繊維芽細胞DNA鎖切断にあたえる50 Hz 磁場の影響
―コメットアッセイによる解析
著者
中山 希祐
学位授与機関
Tohoku University
修士論文
繊維芽細胞
DNA 鎖切断にあたえる
50Hz 磁場の影響
－コメットアッセイによる解析
目次
第1 章 背景と目的 ... 4 -1.1 背景 ... - 4 - 1.2 目的 ... - 8 - 第2 章 方法 ... 11 -2.1 コメットアッセイ（単一細胞ゲル電気泳動法） ... - 11 - 2.3 メリットコイル ... - 12 - 2.3.1 メリットコイルの磁場 ... - 13 - 2.3.2 コイル内磁場分布 ... - 14 - 2.3.3 コイル内温度 ... - 16 - 第3 章 材料と方法 ... 18 -3.1 使用した細胞と培養方法 ... - 18 - 3.1.1 繊維芽細胞の培養方法 ... - 18 - 3.2 磁場曝露装置... - 18 - 3.2.1 磁場曝露条件 ... - 20 - 3.3 コメットアッセイ（単一細胞ゲル電気泳動法） ... - 21 - 3.2 電気泳動 ... - 22 - 3.3 解析方法 ... - 23 - 3.4 統計解析 ... - 25 - 第4 章 結果 ... 26 -4.1 過酸化水素を用いたポジティブコントロール実験 ... - 26 - 4.2 非曝露サンプルを用いたネガティブコントロール実験 ... - 28 - 4.3 連続波形磁場曝露実験 ... - 30 - 4.3.1 50Hz、連続 sin 波、100μT ... - 30 - 4.3.2 50Hz、連続 sin 波、500μT ... - 34 - 4.3.3 50Hz、連続 sin 波、1000μT ... - 39 - 4.4 断続波形磁場曝露実験 ... - 41 - 4.4.1 50Hz、断続 sin 波、100μT ... - 41 - 4.4.2 50Hz、断続 sin 波、500μT ... - 44 - 4.4.3 50Hz、断続 sin 波、1000μT ... - 49 - 4.5 時間による平均値比較 ... - 54 -4.5.1 Tail Length (px)の時間による比較 ... - 54 - 4.5.2 Tail Area (px)の時間による比較 ... - 56 - 4.5.3 Tail Moment の時間による比較 ... - 59 - 第5 章 結論と考察 ... 61 参考文献 ... 64 謝辞 ... 65
-第
1 章 背景と目的
1.1 背景
電磁波とは電気と磁気の波であり、電気が流れるところや電波の行き交う場では必ず 電磁波が発生する。近年、我々は生活環境の変化からあらゆる場所で電磁波に曝されて いる。中でも電灯線や送電線から放射される低周波(50 / 60 Hz)の交流電場から発生す る磁場の身体への影響は50 年近く前から関心を集め、様々な研究がなされている。 我々、生物は常に地磁気環境のもとで生きている。地磁気は静磁場であり、強度は 35~70 μT である。（表 1）人間はこの地磁気を知覚することはできないが、生物の中 には静磁場を利用している生物もいる。これらの磁気感知能力について、地磁気を感知 して方向や進路の決定に利用する能力が、数十種の動物に備わっていることが知られて いる。研究者は動物の行動や解剖によって研究されている。 また、伝道磁場に関しては電離放射線に曝されると電子が飛ばされてダメージを受け た原子がイオンやフリーラジカルに変化することがわかっている。ラジカルは分子を酸 化し周辺にある細胞の構造を変えDNA などの生体組織を傷つける。DNA へのダメー ジは遺伝子の突然変異につながり、修復できなければ染色体が壊れることもある。重要 な遺伝子に対する修復不可能な障害は、その細胞の機能を果たすための能力を阻害した り、癌のような異常な増殖を引き起こす。 しかし、液体や体の組織に存在する原子を電離するには10 eV 以上のエネルギーが必 要であり非電離放射線である低周波電磁場は原子や分子をイオン化するエネルギーは 持っていない。そのため直接 DNA にダメージを与えることはできないと考えられる。 非電離放射線の場合は吸収されたエネルギーは電磁誘導、細胞膜内外の静電気蓄積、電 気伝導作用を起こし共鳴し、ある周波数帯で増幅され、間接的にダメージを与えると仮 定することもできるが、実際は未だ不明である。ダメージは生化学的指標の変化により 測定されるが、細胞は尊称に対して修復もしうるので必ずしも損傷の検知は再現性がよ くない。疫学的研究から低周波磁場と生体への影響について相関はありそうだが、再現 性の悪さがメカニズム解明の弊害となっている。 細胞の磁場に対する影響に関しても研究がなされている。磁場曝露の影響として DNA 損傷や細胞の一酸化窒素の産生の変化、細胞の増殖・分化の促進などがある。磁場が与えるDNA 損傷について、Singh と Lai はラットに 60 Hz、10 µT の磁場を 24 時間、48 時間曝露し、神経細胞の DNA 一本鎖切断 (Single-strand break; SSB)と 二本鎖切断（Double-strand break; DSB）（図 1）をコメットアッセイ（2.1 コメット アッセイ（単一細胞ゲル電気泳動法））という解析方法で分析した。Lai と Singh は DNA の損傷度が磁場曝露群において非曝露群より有意に増加することを示した。（図2）（図 3）更に磁場による DNA 損傷はラジカルの消去剤であるビタミン E によって消失した。 これらのことからLai と Singh は低周波磁場がラジカル産生を増加させて DNA 鎖切断 へつながったと考えている。[1] 図 1 DNA 一本鎖切断（右）と DNA 二本鎖切断（左） （http://imgboat.com/view/mdH） また、変動磁場を曝露することで、ヒト臍帯由来血管内日細胞（HUVEC）の一酸化 窒素産生量が統計的有意に変化する[2]ということや、細胞の一酸化窒素合成酵素 （NOS）の発現と活性が変化する[3]ことが分かった。NOは生体内で殺菌作用、血圧調 節やアポトーシスの制御など様々な役割を担っている。特に過剰なNO産生はヒドロキ シラジカルを増加させ、結果的にDNA損傷を引き起こすことが知られている。他にも、 骨芽細胞の分化・増殖を促進、骨代謝を促す[4]、活性酸素種（O2-、H2O2など）産生量、 種々の蛋白質発現などさまざまな生体現象が指標として取り上げられ研究されている。 このように磁場が生体や細胞に与える影響についての様々な研究が進められている が、細胞レベルの影響に関する基礎的知見の不足によって研究者間で統一した見解は得 られていない。
図 2 Singh と Lai による先行研究（2004）
上段が非曝露群、下段は曝露群の結果 縦軸：頻度、横軸：損傷度
図 3 Singh と Lai による先行研究（2004）
表 1 身のまわりの電磁場について （環境省の報告によるhttp://www.env.go.jp/chemi/electric/material/minomawari.pdf） 名称 周波数 波長 主な発生源 静電磁界 0 Hz - 地磁気（35~70 μT） 磁気共鳴画像撮影装置(MRI) 超低周波電磁界 >0 Hz~300 Hz ~1 km 家電製品、電力設備（50 Hz、60 Hz） 中間周波電磁界 300 Hz~10 MHz 1 km~30 m IH 調理器(20~90 kHz) 放送局・通信設備（数百 kHz~） 鉄道 高周波電磁界 10 MHz~300 GHz 30 m~1 mm 携帯電話、基地局（800 MHｚ~数 GHz） 無線機器（~数十 GHｚ） 通信設備（~数十 GHｚ） 電子レンジ（2.45 GHz）
1.2 目的
我々は、生体と電磁場がDNA に及ぼす影響の詳細を明らかにすることには生体と電 磁場の相互作用メカニズム解明につながるという大きな意義があると考えた。 細胞を用いた磁場影響評価の指標としてDNA 損傷や NO 産生量変化、細胞の分化・ 増殖の促進などがある。NO の過剰産生などが DNA 鎖切断を引き起こす。ほとんどの DNA 鎖切断は修復されるが、DNA 鎖切断の修復に失敗し、遺伝子異常が起こると結果 として癌化やアポトーシスを起こし、生体に影響を与えると考えられる。そこで我々は 磁場の影響として最も初期の過程あるいはそれに近い位置にあるDNA 鎖切断という現 象に着目し、DNA の損傷について実験を試みた。 本研究では低周波磁場である周波数 50 Hz の磁場の細胞への影響をコメットアッセ イという解析方法によって調べた。コメットアッセイは元々、化学物質や放射線被曝に よって生じるDNA 鎖切断の程度を定量する方法である。DNA 損傷を検出するために は他にも多くの手法が用いられている。1小核法や染色体異常試験などである。しかし ながら、これらの細胞遺伝学的方法は細胞を増殖させる必要があり技術的にもやや複雑 である。我々は操作が単純ながら比較的高感度でDNA 鎖へのダメージを評価できるこ とに着目し、このコメットアッセイを様々な磁場条件（強度や時間、波形）における DNA 鎖切断をスクリーニングする方法として最適化したいと考え、実験を行った。 磁場条件に関してEU 加盟の各国プロジェクトのおこなった REFLEX[9]内の一連の 実験でIvencsits ,S. et al.は 50 Hz、1000 μT の連続波形の正弦波磁場曝露より正弦波 断続波形の磁場曝露の方がDNA 損傷を引き起こす事をコメットアッセイによる実験か ら結論付けた。中でも5 分間磁場曝露を on にし、10 分間磁場曝露を off にする断続磁 場を24 時間曝露した実験条件が最大の DNA 鎖切断を引き起こすことを示した。[2]（図 4）このとき用いた評価方法は得られた画像を損傷度の高さを目によって A , B , C , D , E の 5 段階に分類し、それぞれの個数 k（k = A ~ E） と損傷度を数値化した Fk を用 いて下式のようにそのサンプルの損傷度であるtailfactorを求め評価を行った。（図 5） [11] tailfactor =∑
k= A E k ×F k 1000 このメリットは多くのサンプル（細胞）を扱うことができ統計的に解析しやすい事であ 1 小核とは、細胞中に普通の核とは別に存在する小型の核のことをいう。通常は存在しない病的な核であ る。細胞分裂の際に一部の染色体が正常に分配されず、本来の核に取り込まれずに残ることで生じる。そる。しかしながら、この方法では人間がコメットを分類するため恣意的な結果となり客 観性に欠ける恐れがある。信頼できる結果を導くには、コメットアッセイの定量評価を システマティックに行う必要があると考え、後に（3.3 解析方法）で述べるような評 価方法を採用した。
また、Ivencsits ,S. et al.は 5 分間磁場曝露を on にし、10 分間磁場曝露を off にする 断続磁場の曝露時間とDNA 損傷度についても同様の解析方法で様々な細胞について実 験を行った。繊維芽細胞を用いた実験結果では15 時間曝露に明瞭なピークが見られ、 最大の損傷度を引き起こすと結論付けた。（図 6）[8] 本実験では連続波形と断続波形の細胞への磁場曝露による損傷度比較、また磁場の強 度や曝露時間のDNA 損傷度を定量的に比較し、磁場の細胞への影響を調べた。 図 4 Ivencsits,S.et al による先行研究[2002] exposure は曝露、sham は非曝露（擬似曝露）を表す
図 6 Ivencsits,S.et al による先行研究[2005]
第
2 章 方法
2.1 コメットアッセイ（単一細胞ゲル電気泳動法）
コメットアッセイはDNA 鎖損傷度の測定のため Singh et al.によって 1991 年に確立 した解析方法である。[10]この解析方法は真核細胞における 核内の DNA の一本鎖、 二本鎖の切断の程度を半定量的に評価する上で感度がよい方法である。主に、化学物質 やディーゼル粒子などの環境汚染物質の遺伝毒性評価、ヒト集団における遺伝毒性影響 のバイオモニタリング、またDNA 損傷と修復の基礎研究などの領域で広く応用されて いる。 DNA は細胞の核内という狭い空間にねじられさらによじれたスーパーコイルの状態 で押し込められている。（図 7）DNA 損傷が生じ、DNA 鎖が切断されかつ、DNA が 絡み付いているたんぱく質（ヒストン）が除かれていることでDNA 構造内のスーパー コイルがほどける。この状態で電気泳動することで、ゲル中の核から遊離したDNA は 核の頭から流れ出す尻尾のように観察される。（図 8）損傷度が大きいほど DNA はほ どけてゲルの中を流れやすくなり尻尾の長さが長くなることを利用し、DNA 損傷度を 定量的に測定できる。観察されるDNA が彗星（コメット）のように見えることからコ メットアッセイと名付けられた。
図 8 コメットアッセイ （http://www.jniosh.go.jp/publication/JOSH/pdf/vol3no1/Vol03No1-07a.pdf）
2.3 メリットコイル
磁場の印加にはメリットコイルを用いた。このコイルはMerritt らによって開発され たもの [1]を基本としている。メリットコイルは四角形のコイルを 4 つ連ねて構成され ている。（図 10）各コイルはエナメル線で2 重に巻かれており、それぞれのコイルの巻 き数は、上から1 段目・4 段目が 26 巻、2 段目・3 段目が 11 巻で、一辺の長さは 20 cm の正方形である。このメリットコイルは内部磁場が均一な空間が大きい点が特徴であり、 コイルは通電に伴いジュール熱を生じる。これは磁場印加に伴う交絡因子となりうる。 そこでメリットコイルには二本の銅線が平行に巻き、二重配線にすることで、非曝露用 コイルで電流を逆向きに流し、磁場をキャンセルしつつ同様のジュール熱効果が生じる ようにしている。（図 10）配線を切り替えることで曝露用コイル、非曝露用コイルの条 件は入れ替えることができる。また、コイル内の電場をできるだけ抑えるためにアース を用い、各コイルには銅箔を巻きつけた。これによってコイル内電場は 1 V/m 以下に なった。細胞
溶解溶液
アルカリ性
緩衝溶液
電気泳動
コメット
DNA損傷二重らせん
アルカリ 性緩
衝溶液
図 9 メリットコイル概略図 図 10 メリットコイル内二重配線の概略図
2.3.1 メリットコイルの磁場
メリットコイルの磁場の大きさは Bio - Savart の法則から導いた下の式を求めるこ とができる。[11] Bz(z)=∑
i =1 4 2√
2μ
0Ni/π
d π d (1+4 ( z− zi) 2 d2 )√
1+ 2( z−zi) 2 d2 i はコイルの上から数えた番号、コイルの巻き数を N、コイルの幅を d、コイルの中 心を原点としたときのコイルの座標をz とし、コイルに幅がないものとして計算した。 （表2、図 11） i ｚ N 非曝露用コイル 曝露用コイル 20cm図 11 メリットコイルの構造
2.3.2 コイル内磁場分布
コイル内の磁場の一様性を確かめるため、~1000 μT の磁場を細胞培養装置であるイ ンキュベータ内で発生させたとき、コイル内部の細胞を培養するステージ上で平面を 16 分割し、それぞれの磁場を測定した。測定には LakeShore の 421 Gaussmeter（ホ ール効果プローブモデル、感度5 %）を用いた。最も磁場の強い部分と弱い部分の差は 最大で4%程度であった。（図12）コイル内磁場の分布は図 13 のようになった。右奥に 行くほど磁場が高くなる結果が得られた。実験時、メリットコイルのすぐ右側と奥側に 細胞培養用インキュベータの内壁があったことからインキュベータ内の磁場に影響さ れ結果として右奥ほど高い磁場強度となったものと考えられる。 図 12 コイル内部磁場の一様性[ μT ] 932 939 944 950 927 937 942 959 927 931 940 942 922 932 940 942図中のグリッドの中心で磁場測定 900 910 920 930 940 950 960 磁場強度 （μ T ） 図 13 コイル内部磁場の一様性実験結果
2.3.3 コイル内温度
磁場曝露の実験をする際に同時に温度も測定し、同じ温度になるよう調節を行った。 なぜならば温度差は磁場曝露実験において交絡因子と成り得るからである。測定には T&D の Thermo Recorder おんどとり TR-71Ui（図 14）を用い、温度測定用プロー ブには樹脂被覆センサを用いた。この装置の温度測定精度は0.2℃程であった。細胞 培養用インキュベータの扉の開け閉めによって設定温度になるためには最大 4 時間 程度かかることがわかった。連続波形曝露時は断続波形磁場曝露時に比べ速やかに温 度がほぼ一定な値を示した。また、連続波形の磁場曝露の温度変化に比べて断続波形 磁場曝露（5 分 on、10 分 off）は設定温度付近になった後も 0.1℃のふらつきが観察 された。（図 15、図 16）
図 14 T＆D の Thermo Recorder おんどとり TR-71Ui
33 34 35 36 37 38 0 3 6 9 12 15 18 時間 温度 [℃ ] 非曝露 曝露 図 15 メリットコイルの温度変化比較（100 μT 連続波形磁場、18 時間曝露） 平均値（0~18 時間） 非曝露：36.97℃ 曝露 ：36.93℃
36.5 36.6 36.7 36.8 36.9 37 37.1 0 4 8 12 16 20 24 時間 温度 [℃ ] 非曝露 曝露 図 16 メリットコイルの温度変化比較（1000 μT 断続波形磁場、24 時間曝露） 平均値（0~24 時間） 非曝露：36.96℃ 曝露 ：36.97℃ 拡大図
第
3 章 材料と方法
3.1 使用した細胞と培養方法
実験には株化されたSwiss albino 系統のマウス ( Mus musculus ) 胚由来の繊維芽 細胞 ( 以下 3T3-Swiss albino と呼ぶ ) を用いた。
図 17 3T3-Swiss albino
3.1.1 繊維芽細胞の培養方法
細胞は理化学研究所バイオリソースセンターから購入後、10 cm ディッシュに播種し、 インキュベータ内で5 %CO2、37℃の条件下で培養した。培養培地は、ダルベッコ変法
イーグル培地（DMEM）と D-グルコースに 10 %牛胎児血清（Fetal Bovine Serum）、 1 %Penicilin-Streptmycin（GIBCO）、2 %L-グルタミン、1 %炭酸水素ナトリウム （NaHCO3）を加え用いた。数回植え継ぎをして増やし、液体窒素内に凍結し、保存し
た。実験には、解凍した細胞を24 時間以上培養した細胞を使用した。
3.2 磁場曝露装置
コイルに電流を流すことによって生成する。磁場曝露装置のファンクションジェネレー タ は nf の WAVE FACTORY 15MHz シ ン セ サ イ ザ ー MULTIFUNCTION SYNTHESIZER WF1943A と WF1973 を 用 い た 。 ま た DENON の ア ン プ INTEGRATED AMPLIFIER PMA-390SE を用いて電流を増幅させた。（図 18）
図 18 使用したファンクションジェネレータ（左）とアンプ（右） アンプの設定が変わらないようVolume のつまみを赤いテープで固定している 曝露用コイル、非曝露用コイルは別々の細胞培養用インキュベータ（37℃、0.5 %CO2） にそれぞれ設置し、細胞を播種した6cm 培養用ディッシュを置いて、50Hz（正弦波） で通電し連続磁場の印加をした。また、ファンクションジェネレータの設定の変更によ り、5 分 on10 分 off の断続波形の磁場印加を行った。 図 19 インキュベータ内のメリットコイル 各コイルからアースを 取り電場を1 V/m 以下 に低減
図 20 メリットコイルの内部
3.2.1 磁場曝露条件
本実験では以下の条件で磁場を曝露した後コメットアッセイを行った。実験条件毎に 曝露時間がまちまちになっているのは実験の便宜上のためである。 連続波形磁場 断続波形磁場 100 μT 18 時間、22 時間、48 時間 15 時間、18 時間 500 μT 18 時間、20 時間、24 時間 1 時間、15 時間、18 時間、24 時間 1000 μT 15 時間 15 時間、18 時間、24 時間 曝 露 用 デ ィ ッ シ ュ は コイルの中央に置く3.3 コメットアッセイ（単一細胞ゲル電気泳動法）
Trevige 社（コメットアッセイ用アガロースやバッファーを製造）のプロトコルを基 本としてコメットアッセイを行った。下にその手順を示す。但しすべての作業は黄色い 照明の下で行う。 1. 磁場印加を終えたディッシュをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすぎ、細胞をゴ ム箆状のラバーポリスマン（図 21）でディッシュから丁寧に剥がす。 2. 15 cc チューブに回収し、計数して細胞密度を測定する、遠心分離（27.95g、5 分） した後、新しいPBS で密度が 5 × 105 個/ ml になるよう新しい PBS で懸濁する。 3. 細胞懸濁液を低融点アガロースゲルで 10 倍に希釈しコメットアッセイ用スライド ガラス（図 22）二枚に 75 μl ずつ 8 箇所（ひとつの条件について 4 箇所）滴下し 冷やすことでスライド上に固定化する。 4. その後 4℃で溶解溶液(Lysis Solution)にスライドごと 60 分浸し細胞膜やヒストン を溶解する。 5. アルカリ性条件（ > pH 13）のバッファー（300 mMNaOH、1 mM 2EDTA）に 室温で60 分浸した後、アルカリ性条件のバッファーの液面から 5 mm の深さにス ライドを置き4℃で、1 V/m、204 mA（所有する電源で到達可能な最大電流）の条 件で120 分電気泳動を行う。 6. 蒸留水ですすぎ、70%エタノールに 5 分間浸し中和する。7. SYBR GreenⅠ（1 μl、SYBR GreenⅠと 10 ml、pH7.5 TE Buffer の混合溶液） で蛍光染色し、蛍光顕微鏡でコメットの画像を取得する。
図 22 コメットアッセイ用スライド 一枚につき二箇所サンプリングできる 図 23 コメットスライドの断面図 ゲルに細胞を包埋する
3.2 電気泳動
電気泳動装置内にスライドを対称になるように並べた。電気泳動槽にはコメットスラ イドから5 mm の高さまで緩衝溶液で満たした。電気泳動槽内で非対称にスライドを配 置し実験を行う場合に比べ対称に配置した場合の方がスライド間での解析パラメータ に差がなかったことから、スライドをできるだけ真ん中に対称に置いた。（図24） 図 24 電気泳動装置とスライドガラスの配置 アガローズゲル 細胞 サンプルを75μl ずつ 二個所に滴下しゲルを 硬化させる3.3 解析方法
一つの条件から200 個前後のコメットを画像処理した。図 25 に典型的なコメットパ タ ー ン を 示 す 。 コ メ ッ ト ア ッ セ イ に 対 す る 解 析 フ リ ー ウ ェ ア で あ る TriTek CometScore™・freeware v1.5 ( http://www.tritekcorp.com ) を用いて、図に示すよ うな長さや強度分布等のパラメータを用いた。 実験で取得した画像を CometScore で読み込みバックグラウンドを差し引いてから コメットを枠で囲むと自動的に図26、図 27 のように得られる。 図 25 観察されるコメットの画像 図 26 CometScore を用いて画像解析を行う図 27 CometScore を用いたコメットの画像解析
（http://autocomet.com/index.php）
自動的に次で説明するパラメータが得られる。
Comet Length (px) （図中の Total Length） コメットの水平方向のピクセルの数
LC = Nx
Comet Intensity
Comet Area の各ピクセルの強度 IC ( x , y )I()を積算した値
IC = Σ IC ( x , y ) Head Diameter (px) コメットのヘッド部分の水平方向のピクセルの数 LH = NHx Tail Length (px) Comet 全長 LCからHead 長 LHを差し引いた値 LT = LC－LH Tail Area (px) テール部分のピクセルの数の合計 AT = NT ( x , y ) Tail Intensity Tail Area の各ピクセルの強度 IT ( x , y )を積算した値 IT = Σ IT ( x , y )
Tail Mean Intensity
μI = IT / AT %DNA in Tail テールの含まれる DNA の割合 %DNAT = 100 × IT / IC Tail Moment MT = %DNAT × LT Olive Moment [ Head の中心からの距離 ] × IC ( x , y ) / IC
3.4 統計解析
各条件に対して 200 個前後の画像を得る。得たコメット画像を解析しそれぞれのパラメータ の平均値とその比、またヒストグラムを作成した。 統計解析には Wilcoxon の順位和検定を用いて、有意差かどうかをした。データの分 布形態を問わずに使うことができることによりWilcoxon に順位和検定を用いた。有意性 を表すP 値が < 0.05 の時、有意な差であると決定した。 また、その実験の正当性を評価するために同じ細胞種の DNA の量に違いはないと考え、Comet Intensity （IC = Σ IC ( x , y )）の平均値の統計解析を行い有意差がなく Comet
第
4 章 結果
4.1 過酸化水素を用いたポジティブコントロール実験
行ったコメットアッセイのプロトコルに問題がないことを示すために、強いDNA 切 断作用のある過酸化水素100μM で細胞を 10 分間処理した後、コメットアッセイを行 った。図 28 はポジティブコントロールの実験で得たコメットの画像である。過酸化水 素で処理したDNA は損傷が激しく、テイルが通常培養したコントロールに比べて広い 範囲に渡って分布が観察された。また平均値（表 3）、その比（図 29）、ヒストグラム （図 30）でも過酸化水素処理したサンプルはコントロールを上回る値を取り、その差 は有意であった。尚、ポジティブコントロールの実験は2 回行い、同様の結果が得られ ている。 日付:12/11/02 図 28 ポジティブコントロールのコメット画像 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 通常培養 161.5 15493.0 611548.8 33.3 66.8 114.9 67.9 H2O2 329.3 32032.6 2703738 84.8 93.1 309.0 153.4P 値 9.96E-11 1.90E-09 7.52E-10 2.74E-09 6.22E-07 1.63E-10 5.49E-10
コントロール
表 3 ポジティブコントロール（日付:12/11/02）実験結果 0 0.51 1.52 2.53 3.54 4.55 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 通常培養 過酸化水素 図 29 ポジティブコントロール（日付:12/11/02）のパラメータ平均値比 **は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 0 10 20 30 40 50 60 0 80 160 240 320 400 480 560 640 720 800 通常培養 過酸化水素水 Tail Area 0 5 10 15 20 25 30 35 0 6000 12000 18000 24000 30000 36000 42000 48000 54000 60000 通常培養 過酸化水素水 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 4800 00 9600 00 1440 000 1920 000 2400 000 2880 000 3360 000 3840 000 4320 000 4800 000 通常培養 過酸化水素水
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 25 30 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 通常培養 過酸化水素水 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 60 通常培養 過酸化水素水 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 通常培養 過酸化水素水
**
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磁
場
曝
露
**
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磁
場
曝
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磁
場
曝
露
4.2 非曝露サンプルを用いたネガティブコントロール実験
4.1 と同様にコメットアッセイのプロトコルの正当性を評価するため、非曝露用コイ ル内で培養した二つのサンプルについてコメットアッセイを行った。図は得られた画像 である。両サンプルとも同様に損傷が少ない結果が得られ、パラメータの平均値（表4） やその比（図 32）またヒストグラム（図 33）でも似た傾向を示し有意差はなかった。 ポジティブコントロールの結果と合わせることで行った実験とコメットアッセイは信 頼できるものであるとした。尚、ネガティブコントロールの実験は2 回行い、同様の結 果が得られている。 図 31 ネガティブコントロールのコメットアッセイ 日付:12/06/30 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露1 25.3 1180.7 59687.4 49.5 8.6 3.4 2.7 非曝露2 20.0 981.8 56380.7 59.5 8.4 2.7 2.5 P 値 0.3736 0.8872 0.7884 0.2027 0.817 0.9922 0.8608 表 4 ネガティブコントロール（日付:12/06/30）の実験結果 非曝露1
非曝露20 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露1 非曝露2 図 32 ネガティブコントロール（日付:12/06/30）のパラメータ平均値比 Tail Length (px) 0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露1 非曝露2 Tial Area 0 5 10 15 20 25 30 35 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 非曝露1 非曝露2 Tail Intensity 0 10 20 30 40 50 0 3000 0 6000 0 9000 0 1200 00 1500 00 1800 00 2100 00 2400 00 2700 00 3000 00 非曝露1 非曝露2
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 25 30 35 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 非曝露1 非曝露2 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 非曝露1 非曝露2 Tail Moment 0 10 20 30 40 50 60 0 3.2 6.4 9.6 12.8 16 19.2 22.4 25.6 28.8 32 非曝露1 非曝露2 Olive Moment
4.3 連続波形磁場曝露実験
連続波形の磁場曝露実験結果を示す。代表的なものにはヒストグラムも掲載した。4.3.1 50Hz、連続 sin 波、100μT
連続波形磁場で強度が100μT のときに磁場曝露を行った実験結果を示す。 18 時間曝露 日付:12/04/02 Tail Length 以外のパラメータに有意な差はなかった。ヒストグラムの形からも曝露 群と非曝露群の間で差がなかったことが見て取れる。Tail Length のみ p = 0.016 であ り有意な差があった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 338.0 37089.1 501787.9 13.9 29.2 108.3 41.9 曝露 370.6 41242.0 610381.9 15.3 32.7 131.0 51.0 P 値 0.0169 0.3067 0.1717 0.3077 0.1816 0.0616 0.2350 表 5 100μT 連続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/04/02）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 34 100μT 連続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/04/02）のパラメータ平均値比 *は p < 0.05 を表す*
磁
場
曝
露
Tail Length (px) 0 5 10 15 20 0 54 108 162 216 270 324 378 432 486 540 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 0 1400 0 2800 0 4200 0 5600 0 7000 0 8400 0 9800 0 1120 00 1260 00 1400 00 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 30 0 3000 00 6000 00 9000 00 1200 000 1500 000 1800 000 2100 000 2400 000 2700 000 3000 000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 25 30 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 5 10 15 20 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 非曝露 曝露 Tail Moment 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 46 92 138 184 230 276 322 368 414 460 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 5 10 15 20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 非曝露 曝露 図 35 100μT 連続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/04/02）のヒストグラム 22 時間曝露 日付:12/05/21
Tail Mean Intensity 以外のパラメータについて曝露群が非曝露群を有意に上回っ た。Tail Mean Intensity（μI = IT / AT）のみ優位差がなかったのは、曝露群のテイル
がより広い範囲に分布したことに起因すると考えられる。
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 36 100μT 連続波形磁場 22 時間曝露（日付:12/05/21）の平均値比 **は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 次 の 級 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 25 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 17000 18000 19000 20000 次 の 級 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 30 0 8000 0 1600 00 2400 00 3200 00 4000 00 4800 00 5600 00 6400 00 7200 00 8000 00 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 次 の 級 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 5 10 15 20 0 2. 5 5 7. 5 10 12 .5 15 17 .5 20 22 .5 25 27 .5 30 32 .5 35 37 .5 40 42 .5 45 47 .5 50 次 の 級 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 次 の 級 非曝露 曝露 Olive Moment 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 次 の 級 非曝露 曝露 図 37 100μT 連続波形磁場 22 時間曝露（日付:12/05/21）のヒストグラム
**
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磁
場
曝
露
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場
曝
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場
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曝
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磁
場
曝
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磁
場
曝
露
48 時間曝露 日付:12/02/29 連続波形磁場の48 時間曝露では両群間に有意差はなかった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 191.4 11720.5 183442.6 21.4 18.8 43.6 14.0 曝露 180.9 11433.9 196891.9 22.1 19.4 41.4 14.2 P 値 0.3640 0.8117 0.9692 0.4167 0.5385 0.9148 0.8764 表 7 100μT 連続波形磁場 48 時間曝露（日付:12/02/29）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 38 100μT 連続波形磁場 48 時間曝露（日付:12/02/29）の平均値比 Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 22 44 66 88 110 132 154 176 198 220 242 264 286 308 330 352 374 396 418 440 次 の 級 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 30000 32000 34000 36000 38000 40000 次 の 級 非曝露 曝露
%DNA in Tail 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 次の 級 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 次の 級 非曝露 曝露 Olive Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 次の 級 非曝露 曝露 図 39 100μT 連続波形磁場 48 時間曝露（日付:12/02/29）のヒストグラム
4.3.2 50Hz、連続 sin 波、500μT
18 時間曝露 日付:12/10/20連続波形、500μT、18 時間曝露では Tail Length、Tail Area、%DNA in Tail、Tail Moment の 4 つが 2 群間で有意差があった。平均値とヒストグラムから%DNA in Tail の値が両群とも高い値を取ることがわかる。非曝露群でもテイルが長く出たことがわか る。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 518.2 107625.4 9052313.5 80.8 88.0 466.6 201.4 曝露 538.9 116431.2 9780532.7 80.1 90.4 500.9 213.6 P 値 0.0408 0.01716 0.1172 0.6047 0.0149 0.0337 0.2949 表 8 100μT 連続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/10/20）の実験結果
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 40 100μT 連続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/10/20）の平均値比 *は p < 0.05 を表す Tail Length (px) 0 5 10 15 20 25 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 0 2400 0 4800 0 7200 0 9600 0 1200 00 1440 00 1680 00 1920 00 2160 00 2400 00 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2000 000 4000 000 6000 000 8000 000 1000 0000 1200 0000 1400 0000 1600 0000 1800 0000 2000 0000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 25 30 0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 0 90 180 270 360 450 540 630 720 810 900 非曝露 曝露
*
磁
場
曝
露
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磁
場
曝
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磁
場
曝
露
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磁
場
曝
露
20 時間曝露 日付:12/10/18
Tail Mean Intensity、%DNA in Tail は両群間に有意差があった。Tail Length と Tail Area の値に有意差がないことからテイルの大きさは同じである。テイルの DNA の量 は曝露群の方が多いことがわかる。非曝露群でのDNA 一本鎖損傷と同じ大きさの断片 がより多く電気泳動でテイルとして流れたと考えられる。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 461.1 82861.8 5830858.3 67.3 83.8 405.8 198.5 曝露 429.8 81717.2 6330535.4 74.3 86.5 384.6 211.4 P 値 0.0919 0.6508 0.17 0.005261 0.0022 0.3065 0.1183 表 9 100μT 連続波形磁場 20 時間曝露（日付:12/10/18）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 42 100μT 連続波形磁場 20 時間曝露（日付:12/10/18）の平均値比 *は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 0 5 10 15 20 25 30 0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 25 0 2000 0 4000 0 6000 0 8000 0 1000 00 1200 00 1400 00 1600 00 1800 00 2000 00 非曝露 曝露
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磁
場
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Tail Intensity 0 2 4 6 8 10 12 14 0 1600 000 3200 000 4800 000 6400 000 8000 000 9600 000 1120 0000 1280 0000 1440 0000 1600 0000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 0 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 非曝露 曝露 図 43 100μT 連続波形磁場 20 時間曝露（日付:12/10/18）のヒストグラム 24 時間曝露 日付:12/12/25
Tail Intensity、Tail Mean Intensity、%DNA in Tail、Olive Moment は両群間に有 意差があった。Tail Intensity、Tail Mean Intensity では大小関係が逆転していること がわかる。有意差はないがテイルの大きさも非曝露群の方が大きい。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 212.3 25184.7 376084.9 13.7 20.8 51.5 26.7 曝露 205.2 23873.7 347648.5 14.2 20.0 46.8 25.4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 44 100μT 連続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/12/25）の平均値比 *は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 0 34 68 102 136 170 204 238 272 306 340 非曝露 曝露 Tail Area 0 2 4 6 8 10 12 0 5600 11200 1680 0 2240 0 2800 0 3360 0 3920 0 4480 0 5040 0 5600 0 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 0 2000 00 4000 00 6000 00 8000 00 1000 000 1200 000 1400 000 1600 000 1800 000 2000 000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 2 4 6 8 10 12 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 2 4 6 8 10 12 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 非曝露 曝露 図 45 100μT 連続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/12/25）の平均値比
**
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場
曝
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場
曝
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曝
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4.3.3 50Hz、連続 sin 波、1000μT
15 時間曝露 日付:12/11/04 連続波形磁場の15 時間曝露では両群間で有意差はなかった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity にTail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 327.5 60625.5 3718543.2 53.0 73.0 255.3 152.3 曝露 337.6 66798.9 4030834.5 52.5 75.2 270.5 155.5 P 値 0.5367 0.04919 0.4477 0.9497 0.4549 0.4586 0.7725 表 11 1000μT 連続波形磁場 30 時間曝露（日付:12/11/04）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 46 1000μT 連続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/11/06）の平均値比 *は p < 0.05 を表す*
磁
場
曝
露
Tail Intensity 0 5 10 15 20 0 1200 000 2400 000 3600 000 4800 000 6000 000 7200 000 8400 000 9600 000 1080 0000 1200 0000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 非曝露 曝露 ％DNA in Tail 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 0 80 160 240 320 400 480 560 640 720 800 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 2 4 6 8 10 12 14 0 34 68 102 136 170 204 238 272 306 340 非曝露 曝露 図 47 1000μT 連続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/11/06）のヒストグラム
4.4 断続波形磁場曝露実験
Sin 波で 5 分 on で 10 分 off として、それぞれの曝露条件で磁場を曝露した。4.4.1 50Hz、断続 sin 波、100μT
15 時間曝露 日付:12/07/18 断続波形磁場の15 時間曝露では両群間に有意差はなかった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 10.4 480.0 16759.8 53.1 7.7 1.2 1.4 曝露 8.6 397.1 15487.5 47.7 6.8 1.2 1.3 P 値 0.6353 0.4074 0.5387 0.8838 0.7085 0.9793 0.2084 表 12 100μT 断続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/07/18）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2Tail Tail Area Tail Tail %DNA in Tail Olive
非曝露 曝露
Tail Length (px) 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 非曝露 曝露 Tail Area 0 10 20 30 40 50 0 320 640 960 1280 1600 1920 2240 2560 2880 3200 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 10 20 30 40 50 60 0 1600 0 3200 0 4800 0 6400 0 8000 0 9600 0 1120 00 1280 00 1440 00 1600 00 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 10 20 30 40 50 60 70 0 70 140 210 280 350 420 490 560 630 700 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 0 4.4 8.8 13.2 17.6 22 26.4 30.8 35.2 39.6 44 非曝露 曝露 Tail Moment 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2.2 4.4 6.6 8.8 11 13.2 15.4 17.6 19.8 22 非曝露 曝露 Olive Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 非曝露 曝露 図 49 100μT 断続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/07/18） 18 時間曝露 日付:12/06/09 断続波形磁場の18 時間曝露では両群間に有意差はなかった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 16.3 1133.8 66231.5 57.9 9.0 2.3 2.7 曝露 17.5 1181.4 69731.6 55.4 8.2 2.9 2.8 P 値 0.6324 0.4701 0.5841 0.6705 0.4556 0.2318 0.5873 表 13 100μT 断続波形磁場 16 時間曝露（日付:12/06/09）の実験結果
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 50 100μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/06/09）の平均値比 Tail Length (px) 0 5 10 15 20 25 30 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 次 の 級 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 25 30 35 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 3300 3600 3900 4200 4500 4800 5100 5400 5700 6000 次 の 級 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 3000 0 6000 0 9000 0 1200 00 1500 00 1800 00 2100 00 2400 00 2700 00 3000 00 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 10 20 30 40 50 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540 570 600 次 の 級 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 非曝露 曝露 Tail Moment 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 次 の 級 非曝露 曝露
4.4.2 50Hz、断続 sin 波、500μT
1 時間曝露 日付:12/09/21 断続波形磁場の1 時間曝露では両群間に有意差はなかった。1 時間曝露は細胞に影響 を与えることはなく非曝露と同様の結果が得られたと考えられる。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 106.3 10121.2 252341.6 31.3 12.9 18.1 10.5 曝露 114.1 10392.3 232426.7 26.7 13.8 19.3 10.2 P 値 0.0620 0.2495 0.749 0.2048 0.1700 0.1111 0.3900 表 14 500μT 断続波形磁場 1 時間曝露（日付:12/09/21）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 52 500μT 断続波形磁場 1 時間曝露（日付:12/09/21）の平均値比 Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 0 26 52 78 104 130 156 182 208 234 260 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 0 4000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 32000 36000 40000 非曝露 曝露Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 30 0 2000 00 4000 00 6000 00 8000 00 1000 000 1200 000 1400 000 1600 000 1800 000 2000 000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 2 4 6 8 10 12 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 非曝露 曝露 図 53 500μT 断続波形磁場 1 時間曝露（日付:12/09/21）のヒストグラム 15 時間曝露 日付:12/09/11
Tail Area、Tail Intensity は両群間に有意差があった。全体的に曝露群の方が非曝露 群に対して大きな値をとった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 155.6 13315.0 180324.9 18.9 11.6 23.6 11.7 曝露 170.5 15647.1 251442.9 17.7 13.3 29.1 14.2 P 値 0.1129 0.0425 0.006217 0.3821 0.1573 0.0750 0.1426
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 54 500μT 断続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/09/11）の平均値比 *は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 0 36 72 108 144 180 216 252 288 324 360 非曝露 曝露 Tail Area 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 4000 8000 12000 1600 0 2000 0 2400 0 2800 0 3200 0 3600 0 4000 0 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 6000 0 1200 00 1800 00 2400 00 3000 00 3600 00 4200 00 4800 00 5400 00 6000 00 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 2 4 6 8 10 12 14 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 図 55 500μT 断続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/09/11）のヒストグラム
*
磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
18 時間曝露 日付:12/09/05
Tail Length 以外のパラメータに関して両群間に有意差があった。Tail Mean Intensity
（μI = IT / AT）の値のみ大小関係が逆転した。テイルの大きさが曝露群の方が大きかった ことに起因すると考えられる。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 122.8 7559.9 81564.2 33.2 9.1 16.2 7.5 曝露 132.9 10379.8 184118.5 21.8 15.8 26.9 13.3 P 値 0.0607 2.16E-06 < 2.2e-16 2.51E-13 2.63E-15 9.52E-9 2.76E-11
表 16 500μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/09/05）の実験結果 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 56 500μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/09/05）の平均値比 *は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 10 15 20 25 非曝露 曝露 Tail Area 20 30 40 50 非曝露 曝露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
%DNA in Tail 0 5 10 15 20 25 30 35 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 非曝露 曝露 Tail Mement 0 10 20 30 40 50 0 16 32 48 64 80 96 112 128 144 160 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 10 20 30 40 50 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 非曝露 曝露 図 57 500μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/09/05）のヒストグラム 24 時間曝露 日付:12/09/06
Tail Mean Intensity 以外のパラメータで両群間に有意差があった。ヒストグラムからテ
イルが出ていないDNA もあるようである。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 109.1 9435.5 168738.8 22.6 11.4 17.5 10.6 曝露 142.5 12047.4 218408.9 21.8 14.4 26.7 13.7 P 値 7.45E-6 0.000768 0.004397 0.8443 0.0032 0.0001 0.0008 表 17 500μT 断続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/09/06）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.81 1.2 1.4 1.6 1.8 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 58 500μT 断続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/09/06）の平均値 **は p < 0.01 を表す
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 25 30 0 4000 8000 12000 1600 0 2000 0 2400 0 2800 0 3200 0 3600 0 4000 0 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 30 0 1000 00 2000 00 3000 00 4000 00 5000 00 6000 00 7000 00 8000 00 9000 00 1000 000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 10 20 30 40 50 0 26 52 78 104 130 156 182 208 234 260 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 非曝露 曝露 Tail Moment 0 10 20 30 40 50 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 5 10 15 20 25 30 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 非曝露 曝露 図 59 500μT 断続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/09/06）のヒストグラム
4.4.3 50Hz、断続 sin 波、1000μT
15 時間曝露 日付:12/12/140 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 60 1000μT 断続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/12/14）の平均値比 Tail Length (px) 0 2 4 6 8 10 12 14 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 非曝露 曝露 Tail Area 0 10 20 30 40 50 60 0 3400 6800 10200 1360 0 1700 0 2040 0 2380 0 2720 0 3060 0 3400 0 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 5 10 15 20 25 0 6600 0 1320 00 1980 00 2640 00 3300 00 3960 00 4620 00 5280 00 5940 00 6600 00 非曝露 曝露
Tail Mean Intensiｔｙ
0 10 20 30 40 50 60 70 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 5 10 15 20 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 5 10 15 20 25 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 非曝露 曝露 図 61 1000μT 断続波形磁場 15 時間曝露（日付:12/12/14）のヒストグラム
18 時間曝露 日付:12/ 12/07 全てのパラメータにおいて両群間に有意差があった。非曝露群にもテイルが出ているこ とがわかる。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 276.9 70316.3 4098201.7 55.9 77.6 224.5 136.6 曝露 329.8 83549.5 5529948.6 65.0 82.3 281.0 159.3 P 値 1.93E-09 3.50E-06 4.48E-08 6.72E-05 2.39E-06 1.45E-09 7.52E-09
表 19 1000μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/12/07）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 62 1000μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/12/07）の平均値比 **は p < 0.01 を表す Tail Length (px) 0 5 10 15 20 25 30 35 非曝露 曝露 Tail Area 0 5 10 15 20 25 30 非曝露 曝露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
**
*磁
場
曝
露
%DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 30 0 80 160 240 320 400 480 560 640 720 800 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 5 10 15 20 25 30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 非曝露 曝露 図 63 1000μT 断続波形磁場 18 時間曝露（日付:12/12/07）のヒストグラム 24 時間曝露 日付:12/11/30 24 時間断続波形磁場曝露では両群間には有意差はなかった。テイルは大きかったことが Tail Length、Tail Area のパラメータからわかる。この条件（1000μT 断続波形磁場 24 時
間曝露）は2 回実験を行い 2 回とも全てのパラメータに有意差はなかった。 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 306.7 74727.6 4876297.6 64.6 82.8 261.3 149.2 曝露 296.1 74419.4 5084761.5 68.6 82.1 249.8 144.0 P 値 0.494 0.9916 0.3241 0.3241 0.06169 0.5168 0.3297 表 20 1000μT 断続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/11/30）の実験結果 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Tail Length (px) Tail Area (px) Tail Intensity Tail Mean Intensity %DNA in Tail Tail Moment Olive Moment 非曝露 曝露 図 64 1000μT 断続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/11/30）の平均値比
Tail Length (px) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 70 140 210 280 350 420 490 560 630 700 非曝露 曝露 0 5 10 15 20 25 30 0 1800 0 3600 0 5400 0 7200 0 9000 0 1080 00 1260 00 1440 00 1620 00 1800 00 非曝露 曝露 Tail Intensity 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 1000 000 2000 000 3000 000 4000 000 5000 000 6000 000 7000 000 8000 000 9000 000 1000 0000 非曝露 曝露
Tail Mean Intensity
0 2 4 6 8 10 12 14 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 非曝露 曝露 %DNA in Tail 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 非曝露 曝露 Tail Moment 0 5 10 15 20 25 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 非曝露 曝露 Olieve Moment 0 5 10 15 20 25 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 非曝露 曝露 図 65 1000μT 断続波形磁場 24 時間曝露（日付:12/11/30）のヒストグラム
4.5 時間による平均値比較
それぞれ求めた結果を時間毎にまとめる。パラメータの中でもTail Length、Tail Area、
Tail Moment について示した。
4.5.1 Tail Length (px)の時間による比較
連続波形100μT 0 50 100 150 200 250 300 350 400 18 18 22 48 時間 T ai l L en gt h (p x) 非曝露 曝露図 66 時間における比較（Tail Length (px)）
*は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す 連続波形500μT 0 100 200 300 400 500 600 18 20 24 時間 T ai l L en gt h (p x) 非曝露 曝露 図 67 時間による比較（Tail Length (px)） *は p < 0.05 を表す*
磁
場
曝
露
*
磁
場
曝
露
**
磁
場
曝
露
連続波形1000μT 0 50 100 150 200 250 300 350 400 15 時間 Ta il Le n gt h (p x) 非曝露 曝露 図 68 時間による比較（Tail Length (px)） 断続波形100μT 0 10 20 30 40 50 60 70 15 15 18 時間 T ai l L en gt h (p x) 非曝露 曝露 図 69 時間による比較（Tail Length (px)） 断続波形500μT 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1 15 18 24 時間 T ai l L en gt h (p x) 非曝露 曝露
**
磁
断続波形1000μT 0 50 100 150 200 250 300 350 15 18 24 24 時間 T ai l L en gt h (p x) 非曝露 曝露 図 71 時間による比較（Tail Length (px)） **は p < 0.01 を表す
4.5.2
Tail Area (px)の時間による比較
連続波形100μT 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 18 18 22 48 時間 T ai l A re a (p x) ×10 3 非曝露 曝露 図 72 時間による比較（Tail Area (px)） *は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す**
磁
場
曝
露
*
磁
場
曝
露
**
磁
場
曝
露
連続波形
500μT
0 2 4 6 8 10 12 14 18 20 24 時間 T ai l A re a (p x) ×10 4 非曝露 曝露 図 73 時間による比較（Tail Area (px)） *は p < 0.05 を表す 連続波形1000μT 0 10 20 30 40 50 60 70 80 15 時間 Ta il A re a (p x) × 10 3 非曝露 曝露 図 74 時間による比較（Tail Area (px)） *は p < 0.05 を表す 断続波形100μT 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 T ai l A re a 非曝露 曝露*
磁
場
曝
露
*
磁
場
曝
露
断続波形
500μT
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 15 18 24 時間 T ai l A re a (p x) ×10 3 非曝露 曝露 図 76 時間による比較（Tail Area (px)） *は p < 0.05、**は p < 0.01 を表す断続波形
1000μT
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 15 18 24 24 時間 T ai l A re a (p x) ×10 3 非曝露 曝露 図 77 時間による比較（Tail Area (px)） **は p < 0.01 を表す**
磁
場
曝
露
**
磁
場
曝
露
**
磁
場
曝
露
*
磁
場
曝
露
4.5.3
Tail Moment の時間による比較
連続波形
100μT
0 20 40 60 80 100 120 140 18 18 22 48 時間 T ai l M om en t 非曝露 曝露 図 78 時間による比較（Tail Moment） **は p < 0.01 を表す 連続波形500μT 0 100 200 300 400 500 600 18 20 24 時間 T ai l M om en t 非曝露 曝露 図 79 時間による比較（Tail Moment） *は p < 0.05 を表す 連続波形1000μT 250 300 t**
磁
場
曝
露
*
磁
場
曝
露
断続波形100μT 0 2 4 6 8 10 12 14 16 15 15 18 時間 T ai l M om en t 非曝露 曝露 図 81 時間による比較（Tail Moment） 断続波形500μT 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 1 15 18 24 時間 T ai l M om en t 非曝露 曝露 図 82 時間による比較（Tail Moment） **は p < 0.01 を表す 断続波形1000μT 0 50 100 150 200 250 300 15 18 24 24 時間 T ai l M om en t 非曝露 曝露 図 83 時間による比較（Tail Moment） **は p < 0.01 を表す
![図 6 Ivencsits,S.et al による先行研究[2005]](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123deta/5889477.1047795/11.892.239.644.155.483/図6IvencsitsSetalによる先行研究25.webp)
![図 8 コメットアッセイ （http://www.jniosh.go.jp/publication/JOSH/pdf/vol3no1/Vol03No1-07a.pdf） 2.3 メリットコイル 磁場の印加にはメリットコイルを用いた。このコイルは Merritt らによって開発され たもの [1]を基本としている。メリットコイルは四角形のコイルを 4 つ連ねて構成され ている。 （ 図 10） 各コイルはエナメル線で 2 重に巻かれており、それぞれのコイルの巻 き数は、上から 1 段目・ 4 段](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123deta/5889477.1047795/13.892.151.758.144.470/コメットアッセイメリットコイルメリットコイルメリットコイル.webp)
![図 9 メリットコイル概略図 図 10 メリットコイル内二重配線の概略図 2.3.1 メリットコイルの磁場 メリットコイルの磁場の大きさは Bio - Savart の法則から導いた下の式を求めるこ とができる。[11] B z (z )= ∑ i =14 2 √ 2 μ 0 N i / π d π d (1+ 4 ( z− z i ) 2 d 2 ) √ 1+ 2( z−zd2 i ) 2 i はコイルの上から数えた番号、コイルの巻き数を N、コイルの幅を d、コイルの中 心を原点と](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123deta/5889477.1047795/14.892.151.699.149.625/メリットコイルメリットコイルメリットコイルメリットコイル.webp)
