, 6, 9時 間 後 のDNA合 成 率 の 変 化 を観 察 し た(図3).温 熱 処 理 直 後 に はSLのDNA合 成 が 強 く抑 制 され る.し か し, 処 理 後3, 6時 間 に はSL, SMのDNA合 成 は 回 復 し始 め る が,controlに 比 較 して 細 胞 当 た り のBUdRの 取 り込 み は 少 な か っ た.処 理 後9時 間 に はDNA合 成 は 温 熱 処 理 前 の レベ ル に ほ ぼ 回 復 し た. 3) 温 熱 処 理 時 のS期 細 胞 の 動 態 温 熱 に 高 感 受 性 を 示 すL-5細 胞 は,温 熱 がS 期 の 細 胞 の 動 態 に どの よ う に 作 用 す る の か を 調 べ るの に 適 し て い る と考 え ら れ る. 対 数 増 殖 期 のL-5細 胞 をBUdRで10分 間 前 標 識 し,た だ ち に 温 熱 処 理(43℃, 60分 間)を 行 い,37℃ に も ど して0, 3, 6, 9時 間 培 養 後 の 標 識 さ れ た 細 胞 の 動 態 を観 察 した.こ の よ うにBUdRを 取 り込 ませ た 後 に た だ ち に 温 熱 処 理 を行 えば,温 熱 処 理 を行 っ た と きに 存 在 して い たS期 の 細 胞 の 動 態 を比 較 的 正 確 に 観 察 す る こ とが で き る. 実 験 の 結 果 は,温 熱 処 理 直 後 で は,対 照 と変 わ ら な い.処 理 後6時 間 に はBUdRで 標 識 さ れ たSE期 細 胞 が 減 少 し,BUdRで 標 識 され たG2+ M期 細 胞 が 増 加 し,9時 間 後 に は そ の 現 象 が さ らに 顕 著 と な っ た(図4). 考 察 細 胞 の 種 類 に よ っ て 温 熱 感 受 性 が 異 な る こ と か ら12-15),著 者 は 温 熱 感 受 性 とDNA合 成 との 関 連 に つ い て 検 討 を加 え た.エ ー ル リ ッ ヒ腹 水 癌 細 胞,L-5細 胞,HeLa S3細 胞,NIH3T3 細 胞 の4種 類 の 細 胞 を 用 い て,そ の 温 熱 感 受 性 を 生 存 率 曲 線 か ら 比 較 検 討 し た.比 較 した4種 の 細 胞 の 温 熱 感 受 性 は,エ ー ル リ ッ ヒ腹 水 癌 細 胞>L-5細 胞>HeLa S3細 胞>NIH3T3細 胞 の 順 で あ っ た.こ れ らの 結 果 を基 に して,著 者 は 抵 抗 性 の 細 胞 と してHeLa S3細 胞 を,感 受 性 の 高 い 細 胞 と してL-5細 胞 を用 い て そ の DNA合 成 能 に 対 す る温 熱(43℃)の 効 果 を調 べ た.43℃ の 温 度 を選 ん だ 理 由 は① 臨 床 的 に 使 用 さ れ る温 度 に 近 い こ と② 細 胞 に 急 激 な 変 化 を 起 こ さ な い た め 反 応 が 観 察 し易 い こ とか ら で あ る. 細 胞 のDNA合 成 の 測 定 は,従 来 放 射 性 同 位 元 素(3H-Thymidine)の 取 り込 み を オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィ ー や 液 体 シ ンチ レー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に よ り測 定 され て き た25)_{.一 方,フ ロー サ イ ト} メ ト リー で は 細 胞 内 に 取 り込 ま れ たBUdRを 免 疫 抗 体 染 色,DNAをPropidium iodide (PI)

で 染 色 す る二 重 染 色 を用 い る こ とに よ り,同 一 細 胞 のDNA量 と標 識BUdR量 を 同 時 に 測 定 す る こ とが で き る24).ま た,フ ロー サ イ トメ ト リ ー を 用 い る こ とに よ りS期 のDNA合 成 の 状 態 を よ り詳 細 に し る こ とが で き る.し た が って, 著 者 は 細 胞 周 期 のS期 をSE, SM, SLに3分 割 し,そ の 各 期 のDNA合 成 能 の 温 熱 処 理 に よ る変 化 を観 察 し た. CHO細 胞 は 温 熱(45℃10分 間)に よ りDNA, RNA合 成 が 抑 制 さ れ る.そ の 抑 制 は10時 間 後 に 回 復 す る.タ ン パ ク質 合 成 も 回復 に4∼8時 間 を要 す る25).今 回 のHeLa S3細 胞 の 実 験 で は, SE, SM, SLのBUdRの 取 り込 み は,温 熱 処 理 (43℃60分)後6時 間 まで は 減 少 す る が9時 間 後 に は 回復 した.ま た,L-5細 胞 でHeLa S3 細 胞 と 同様 の 温 熱 処 理 後 のDNA合 成 能 を 経 時 的 に観 察 す る と,温 熱 処 理 直 後 に はSLのDNA 合 成 が 強 く抑 制 さ れ,処 理 後6時 間 で も ま だ 抑 制 さ れ て い る.し か し,こ の 期 間DNA合 成 は 完 全 に 停 止 して い るの で は な く合 成 率 が 減 少 し た 状 態 に あ る.処 理 後9時 間 に はDNA合 成 は ほ ぼcontrolの レベ ル に 回 復 し た. 感 受 性 の 高 いL-5細 胞 で は43℃,30分 の 温 熱 処 理 でBUdRの 取 り込 み はSLで 最 も減 少 す る. 60分 で は さ らに 大 き くSLが 低 下 し,次 い でSM が 低 下 す る.120分 間 処 理 で はSLが40%ま で に 低 下 し た.一 方,温 熱 感 受 性 の 低 いHeLa S3 細 胞 で はL-5細 胞 と同 様 の 温 熱 処 理43℃120分 で もSLで の 低 下 は67%に す ぎ な か っ た. 今 後,温 熱 処 理 に よ りSL期 で 起 きて いるDNA 合 成 の 低 下 の 原 因 を 明 らか に す る こ とが 温 熱 の 作 用 機 序 を解 明 す る上 で 重 要 な 問 題 と考 え られ る.

776 田 中 聖 了 結 語 4種 類 の 培 養 細 胞 を使 用 し,温 熱 に 対 す る感 受 性 を生 存 率 か ら観 察 し た.生 存 率 曲 線 か らDo を求 め る と温 熱 感 受 性 の 高 い の は エ ー ル リッ ヒ 腹 水 癌 細 胞>L-5細 胞>HeLa S3細 胞>NIH 3T3細 胞 の順 で あ っ た.温 熱 に 抵 抗 性 の 細 胞 (HeLa S 3)と 感 受 性 の 高 い 細 胞(L-5)を 用 い てBUdRの 取 り込 み か らDNA合 成 能 に 対 す る 温 熱(43℃)の 効 果 を フ ロ ー サ イ トメ ト リ ー で検 討 し た_{.43℃ 温 熱 で 処 理 時 間120分 で はL} 5細 胞 はHeLa S3細 胞 に 比 較 し てDNA合 成 は 大 き く抑 制 さ れ た.L-5細 胞 で はDNA合 成 期 の 中 で もlate Sの 合 成 の 抑 制 が,HeLa S 3細 胞 に 比 べ て著 しか っ た.こ の こ とは そ れ ぞ れ の 細 胞 が,温 熱 に 対 す る感 受 性 の 差 を示 して い る可 能 性 が あ る. 稿 を終 え るに あ た り,御 指 導,御 校 閲賜 りま した 平 木祥 夫 教 授 に深 甚 な る謝 意 を表 わ します.終 始研 究 の御 指 導 をい ただ い た岡 山大 学 医 療 技術 短 期 大学 部 川崎 祥 二教 授 に深 謝 い た します.ま た快 く御協 力 下 さい ま した教 室 員 諸 兄 の方 々並 びに 岩手 医 科大 学 病理 学 教 室 佐 々木 功 典教 授 に心 か ら感 謝 の 意 を表 わ し ます。 文 献 1) 菅 原 努:癌 治 療 の 新 し い 方 法;ハ イ パ ー サ ー ミ ア(癌 治 療 の 新 し い 方 法),菅 原 努,阿 部 光 幸 編,マ グ ロ ス 出 版,東 京 (1984) pp 4-14. 2) 水 野 左 敏,大 河 原 明 子:制 癌 化 学 療 法 剤 と温 熱 効 果.日 本 ハ イ パ ー サ ー ミア 誌 (1986) 2, 80-85.

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778 田 中 聖 了

Flowcytometric

studies

of effects

of

heat

on DNA

synthesis

in different

thermosensitivities

mammalian

cell lines

Seiryou

TANAKA

Department

of Radiology,

Okayama

University

Medical School,

Okayama

700, Japan

(Director:

Prof. Y. Hiraki)

The effect of heat on DNA synthesis in HeLa S3 cells and L-5 cells was studied using flowcytometry. When Do values obtained from survival curves of Ehrlich ascites tumor cells, L-5 cells, HeLa S3 cells and NIH3T3 cells after heating to 43, 44, or 45•Ž, were compared, HeLa S3 cells were resistant and L-5 cells were sensitive to heating.

During heating at 43•Ž, DNA synthesis (BUdR uptake) of HeLa S3 cells was resistant compared to that of L-5 cells. When the period of DNA synthesis was divided into 3 fractions (early S, mid S and late S), late S phase was the most sensitive fraction to heating at 43•Ž for 60 minutes.

From these results, relationship between DNA synthesis and thermocytotoxic effects are discussed.