液体クロマトグラフィー/質量分析法を用いたプロポリス成分の分析

ミツパテ科学21(4):164-168

Ho

ne

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e

nc

e

(2000)

液体 クロマ トグラフィー/質量分析法 を

用 いたプ ロポ リス成分 の分析

熊津 茂

則

･田津 茂実 ･野 呂 忠敬 ･中山 勉

現在, 日本において健康食品の素材 として も 注 目されているプロポ リスは, ミツバチが周辺 の植物の芽や浸出物を集 めて作 った樹脂状物質 である.プロポ リスの主 な成分 は,樹脂, ろう 質,花粉,その他 ミネラル類などであるが,莱 際の組成 は原塊の採取地や蜂が利用する植物源 に左右 される.プロポ リスは,世界各地で民間 伝承薬 として利用 されてお り,近年,抗菌作用, 抗 ウイルス作用,抗炎症作用,抗腫痘作用など の数 多 くの薬 理 学 的効 果 が報 告 されて い る

(

Bur

doc

k

,1998).プロポ リスを薬品や健康食 品として利用す る場合, エタノール抽出物を利 用す ることが多い.そのため,エタノールで抽 出される成分が,プロポ リスの生理活性 に大 き な役割を果た していると考え られる.プロポ リ スのエ タノール抽 出物 中 に含 まれ る主 な成分 は,桂皮酸や

p-

クマル酸 などの フェノール酸 類, フラボノイ ド類などであり

(

Bankova et

a

1.,2000), これ らの成分組成を分析すること はプロポ リスの生理活性 の解明につながるだけ でな く,プロポ リスの品質管理を行 う上でも非 常に重要なことである. 天然物質の成分を同定す るためには,各種 ク ロマ トグラフィーによって, 目的 とす る成分を 単離 ･精製 した後

,NMR

(核磁気共鳴)や

MS

(質量分析)などの機器分析を行い,その化学構 造を解明するのが一般的な流れである. このよ うに一つ一つの成分を単離 した上で機器分析を 行 うことは,最 も確実な分析手段であるが,プ ロポ リスのような多種類の化合物の混合物につ いては,各成分の同定に至 るまで多大な労力 と 時間を要す る.そこで,プロポ リスのエタノー ル抽出物の簡便な分析法 として

,HPLC

(高速 液体 クロマ トグラフィー)

, TLC

(薄層 クロマ トグラフィー),紫外分光光度計 などによる評 価 法 が提案 されて い る (藤本,1992;

Pal

ma

andMal

as

pi

na

,1999;

Par

k

,2000). しか し, これ らの方法か らは,大 まかな化学組成につい ての知見は得 られるものの,個々の成分に関す る情報 まで知 ることはで きない.それにもかか わ らず, これまでのプロポ リス成分の分析例の 中には

,HPLC

の保持時間を比較 しただけで成 分を同定 しているもの もあり,間違 った情報を 報告 しているもの も少なか らずあると考え られ る.今回,私 たちはプロポ リスのエタノール抽 出物 に含まれる成分を分析す るための信頼性の 高い分析法の一つとして

,HPLC

と

MS

を合わ せた

LC/MS

法 (液体 クロマ トグラフィー /質 量分析法)の利用を紹介 したい.

LC/MS

法は,決 して新 しい分析法ではな く, 現在では食品や医薬分野だけでな く,環境分析 に至 るまで幅広 く利用 されてい る.

HPLC

と

MS

とを直 接 っ な ぐ こ とに よ り,混 合 物 を

HPLC

で分離 した後,その まま質量分析 がで き,短時間で有用 な情報が得 られるという利点 が あ る (原 田 ･岡,1996).私 た ち は, この

LC/MS

法をプロポ リス成分 の定性分析 に利用 す るための検討を試みた. 材 料 お よ び方 法 プロポ リスおよびフラボ ノイ ド標準試料 プロポ リスは, ブラジル ミナスジェライス州 産の原塊 を 70%ェクノールで抽 出 した ものを 試料 と した.また, フラボノイ ドの標準試料 (ケルセテ ン)は,関東化学 (秩)か ら購入 した ものを用いた.

LC/MS

分析

LC

装置 は,資生堂 (樵)製 セ ミミクロ

LC

シ ス テ ムで あ るナ ノスペ ー ス

SI

-

1

を用 い た.分 析条件 は以下 の通 りで あ る

.

カ ラム :資生 堂

Capc

e

l

lPackC1

8UG1

20

(内径

2.

0mm

,長 さ

1

50mm)

溶離 液

:

A

液,

水 (

2

%

酢酸);

B

液,アセ トニ トリル

(

2%

酢酸) グ ラ ジェ ン ト条 件

:0-60

分

,B

液

20%

-80%

流量

:200

〟1/分 検 出 :

UV280nm

サ ンプ ル :

1

00/

J

g/ml

メ タノール溶 液 に調 製 した試料 を

2〝

1注入 した

MS

測定 は, イオ ン トラ ップ型質量分析計

LCQ (

The

r

moQue

s

t

社) に, エ レク トロスプ レー

(

ES

I) 用 のイオ ン源 を装着 した装置 を用 い,資生堂 の

LC

装置

SI

-

1に接続 した.測定条 件 は以下 の通 りで あ る. イオ ン化 モー ド :

ESI

負 イオ ン キ ャピラ リー電圧 :

-10V

キ ャ ピラ リー温度 :

260℃

シースガス :窒素

(

85ar

b)

165 スプ レー電圧

:5kV

コ リジ ョンエネルギー :

30%

結果および考察

ブ ラ ジル産 プ ロポ リスの

LC/MS

分析 図1(a)に, ブラジル産 プ ロポ リスのエ タノー ル抽 出物 の

HPLC

ク ロマ トグ ラムを示 した. 図

1

(

b

)

は,図 1(a)と同 じ条 件 で ケル セチ ンを分 析 した

HPLC

ク ロマ トグ ラムで あ る. ケ ル セ チ ンは, プ ロポ リスの主要 な構成成分 の一 つで あ ると も報告 されて い るが

(

Pal

maand MaL

as

pi

na,1998;

斉藤

,2000)

,図

1

(

a

)

を見 て もわ か るよ うに,今 回使用 したプ ロポ リスサ ンプル にお いて は, ケル セ チ ン と同 じ保 持 時 間 に,

UV280nm

で検 出 され る強度 の強 い ピー クは 検 出 されなか った. ダイオ ー ドア レイ検 出器 を 用 いた多波長分析 も行 ったが, このサ ンプル中 のケルセチ ンは検 出限界

(1

0〟g/ml

)以下 で あ った. E]1(a)に示 した ピー ク4は, ケルセチ ンと近 い保 持 時 間 に観 測 され た ピー クの一 つ で あ る が

,HPLC

の保持時間 の比較 だ けで, この ピー クが ケル セチ ンか ど うか を判別す ることは不可 時間 (分) 図

1

ブラジル産プロポ リスのエタノール抽出物とケルセチンの

HPLC

クロマ トグ ラム(a)ブラジル産プロポ リスのエタノール抽出物,(b)ケルセチン

図2 ピーク4の MSスペクト

ル

図

3

ピーク

6

の

MS

スペクトル(a)と

MS/

MS

スペクトル

(

b

)

能 である. しか し

,LC/MS

分析 を行 うことで, ピー ク

4

が ケル セ チ ンで あ るか ど うか を簡単 に判 別 す る こ とが で き る.図2に ピー ク4の

MS

ス ペ ク トル を 示 した が

,m/Z247.3

に

[

M-

H]

と考 え られ る分子 イオ ンピー クが観測 され た ため, ピー ク

4

の分 子量 は

248

で あ る ことが確認 された. ケルセチ ンの分子量 は

302

であ るため, ピーク4はケルセチ ンとは異 なる 化合物 であ ることが

LC/MS

分析 か ら,明 らか にす ることがで きた.実 際, ピーク 4は単離 ･ 精製 した後,NMR(核磁気共鳴)などの詳細 な 機 器 分 析 を 行 う こ と に よ り

,(

E)

-

3-

(

2,2-di

me

t

hyl

13,4l

di

hydr

0-31

hydr

oxy-2

HllI

benz

opyr

an-

6-

yl

)

-

2-

Pr

ope

noi

c ac

i

d

であ るこ

とを確認 している

(

Taz

awae

ta1

.

,1

999)

.

このよ うに

,LC/MS

分析 は

,HPLC

におい て観測 され る ピークの分子量 を簡単 に調べ るこ とがで きるため, プ ロポ リスのよ うな多種多様

0 0 0 0 0 CO 6 4 2 髄 米 W d 夜

晋

0 0 0 0 0 0 8 6 4 2 髄 米

W

d

夜 空 図 4 ケルセチンのMSスペク トル(a)と MS/MSスペク トル(b) 表 1 ブラジル産プロポ リスのエタノール抽出物の ピーク帰属 tR (min) [M-H](m/Z) 化合物 3 6 0 1 6 9 2 0 6 0 3 8 5 20.12 6 22.39 7 29.07 8 30.48 9 31.74 10 32.42 11 33.49 12 35.67 13 35.98 14 36.71 15 37.62 16 42.77 17 48.62 p-coumarlCacid 3.5-dlCaffeoylquinicacid 3,4-dicaffeoylqulnlCaCld

(E)131(2.21dimethyl13.41dihydro131hydroxy12H11-benzopyran16

-yl)- 2-propenoicacid 7.3 未同定

14 dihydrokaempferlde

i,4 drupamn((E)-3-prenyl-4-hydroxyclnnamlCacid) 5.5 未同定

7.5 dlhydrocomferylp･Coumarate 5.5 capillartemisinA

9.4 kaempferlde

4.7 E-31[2,3･dihydr0-2-(1-hydroxy-1-methylethyl)-71prenyl151

benzofuranyl]･2-propenoICacid

393.6 E-312,3ldihydr0-2-[2-[31(4-hydroxyphenyl)12-propenoyl]

oxy-1-methylethyl]-5-benzofuranylト2-propenoICaCld 313.5 未同定

SIS.5 (E)-3-(2,2-dLmethyl-3,41dihydro-3-hydroxy181Prenyl-2H-1 -benzopyran-6-yl)-2-Propenoicacid

299.5 artepillinC

297,7 (E)-3-(2,21dlmethyl･8-prenyl-2H･1-benzopyran-61yl)12･propenoICaCld

な混合 物 試 料 の組 成 分 析 に は非 常 に有 効 で あ ジヒ ドロケ ンフェ リ ド(dihydrokaem pferide)

る.しか し

,LC/MS

分析 は万能 で はな く,注意 で あ る こ と が 既 に 明 らか に な っ て い る が 深 く利 用 しな けれ ば な らな い時 もあ る.例 え (Tazawa et a1.,1998), この化合物 の分子量 ば, ピーク6は単離後 のNMR解析 な どか ら, もケルセチ ンと同 じ302であ る.仮 に, ピー ク

6がHPLCにお いて ケル セテ ンと近 い保持 時 間を示 していた ら, この ピークをケルセチ ンと 判断 しかねない. 実際に, 図3(a)と図4(a)に示 すように,ピーク6とケルセチ ンのMSスペク トル は良 く似 たパ ター ンを示 して い る. しか し, このような場合,MS/MSスペク トルを測 定す ることで判別 は可能 となる.図3(b)と図 4 (b)に,m/Z301の分子 イオ ンピークを解裂 させ た両化合物 のMS/MSスペ ク トルを示 したが, そのスペク トルパ ター ンは大 きく異な っている ことが確認で きる.すなわち,ピーク6のMS/ MSスペ ク トルで は特徴 的 なm/Z283の フラ グメン トイオ ンピークが強 く観測 され る (図

3

(b))のに対 し,ケルセチ ンのMS/MSスペク ト ルではこのよ うな フラグメ ン トイオ ンピークは 観測 されていない (図4(b)).このm/Z283の フラグメン トイオ ンピークは, フラバ ノール構 造 に特 徴 的 な もの で あ る と考 え られ るた め (Liれ eta1.,1993), 仮 に分子量が同 じ化合物 であ って もMS/MS分析 を行 うことで,両者の 化合物の相同性を比較す ることは可能 となる. もちろん,このMS/MS分析 もLCと連結 した ままオ ンライ ンで測定可能 なため,容易 にデー タを取得す ることがで きる. 表 1に,図 1で 観 測 さ れ た主 な ピー ク の LC/MS分析 の結果をまとめた. 複数成分が重 なっている ピークもあるが,各成分の分子量 を 確実 に明 らかにす ることがで きた.なお, これ らの成分 は, 別途単離後, NMR等 の機器分析 により構造 を決定 している.LC/MSは, 確実 にデータを出 して くれ る装置であ り, ダイオー ドア レイ検出器を組み合わせ ることで, より詳 しい情報 を得 ることもで きる (He,2000).こ のように,LC/MS法 は "分子量"とい う各成分 の固有 の情報を与えて くれ るため, プロポ リス の簡便な成分分析法 と しての利用効果 は高 い. 今後,多 くの研究者がプロポ リスの成分分析 に LC/MS法を利用 してい くことを期待 したい. (熊樺, 中山 :〒422-8526 静岡市谷田 52-1静岡県 立大学食品栄養科学部;田滞,野呂 :同大学大学院 生活健康科学研究科) 引用文献

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SHIGENORIKUMAZAWA,SHIGEMITAZAWA' ,TADAT-AKA NoR

O

●andTsuTOMU NAKAYAMA.Analysis ofpropolisbyliquid-chromatography-massspe -ctrometry.HoneybeeScience(2000)21(4):1 64-168.SchoolofFoodand NutritionalSciences,

University ofShizuoka;'Graduate Schoolof Nutritionaland EnvironmentalSciences,Uni -versity ofShizuoka,52-1Yada,ShlZ uOka422-8526,Japan

ltisnecessary todeterminethephytoche m-icalconstituentsin propolisinordertoensure the reliability ofpharmacologicaland clinical reseal･Ch,to understand thelrblOaCtivitiesand to enhance productquality control. Analysis byHPLC,TLC andUV spectrahasbeenused for these purposes. Itis usually difficultto obtain the detailinfol-nation ofeach c ompo-nentinpropolisbyasinglemethod,sincepr o-polis contains various kinds of compounds. High-perfor一manceliquid chromatography-mass spectrometry(LC/MS)wasappliedtotheanal -ysisoftheethanolextractsofBrazilian pr o-polis. The negative electrospray ionization mode was used,and the constituents ofthe propoliswerecomparedwithstandardsamples bymassanalysis.Furthertandem massspect -rometry (MS/MS)wasapplied toidentify the compounds.ThisstudydemonstratesthatLC/ MS could beavery usefultechniqueforpr o-polischaracterization.