酵母によるL-アスパラギン酸の生成に関する研究(第2報) : 有機酸の効果
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(2) 6 0. 近 地 大 学 農 学 部 紀 要. 第. 6号. (1973). 用 した.. らにas para tseの作用 を さらに検 索す るため に,酵素 の タンパ ク質部 分 につ いての研究 や精製 につ いての. Ⅲ 結果および考察. 報告 がある 3･4). Bu cHA NA Nら 5 ) はAcm l omyc esnaes l undi i を用 いて,. CaCi as part l dの生成 には, ある特定 の有機酸 など が効果の あることが前報 7) で推論 された.本実験 で. i c gu lc oseの生成 に必要で あるC 02 が,同時 にaspart 利用 されて い ることをC1 4 を用 い d生成 にも同化, aci. part i dの caci は, さらに他 の有機酸 を使用 して ,as. eoa lbce lrs uo bx ya dnsの抽 出 て確 かめた. また,Ac. 生成 にたいす る影響 を根索 した結果,生成量 をどに. 物 を用 いて,ph os po h en olpyruvae t,HCO;,p yri -. 大 きな差 異 の あることが認 め られた.. doxalp hos pae h t,glt uamat eによ りas par t i c aci dの 生成 が認 め られ ると報告 してい る 6).. par. t l. dの生成 は,96時 間後で は,生成 たが,as CaCi. 前報. す なわ ち,ci g.1に示 し t r ae t を添加 した場合 はFi. においては,Sac ca h romycescerevs ii ae. 7). HANSE Nに よ る as part l C aCi dの 生 成 に た い して, て は,fm u arae. t,s uccn iae t,oxao laceae ttが有効で あ ることを明 らかに した.本報文 においては, さら. par t i caci dの生成 にどの よ うな影 に他 の炭素源 がas 響 をあた えるかを知 るため に,Sa cca h ro mycesce r -. t ! d. TT J. evI Si ae HANSENを用 いて検 索 し,二,三の知 見 をえ. 0 1. ( t uJ 的E) p! 3 t !U. ( NH▲ )2 SO. ,CO( NH2 )2 が有効 で あ り,炭素源 と し. 5 0 s t ! ･ 1. たので報告 す る.. Ⅱ 実挨方法. 0. 供 試 菌 には Sa cca hr omycescer evsa iie HANSENを 用 い, 前 培 養 の培地組成 は, ( NHJ2 SO.. Na2HPO. 20g ,. 1 10g･ K2 SO. 0･ 5g , MgSO1 0･ 5g, FeSO4 00 .1 g , 2 00 .1 g CaCl ,酵母 エキス00 .1 9を基本培地組成 とし,. 0. 2 4 48 72 Our ) i meOI 1 nc ubt ai ont. 96. Fi1 g .. Ef f e c tofc i t r ae t ont ou a s pa r t i c hepr d ct i onofLa c i dbySa c c hGO rmye CSC e r e V i s i a eHANSEN. lc ose50 .9を添加 しpH6. それにgu 8,蒸溜水 で 1 Cに 5℃ して培養 液 を調製 した. それに酵母 を接種 して 3 で 4 日間振 と う培 養 した後 ,無菌的条件下で培養. ( pH7. 0)で 3 回 洗 浄 した もの を晋 トリス績衝 掛 二 懸濁 させて 1 0. 0mj Z と した. as par t caci i dの生成 にたいす る各種 の炭 素化合物 eo tgua ltr t, g】 yox yae lt, tt ae, 】 s oc. i t r ae t, α-k ae. ?. 5 0. l acae ttt aCOn ae t をそ れ ぞ れ 5×1 0~2 0~2 ,l M, 1 M, 3. e. oxaae lt,gl yc ol l ae t,gl ycer ae t,f or mat e ,aceae tt,. 0 1. t rae t,C. sac oni の影 響 につ いて は, 基 本培 地 にci. ( t t L [ [ 叫 ∈) p!d 3 U 一 }Jd sJ. 液 を遠 心 分 離 して菌体 を あつ め, 筈 トリス績衝 液. M添加 して35℃で振 と 0~一 5×1 0 M, 1 013M, 5×1 う培養 し,経時的 に培養 液 を採取 してas part i d caci を定量 した.. L-. a spar. t i. ca c. i dの定量 はLe uc o noso lcmes e ne lrATCC804 2) によるBi oass a y法 によっ oi desp-60 ( た. また n-ブ タ ノー ル :酢酸 :水 -4 :1 :1の 展 開液 を用 いてア ミノ酸のペーパ ー クロマ トグ ラフ ィー を同時 におこなって ア ミノ酸の定性,定量 に併. 0. 2 4 48 72 1 n c ua bt i ont i meO I Our ). 96. Fi g l 2･ Ef f e c tofJ cS t aC Ol ntt aeOnt hepr odu c t i onof La s pa r. t i. ca c i dbysac c ha r omyc e sc e r e v L ' s L aef lANS･ tN･.
(3) 鎌 田秀郎 :酵母 によ る L-アスパ ラギ ン酸 の生成 に関す る研究 ( 第 2報). umarae t や oxao laceae tt と同様 の結 果 が え に有効 なf られ るが,生 成 は 72時 間 目 か ら顕 著 に増加 し,f umarae t rae t t を どよ りお くれ るこ とが認 め られた.ci ~2 に お い て 最 適 濃 度 は1 0 M- 5×1~ 03 Mで あ り, 5 -2 ×10 Mで は生 成 時 間 もお くれ,量 も少 をい. しか し最適 濃度 においては as CaClの生成 に有効 な part l d. 61. g.2に示 した が, cs iaconl tt aeを添加 した場 合 は Fl 5×1 M～1 Mが最適 濃度 で あ り,aspart 0~2. 0. -2 i caci d の生成 は48 時 間 か ら認 め られ,時 間の経過 とともに. t rae tよ り生成量 は少 な 増 加 の傾 向 を示 して い る.ci いが, か な り有効 な有機 酸で あ ると考 え られ る.. 有 機 酸 で ある.ci t rae t はTCA cyce lの k eypon itの. g.3に示 した が,ci sac oni s oci t rae t の場 合 は Fi -2 12 0 M～1 0 Mが 1 tt aeと類 似 の傾 向 がみ られ, 5×1. 有機 酸で あ り,f umarae t,Succn iae t,oxao laceae tt. part l CaCi dの生 成 とは, この 2 最適 濃度 で あ る. as. な ど のas parti caci dの生 成 に密 接 な関係 を持 って い. つ の有機 酸 は直接的 関係 は ないが,TCA c yclに位 e. る有機 酸 の生 成 に,影響 をあた えた もの と推 論 した.. 置 して い る有機 酸で あ り, かな り有効 な有機 酸で あ ると考 え られ る.. ( l ∈＼叫 ∈). a-keo g.4に示 し tgua ltrae t を涼 加 した場 合 は Fi s oc) t rae t を ど と は か な り異 なった t rae. t, i た が,cl. 効果 があ るもの と考 え られ る.す なわ ち,4 8時 間 か. 0. 後 増加 して い き生成量 も多 く有効 な有機 酸 で あ る. -2 最適 濃 度 は 5×1 0 M～1 0~2 M附 近 に あ り,挙動 は. f umar ae t,oxao laceae. tt と類似 の傾 向 を示 して い る. α-keo tgua ltrae t はglt caci uami dの生 成 と直 接 関 係. 5. 0. c ) ! JJv d stZ ･1. 1. p! oe. par. t J. d. らas CaC. )の生成 が, か な り認 め られ, それ以. を も っ て い る が,a-. keo t gua ltrae tの添加 によって. gua ltmat eの生 成 を うなが し,生 成 された gua ltmat e か らt ransami nat i onなどによって aspart dが生 i cacl. 0. 2 4 48 72 i ont 1 nc ua bt hour ) i me(. 9 6. Fi gl 3･ Ef f ectofi s oc i t r at eon t hepr oduc t i on of L-. as par. t i ca c l dbySac c har omyce sc e r ev E ' s L ' aeH ANSEN. 成 された もの と推論 された.. gy loxyae lt を添 加 した場 合 は Fi g.5に示 したが, 一2 0 M～ 生成 は72 時 間後 か ら認 め られ,最適 濃 度 は 1 5×1 Mで あ って,か 在 りの生成量 が あ った.gy 0L3 】oxyae lt はi soci t rae t,ci sac oni tt aeなどの有機 酸 とは 異 なった位 置 の代謝 経 路 に組 み込 まれて お り, これ らの有機 酸 とは生成 にた い して違 った役割 を演 じて い るもの と推察 され る.. oxaae ltの場 合 は Fi g.6に示 したが,aspartl caci d の生成量 も濃度 の効 果 もgy loxyae lt と類 似 の傾 向 を. 0. め られ少 し挙動 を異 に して いると考 え られ る.oxa1 -. ae tはTCA cyc. lに関係 e しているox ao laceae tt がoxaト oacea tt edey hdr oa lseの 作 用 によって生成 し, また. 5 0. P T C I C I)!3'?dt s Z ･ 1. 8時 間 か ら少量 で は あ るが生 成 が認 示 して い るが,4. gy lox ya lt hd ogenase. e deyr な どの作 用によってgy loxyae lt にな り, さ らにmaa esynt lt haseの 作 用 に よ 0. lt となってTCA cyce lと共役 して い る有機酸 りmaae 0. 24. 48. I nc ua bt l Ont i me. 72. 9 6. ( hour ). Fi g･ 4･ Ef f ec. tofa-. keo tgua ltr a t eonte h pr ou d ct i onOf La s par. t i. ca c i d by sac c ha r omyc e sc e r ev L I s L ae H ArJSEN. partl d で あるため にas CaClの生 成 に少 し効果 が あっ た もの と推察 され る.. gy lcoae ltを添カロした場 合は Fl g.7に示 した が,72 par. t 】. dの生 成 が認 め られた が, その 時 間 か らas eaci 2 畳 も少 な く 5×1 0 Mで はむ しろ阻 害 的 に作 用 し,.
(4) 6 2. 近 畿 人 手 農 学 部 紀 要. 第. 6 ' 7 (1973). 他 の有機 酸 よ り低 い濃度 において最適 の濃度 範囲 が. 効 果 が認 め られ を か っ た .gl yc oae lt,gl ycer ae t,. あ り,aspar. ti. caci dの炭 素源 と して あ ま り効果 が な. f or mat eなどはgy loxya lt ecyclを構 e 成 して い る有機. lox yae lt い もの と考 え られ る. そ して , さ らに gy. 酸 か, あ るいは それ に関係 している有機 酸であるが,. cyclの活性 e が あ ま り高 くない もの と推察 された.. aspart i dの生 成 にた い して これ らの有機 酸 は効 caci. gy lcerae. tの場 合 は Fi g.8に示 した が,ly g c oae lt. 果 が あ ま りか -が稽 ん ど認 め られ なかった. これ ら. と類似 の傾 向 を示 し,aspart caci l dの生成 にあ ま り. l CaCi dの生 成 には TCA cyce lを の こ とか ら,aspart. 効 果 が な く, 5×10 2. Mにおいて は阻 害 的 作 用 さえ 認 め られた.. 構 成 して い る有機 酸 が重婆 を役割 をもって い るこ と とあわせて推 論 された. が,前報 7'. f or mat eを添 加 した場 合 は Fi g.9に示 した が, す. aceae tt を添 加 した場 合 は Fl 1 0に示 した が, g.. べ ての濃度 において asparti caci dの生成 にほ とん ど. α-. keo tgua ltr ae tの よ うにaspart i caci dの生成 に極 めて. 01. 0 1 p! 3t". 5 0 ds ?J. ) hC. 5 0 7 ! 1 t ! ds?J. 0. 2 4. 4. 8. 1 nc ua bt i ont l me. 7. 2. ( hour ). 2 4. 4. 8. i me l nc ua bt i onl. 7. 2. 9. 6. ( hour ). Fi g1 7. ･1 : r f e c. t of gl yc ol l at e on te h pr oduct i on of La s par. t l. Cac i dby Sa c c ho r omyc e sc e r ev i s i aeH･ ANSEN. 0 p ! 3 d U ! 71 t ! ds. 5 1 ( T ut J 的uJ ). Dl 1. 0. 9. 6. Fi g･ 5. Er r ect of gl yoxya lt e on t he pr oduct i on or La s par. t i. ca c i dby S ac c har omyc e sc e r ev i s E ' aeHANSEN. 1 .. 5. 0. ( T u JJ的E) p! 3 t 2 3!. 5. ( t ∈ ＼叫ul). : 5. xl O2M 0 2M ⑳一一 ⑳ : 5xl O3M. A-1△ : 1. 03M M : 5. xl Ol 4M. ● 一 ･ . ●:1. 二 5x. 5 0 t j. p一 O t ZU! ut Z ds ?J 2. 4. 48. 1 nc ua bt i ont i me. 7. 2. ( hour ). Fi .,. I Ef f e ctofoxa】 at eont hepT Oduct j onor トa s par. t i ca cl dbySa c c ha r omyc e sc e r ev i s L ' ae HANSEN. 9. 6. ∩. 2. 4. 4. 8. ( nc ua bt i ont l me. 7. 2. ( hour ). Fi8 g.. 1 I. f r e c. tofgl yc er at eontep h r oduct i onor La s par t i ca c l dbySo c c ho r omyc e sc e r ev t s t ' ae I 十ANSEN. 9. 6.
(5) 鎌 田 秀郎 :酵母 によ る L-アスパ ラギ ン酸 の生成 に関 す る研究 ( 第 2報). 2 2 -3 0 M, 1 0 M, 5×1 0 Mの各濃 有 効 で あ り, 5×1. 63. d れ る. aceae tt を添 加 した場 合 には ,as part l C aC-. 8時 間 に 度 に おいて最 も生 成 量 が 多 い.培 養初 期 の 4. の生成 の時 間 も早 く, また濃度 も比 較 的 高 い範囲 で. part i caci d お いて もか な りの量 が生 成 されてお り,as. 効 果の あ るこ とが それ を暗 示 して い る.この ことは,. 生 成 の炭 素 源 と して有効 で あ る と考 え られ る.ac e-. aceae tt を添 加 す るとg】t uar ni c aci dの生 成 な ど に も. dの生 成 に関 tt aeは代 謝 に お いて は直接 aspart i c aci. ltml caci dと 効 果 の あ るこ とか らも推 察 され る.gua. 係 して い ないが, 一般 に微 生物 によ って よ く同化 ,. aspart CaCi dは生 体 内 の ア ミノ酸代 謝 にお いて密 接 l. l に入 tt は TCAcyce 利用 され る.同 化 され た aceae. ttの効 果 も この よ うを背 を関係 をもってお り,aceae. dに有効 な有機 酸 で あ るα-keo tgua lt Pa, lいcacl りaS. 景 が原 因 となって い る と考 え られ る.. rae t,f u. marae t,oxa. 】 oaceae tt を どに変 化 して い っ. l acae tt を添加 した場 合 は Fl g. 11に示 した が ,72時. CaC. lの生 ar. t l. d 成 に効 果 が あ った もの と考 え ら て asp. art d 生 成 が顕 著 に増 加 し, 5× l C aClの 間 か らaSP. 20 . ′ -､ ≡ も 1. 5 ≡. 0 1 ● ⑳ 1 A I L D l. : 5x) 02M 02M l: 1 診 ･ 5xl O3M :1 0 3M : 5xl O 4M. 0. p ! u t H. 5 0. !3 '｡ ds ?i. 0. 0. 24 48 72 96 I nc ua bt i ont i me ( hour ) Fi g･ 9･ Ef f e ctoi lr or maeo t nt hepr oduct i onof La s par t l Ca c i d by shc c ha r omy c e sc e r eM' s i ae. 72. 96. H･ ANSEN.. 5. ( T ∈＼ 叫 uJ ). 5. ‖‖. E ＼. ( T 叫uJ ). … こ jE ｢ ⑳一 一 一⑳ △一 一 . 一 一 △ 』⊇=i. . 5xlO2M 1 0-2M 5xl O3M 1 03 -M 5x. l 04M. 0 1 p! 3 c J Bd s 91. cb tJ. 0 5 1 o pで t:3T tld Cs t : ･ 1 24. 48. 1 nc ubat i ont i me. 72. 96. O5 .. 0. ( hour ). Fi g･ 10･ Ef f e ctofa c ea tt eontep h r oduct i onof La s par. t l. C a c i d by Sac c ha r omyc e sc e r eM' s i ae H ANSEN. 48. I nc ubat l Ont me ( hour ) Fil g.l. Ef f ectofl a ca tt eontep h r oduct i onof La s par. t i. ca c i dby Sac c ha r omyc e sc e r ev i s L ae. H ANSEN. 0. 2 4. 24 48 72 1 I l C I L l bt ai ont l me( hour ). Fi1 g.2･ Ef f c , ctofi t a conat eont hepr odu ct i onof La s par t i ca c i d by Sac c ha r omyc e sc e r ev L s E ae H ANSEN. 96.
(6) 6 4. 近 穀 大 草 農 学 部 紀 要. M∼ 5×1 Mの範 囲 で 有 効 で あって,aceae 1 0ー2 0J tt. 第. 6号. (1973). 使 用 され た 有 機 酸 に お い て , α -k eo tgua ltr ae t,. などの効 力の あ る有機 酸 と同 じ丑 の生 成 が認 め られ. t aceae tt,ci t rae t の添加 が L-aspar caci ) dの生成 に. た. しか し生 成 が認 め られ る時期 はaceae tt と異 な. tgua ltrae tで 有効 で あ り, そ の 添 加 濃 度 は, α-keo -2 0 2. 02 は 5×1 M∼1 M,aceae ttで は 5×1 0 M- 5× 1 3 1 0 M,c. i t rae tでは 1 012 M∼ 5×1 03 Mであった .1 ac-. ttの場 り比較的 おそ く,菌 の 生 育 に お い て もaceae 合 よ りもおそいことからも暗示 され る.しか しl acae tt が同化 ,利用 され るとpyr uvae t をどに変化 してTCA. c yc)に入 e par. t i. dの生成 に有 効 な有 機 酸 に りas c aci な るため には, この よ うを結果 が えられた もの と推. tt aeの場 合 に もかな りの効 果 が認 め られ, その濃度 2 3 は 5×1 0 M- 5×1 0 Mで あった. 他 方 cs iac oni tt ae,i s oci r ae y oxy) ae t,oxa1 t t,g】. ae t を添加 した場 合 には,Las par t i d c aclの生成 に. 論 された.. 0J2 M i t ac onae tの場 合 はFl g. 1 2に示 した が. 5×1. あ ま り効 果 が な く, さ ら にgy Ic oHae t,gl ycer ae t,. part i dの 生 c aci ∼ 5×1 Mの各濃度 において,as 04. f or mat e,i t ac onae t にお いては効 果 が少 な く,菌 の. 成 にあ ま り効 果 が ない. 1 iac oni tt aeか t aC Onae tはcs. 生 育 も抑制 され る傾 向 が認 め られた.. らac oni tt aedecaro bxya ls eによって生成 され,TCA. ltmat e L-. as pa r. t l. CaC. i dの生成 にはaspara tseや gua. cyclと関係 e t aC しているが,菌 の生育 もl On ae tの各濃. as para tt r ans ami n aseの ほ かに,さらにgua ltmat e et. 度 において, む しろ抑制 され炭 素源 と して同化 利用. dhd eyr ogenaseの作 用 も重 要 な役割 を演 じて い るこ. され ない もの と考 え られ る.. とが推 論 された.. 本 実 験 で使 用 され た 有 機 酸 に お い て,as par t i c. 文. と密接 な関係 をもつ 有 効 な有 機 酸 はci aclの生成 d t -. 献 R. Y. TA:J. Bace lrwL, . MoRI. r ae t, α-keo tgua ltr ae t,aceae ttで あ り さ らに I actt aeもかな り有 効 で あ る こ と が認 め られた. TCA. 1) R. D.. HAI GH Tan d. c yclの e itに あ る有 機 酸 で あ るci e k yp on t rae t,α-. UEadA H.DEP n . G. MoAT:i bi d. ,8,3 2 832) R.. lae t,OXaト umar k ltrae eo tgua t, さ らに f ae t,succn. 1 962). 83. .11 2-10 2 ( 1 961 ). 3 86 (. tt,l acae tt もas part i d 謝 に位 置 して い るaceae c aci. 1 95 7). WI AMS' .i bl d. ,7 0-411 ( LL【 4,41 3) V.R. ANSa nd R. R.WJLLl .B1 0I . N TYRE:J 4) V. T.McI. の生 成 に重要 な役割 を演 じて い るで あ ら うと推 論 さ れた.. ,21 7,4 6. 7-47 7 (9 15 5). Che m .. Bace Lril o. n Le o PJ NE:J. , cHAN ANad 5) B.B.BU. 係 の あ る代 oac eae tt, そ して さらにTCA c yclに関 e. 89. ,72. 9-73 3 ( 1 965).. Ⅳ 要. 約. 酵母 によるLCaCi as part l dの生成 につ いて椎 索 す るため に,Sa cca hr omycescere vI Sl ae HANSENを使 用 し,各種 の有機 酸 の効 果 につ いて検討 した･. W. CLAU ,M. OR T.BELLY: S. L. nd R. CU TTa 6) G. 96 ( i bi d. ,92,691-6 1 969). 1 972). 2 ( 5) 1 5-11 7) 鎌 田秀郎 :本誌 ,(,1 ( 昭和4 8年 1月25日受理).
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