岡山 医学会雑 誌 第117巻 May2005,pp.21-26
平 成15年 度 岡 山 大学 医学 賞(山
田賞)受 賞 論文
Ikaros
dominant-negative
isof6rmの
過 剰 発 現 は
dexamethasoneや
抗IgM抗
体 に よ るapoptosis誘
導 を 抑 制 す る
瀬 崎 伸 夫
呉共済病院 内科
キ ー ワ ー ド:Ikaros,dominant-negative isoform,apoptosis Ikarosはzincfinge構 造 を も つ 転 写 因 子 蛋 白 で リ ン パ 系 細 胞 に 強 く 発 現 し て お り,そ の 結 合 部 位 は CD3δenhancer1)やTdTpromotor領 域2)な ど リ ン パ 系 で 特 異 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 の 転 写 調 節 領 域 に み と め ら れ て い る.Ikaros蛋 白 で はalternativesplicing に よ り生 じ る 機 能 的 に 異 な っ たisoformの 存 在 が 報 告 さ れ て い る(Fig.1)3).N末 端 側 のexon3,4,5に zinc finger domainを2個 以 上 も つisoformがDNA 結 合 能 を 有 し,発 現 も 優 勢 で あ る.一 方 他 のisoformはDNA結 合 能 を も た ず,C末 端 側 のexon7に あ る
zinc finger domainを 介 し てisoform同 士 でdimer を 形 成 す る.DNA結 合 能 を も た な いisoformがDNA 結 合 能 を も つisoformとheterodimerizationし た 時, こ れ ら のDNA結 合 能 を 抑 制 す る=す な わ ちdominant negative effectを 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る4). MGHのGeorgopoulosら はIkarosのknockout mouseを 作 製 し 機 能 解 析 を お こ な っ た.ま ずDNA binding domainの あ るexon3,4が ホ モ で 変 異 し て
い るknockout mouseは,T,B,NKcellの み な ら
ず そ れ ら の 前 駆 細 胞 も 欠 失 し て お り 生 後 ま も な く死 亡
す るが,骨 髄 球 系 ・赤 芽 球 系 はintactだ っ た5).次 に DNAbinding domainが ヘ テ ロ で 変 異 して い るknock-outmouseは,生 後1ヶ 月 でTcellのclonalな 増 殖 が お こ り,3ヶ 月 後T細 胞 性 白 血 病 も し くは リン パ 腫 を100%発 症 し た6).こ れ らknockout mouseの 解 析 か らIkarosは リ ン パ 系 の 発 生 ・分 化 に 重 要 で あ り,さ ら に リン パ 系 に お け る癌 抑 制 遺 伝 子 と し て の 働 き が 示 唆 さ れ た.こ の こ とか ら我 々 は ヒ ト造 血 器 腫 瘍 に お け るIkarosの 発 現 状 況 を調 べ て み た. 当 科 の 中 山 が ヒ ト血 液 細 胞 株 に お け るIkarosの 発 現 状 況 をRT-PCRでscreeningし た と こ ろ,ほ と ん ど全 て の 細 胞 株 が 正 常 リン パ 球 同 様DNA結 合 能 を も つIk-1,2/3を 強 く発 現 し て い た が,慢 性 骨 髄 性 白 血 病 リ ン パ 性 急 性 転 化 細 胞 株 のBV-1737)で は, dominant-negative isoformで あ るIk-6の み が 強 く 発 現 さ れ て い た.慢 性 骨 髄 性 白血 病 患 者 骨 髄 細 胞 で 調 べ た と こ ろ,急 性 転 化 症 例 の み で5/17にdominant-negative isoform:Ik-6の 過 剰 発 現 を み と め た8). ま た 中 瀬 は 成 人 急 性 リ ンパ 性 白血 病 患 者 骨 髄 細 胞 に お け るIkarosの 発 現 状 況 を調 べ た と こ ろ,14/41で dominant-negative isoform:Ik-6の 過 剰 発 現 を み と め た9). 以 上 の よ う に ヒ トB細 胞 性 腫 瘍 に お け るIk-6過 剰 発 現 を み とめ た た め,私 はIkarosの 癌 抑 制 遺 伝 子 と 平 成17年3月 受 理 〒737-8505呉 市 西 中 央2丁 目3-26 電 話:0823-22,2111FAX:0823-25-4752 E-mail:[email protected] ◆ プ ロ ブ ィ ー ル ◆ 平 成5年 岡 山大 学 医 学部 血 液 ・腫 瘍 ・呼 吸器 内 科 学(旧 内 科 学第 二)講 座 に入 局,臨 床 研 修 の後 平 成8年 帰 局. 病 棟 医 員 を務 め なが ら研 究 につ い て考 え て い ま した.当 時 か ら今 も臨 床血 液 の 現場 で は移 植治 療 が 全 盛 で すが, 少 な くと も私 の周 囲 で移 植 に よっ てQOLも 含 め て よ り良 い予 後 を享 受 で きた 患者 さん は少 な い と感 じ ま した.一 方 で腫 瘍 特異 的 な分 子標 的 治 療 の開 発 が 注 目 され て お り,私 もその よ うな研 究 を や りたい と思 い平 成9年 か ら約 3年 間 石 丸文 彦 先 生指 導 の 下 転 写因 子 の研 究 をお こな い ま した.臨 床 の 医局 で 基礎 的 な研 究 を お こな うこ とは困 難 を極 め ま したが,粘 り強 く実験 を続 けた結 果 何 とか ま と まっ たデ ー タ で論 文 に な りま した.現 在 私 は 臨床 の 現 場 に戻 って い ます が,研 究 で得 た 知識 は十 分 に役 立 って い る と思 い ます.ま た 医局 で は 当時 よ りも遥 か にqua/ity の高 い研 究 が展 開 され て お り,隔 世 の 感 す らあ り ます.臨 床 に 直結 す る研 究 成 果 を得 るに は まだ道 程 は険 しい よ うです が,私 も何 らかの お役 に立 てれ ば と思 い ます.
し て の 機 能 解 析 の 一 端 と し てIk-6過 剰 発 現 がB細 胞 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 研 究 す る た め,ヒ ト リ ン パ 系 細 胞 株 を 用 い てIk-6transfectantsを 作 製 し そ の apoptosis感 受 性 変 化 に つ い て 解 析 し た10). FDH-1はearlypre-BALL患 者 か ら 樹 立 し た. myeloperoxidase陰 性 でFAB分 類 で はL2,表 面 マ ー カ ー はCD19 ,HLA-DR陽 性 でCD10,CD20, surface&cytoplasmic immunoglobulin 陰 性, Southern blotting
で
immunoglobulin heavy chainrearrangement を 確 認 し た.transfectantsは, BV173 で み と め ら れ たIk-6cDNAをmammalian expres-sion vector:pcDNA3.1を 用 い てsubclone化 し,通
常 のIk-1,2/3を 発 現 し て い るFDH-1お よ びEBV
-negative Burkitt's lymphoma cell line: Ramos
electroporation[250V/960,uF]
で遺 伝 子 導 入 して 作
製 し た.同 様 に し て Ikaros full-length transfectants
及 び
vector only‚Ìmock transfectants を作 製 し た.FDH-1は ヒ ト リ ン パ 系 細 胞 株 の 中 でdexameth-asone induced apoptosisの 感 受 性 が 高 か っ た の で,
こ れ に つ い てwildtypeとtransfectantsで 比 較 し た. さ ら に 同 じcaspase3を 介 し たapoptsis刺 激 と し て
anti-IgM induced apoptosis に つ い てRamosと
transfectantsで 比 較 し た.
apoptosis誘 導 の 前 に 抗Ikaros抗 体 を 用 い
たim-munoblottingでFDH-1及 びRamosがIk-6を 発 現 し て い な い こ と,Ik-6transfectants[FB1,2, 3&RB4,7]がIk-6を 十 分 に 過 剰 発 現 し て い る こ と を確 認 した(Fig.2).定 常 培 養 状 態 で はwild-type とtransfectantsに お い て 細 胞 増 殖 能 や 細 胞 周 期 に 差 は み と め ら れ な か っ た. FDH-1と そ の transfectants は dexamethasone [DEX]10-7Mで48時 間 処 理 し,AnnexinV,TUNEL, Apo2.7の 手 法 を 用 い てapoptosis誘 導 に つ い て 比 較 し た.AnnexinVはapoptosis初 期 段 階 で 細 胞 膜 外 側 へ 暴 露 し たphosphatidyl serineにCa依 存 性 に 結 合 す る.こ のAnnexinVをFITC標 識 しpropidium
iodideと の2重 染 色 の 後flow cyetometer[FCM]で
apoptosisを 定 量 化 し た.FDH-1で はDEX処 理 で
apopsisお よ び apoptotic secondary necrosis
を示 す
AnnexinV陽 性 細 胞 が 多 く誘 導 さ れ た が,transfectant [FB3]で は そ の 誘 導 が 抑 制 さ れ て い た(Fig.3A).
TUNEL法
[TdT-mediated
dUTP nick end
la-beling]
はapoptosisの 最 終 段 階 で お こ る特 徴 的 なDNA fragmentationの 断 端 に,dUTPをterminal transferaseを 用 い て 結 合 さ せ る 方 法 で,こ のdUTP をFITC標 識 しFCMでapoptosisを 定 量 化 し た. FDH-1で はDEX処 理 でapoptosisが 著 明 に 誘 導 さ れ た の に 対 し て,transfectant[FB3]で は ほ ぼ 不 変 だ っ た(Fig.3B). Apo2.7はapoptosisの 過 程 で 特 異 的 にMitochon-dria膜 に 発 現 す る 蛋 白 に 対 す る 抗 体 で,こ れ をPEで 標 識 しFCMでapoptosisを 定 量 化 し た.FDH-1で はDEX処 理 でapoptosisが 著 明 に 誘 導 さ れ た の に 対 し て,transfectant[FB3]で は 軽 度 だ っ た(Fig.3C).
転 写 因 子Ikarosのapoptosisへ の 関 与:瀬 崎 伸 夫
Fig.2 The immunoblotting study of the whole cell lysates from transfectants of the dominant-negative isoform Ik-6. Whole cell lysates from wild-type and Ik-6 transfectants were analyzed with an anti-Ikaros antibody as the primary antibody. The positions of molecular weight standards and Ikaros isoforms are indicated.They were also analyzed with an and-Spl antibody as a control.
A
C
B
D
Fig.3
Flow cytometric analysis of dexamethasone-induced
apoptosis in FDH-1cells.
Apoptosis was measured by staining with(A)Annexin
V-FITC and PI,(B)TUNEL,or(C)Apo
2.7-PE.NT:not
treated,DEX;
dexamethasone treated, PI;propidium iodide.(D)Statistical
analysis[ANOVA
test].
ず れ で もIk-6transfectantsに お い てdexameth. asoneに よ るapoptosis誘 導 が 統 計 学 的 有 意 [ANOVAtest]に 抑 制 さ れ て い る こ と を 確 認 し た(Fig. 3D).さ ら にapoptosis抑 制 の 程 度 は,Ik-6過 剰 発 現 の 程 度 と 相 関 し て い た.mock transfectantsの apoptosis誘 導 はwild-typeと 同 程 度 だ っ た.
PARP:poly(adenosine diphospate [ADP]-ribose)polymeraseは,DNA修 復 に 関 与 す る 酵 素 で apoptosis初 期 に 活1生 化 さ れ たcaspase3に よ り116 kD intact formか ら85kD fragmentにcleavageす
る.DEX10-7M,24∼30時 間 処 理 後,各 細 胞 のwhole
cell lysatesを 抽 出 しimmunoblottingでPARP cleavageを 経 時 的 に 観 察 す る と,85-kDproteolytic fragmentの 出 現 はIk-6transfectantsに お い て 抑 制 さ れ て い た(Fig.4).
次 に 同 じcaspase3を 介 し たapoptsis刺 激 と し て anti-IgMinduced apoptosisに つ い てRamosと そ の Ik-6transfectantsで 比 較 し
た.Ramosとtrans-fectants[RB4,7]は,抗IgM抗 体20μg/me,24時
間 処 理 でapoptosis誘 導 し,AnnexinV-FITCと propidium iodideの2重 染 色 を し た 後FCMで apeptosisを 定 量 化 し た.apoptosisを 示 すAnnexin V陽 性 率 はIk-6transfectantsで 有 意 に 減 少 し て い た(Fig.5).一 方 抗IgM抗 体 処 理 に よ りapoptosis と と も に お こ っ たcell cycleの 変 化:Glarrestに
つ い て はwild typeとtransfectantsで 差 を み と め な か っ た.ま たmock transfectantsのapoptosis誘 導
さ ら に 各 細 胞 のwhole cell lysatesを 抽 出 し,im-munoblottingでbcl-2family[bcl-2,bcl-x,bax] の 発 現 変 化 を観 察 す る と,Ramos,IK-6transfectants と も 抗IgM抗 体 刺 激 でbcl-2蛋 白 の 発 現 誘 導 を み と め た がup-regulationの 程 度 はIK-6transfectants の 方 が 顕 著 で,bcl-2/actin比 はRB4でRamosの 4倍,RB7で2倍 だ っ た.bcl-x,baxの 発 現 に は 差 を み と め な か っ た(Fig.6). FDH-1と そ のIk-6transfectantsで も 同 様 に DEX処 理 後 のbcl-2familyの 発 現 変 化 に つ い て 観 察 し て み た が,い ず れ も発 現 に 差 は み と め ら れ な か っ た(data not shown).他 の グ ル ー プ で は,マ ウ ス 骨 髄 球 系 細 胞 株 を 用 い てIk-6過 剰 発 現 がbcl-xLの up-regulationを 誘 導 す る と報 告 し て い る11).ま たIkar-osfamilyの1つ で あ るAiolosのbcl-212)やbcl-xL13) の 発 現 調 節 へ の 関 与 を 示 す 報 告 も あ る.い ず れ も 限 定 さ れ た 細 胞 株 で の 結 果 な の で,他 の 遺 伝 子 変 異 が 影 響 を 与 え た 可 能 性 も 否 定 で き な い. 今 回 我 々 は ヒ ト リ ン パ 系 細 胞 株 に お い てdominant-negative isoform:Ik-6の 過 剰 発 現
がdexameth-asoneや 抗IgM抗 体 に よ るapoptosis誘 導 を 抑 制 す
る こ と を 示 し た.こ の 結 果 は 本 来apoptosisで 排 除 さ れ る べ き 細 胞 集 団 の 生 存 を 許 す こ と で,Ik-6過 剰 発 現 が 腫 瘍 化 に 関 与 し て い る 可 能 性 を 示 し て い る.リ ン パ 系 細 胞 に お け るglucocorticoid induceda poptosisに つ い て は こ れ ま で 多 く の 研 究 が な さ れ て お り,NF-κB やc-myc,AP-1な ど の 転 写 因 子 の 関 与 が 示 唆 さ れ て
Fig.4 The immunoblotting study of dexamethasone-induced apoptosis with anti-PARP antibody.
Whole cell lysates from wild-type and transfectants were analyzed with an and-PARP antibody.They were also analyzed with an and-Spl antibody as a control.
転 写 因 子Ikarosのapoptosisへ の 関 与:瀬 崎 伸 夫
A
B
Fig.5
Flow cytometric analysis of anti-IgM-induced apoptosis in Ramos cells.
(A)Ramos cells and Ik-6 transfectants were treated with 20,ug/ml and-IgM antibody for 24 hours and analyzed by staining with
Annexin V-FITC and PI. NT:not treated,IgM;anti-IgM
treated,(B)Statistical
analysis[ANOVA
test].
Fig.6 The immunoblotting study of bcl-2 family in Ramos cells.
Whole cell lysates from wild-type and transfectants were analyzed with antibodies against bcl-2,bcl-x,and bax.They were also analyzed with an and-actin antibody as a control.
