Title
Development of an Evaluation System on Brain Retardation by
Developmental Exposure to Chemicals Based on the Mechanism
to Impair Neuronal Differentiation( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
三枝, 由紀恵
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 甲第302号
Issue Date
2010-03-15
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/33614
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氏名(本(国)籍) 主 指 導 教 員 名 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 三 枝 由紀恵(東京都) 東京農工大学 教授 三 博士(獣医) 獣医博甲第302号 平成22年3月15日 学位規則第3条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 東京農工大学 森 国 敏
Development of an Evaluation System on Brain
Retardation by DevelopmentalExposure to Chemicals Based on the Mechanism toImpair Neuronal
Differentiation (細胞分化機構の障害性に着目した化学物質の発達期暴 露による脳発達障害評価手法の開発) 主査 東京農工大学 教 授 副査 帯広畜産大学 教 授 副査 岩 手 大 学 教 授 副査 東京農工大学 教 授 副査 岐阜 大 学 教 授 善 峯 助 敏 磨 一高 幸 国 徳 谷 井 田 森 井 田 松 岡 三 柳 論 文 の 内 容 の
要
旨 本研究は,発達期甲状腺機能低下による脳発達障害に着目した｡抗甲状腺剤を陽性対照に神経発 達に関与する鋭敏なエンドポイントに基づく評価系の確立を目的とし,弱い抗甲状腺作用を有する臭素化難燃剤(BFR5)暴露例のニューロン発達障害影響を解析･評価した｡
第一に,BFRsであるテトラブロモビスフェノールA(TBBPA)及びヘキサブロモシクロドデカ ン(HBCD)を発達期暴露した際の毒性影響を,脳発達障害の形態計測手法を導入して検討した｡雌SD:IGSラットに妊娠16日から離乳時(生後20日)までTBBPA及びHBCDを各々100,l,000,
10,000ppmの用量で混餌投与した｡その結果,TBBPに明らかな甲状腺機能低下作用及び脳発達影 響は認めなかった｡一方,HBCDでは生後20日に高用量で,ll週では中間用址以上で弱い甲状腺 機能低下がみられ,高用量で発達期甲状腺機能低下の反映を示唆する白質低形成を認めた｡ 第二に,発達期甲状腺機能低下を介した脳発達障害によるニューロン分化の障害指標遺伝子探索 を目的とし,抗甲状腺剤のプロピルチオウラシル(m)及びメチマゾール(MMI)を発達期暴露 した生後20日の雄ラットの脳海馬CAl領域特異的な網羅的辿伝子発現解析を行った｡両物質の投 与により,海馬CAl領域の錐体細胞層に細胞移動異常を反映するニューロンのバラツキの発生を 既に報告している｡マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析の結果をもとに,E丘l虚の受容 体であるEphA5とIbchykininreceplor3(Tbcr3)の2分子について免疫組織学的に検討した結果,生後20日に海馬CAl領域にEphA5及びTbcr3強陽性細胞を認めた｡また,11週では発現程度は低 下したものの職cr3陽性細胞は持続的に発現し,これは持続するニューロンの移動異常影響に対す る神経保護作用を反映する結果と考えられた｡ さらに,PTU投与群で発現変動がみられたReelin分子について検討した｡Reelinは甲状腺ホルモ ン調節遺伝子であり,ニューロンの移動や位置情報を決定する分子である｡Reeli11の分布を海馬歯 状回門(ニューロン新生部位)に着目して,抗甲状腺剤投与ラットの生後20日及び‖週で免疫組 織学的に検討した結果,鮎el山陽性細胞は11週まで有意に増加した｡陽性細胞の特性を検討した結 果,増加したReelin陽性細胞はGABA性介在ニューロンと判断された｡また,11週では成熟ニュ ーロンのマーカーであるNeuN陽性細胞の増加を同部位で認めたが,ReelinとNedNの二重染色の 結果,Reelin陽性細胞はNeuNに弱陽性あるいは陰性を示し,未熟なニューロンの可能性が示唆さ れた｡さらに,歯状回のニューロン新生部位である顆粒細胞層下領域では,生後20日にアポトー シス小体の増加と増殖細胞の減少がみられ,ニューロン新生障害の可能性が示唆された｡以上の結 果,発達期甲状腺機能低下は歯状回門にReelinを産生する未熟GABAニューロンの永続的増加を 生じ,これはニューロン新生障害と細胞移動異常が成熟後まで持続することを示唆する変化と考え られた｡ 第三に,上記3分子を用いて,3種のBFRs(デカブロモジフェニルエーテル(DBDE),TBBPA 及びHBCD)曝露例における脳発達障害影響の検出を試みた｡子動物の脳サンプルは,TBBPA及 びHBCDでは第1章のものを,DBDEでは10,100,1,000ppmのラット発達期暴露により得たも のを使用した｡DBDEは軽度な甲状腺機能低下作用を認めた｡いずれのBFRでも,Reelin陽性細胞 は歯状回門で生後20日でのみ低用量あるいは中間用量から有意な増加を認めたが,NeuN陽性細胞 は11週で中間用量あるいは高用量から有意に増加した｡生後20日目に,EphA5はDBDEの高用量 で海馬CAl領域に陽性細胞数の増加を認めたが,職cr3はいずれのBFRでも変化を認めなかった｡ また,歯状回の顆粒細胞層下領域では,TBBPA及びHBCDの高用量でアポトーシス′ト体の増加に よるニューロン新生障害が示唆された｡以上の結果,BFR5の発達期暴露により,低用量あるいは 中間用量から細胞移動異常を示唆する発達期神経毒性作用を海馬歯状回あるいはCAl領域で認め た｡また,11週の海馬歯状回門でNeuN陽性細胞は増加を示したものの,Reelin産生を持続してお らず,その生物学的意義の解明は今後の課題であるが,成熟後では発達障害が持続していないと考 えられた｡ 以上のように,抗甲状腺剤及びBFRsを用いて海馬におけるニューロンの発達関連分子を見出し, これらの分子の免疫組織学的検索により,ニューロンの発達遅延を基盤とした発達神経毒物の鋭敏 な評価系を確立した｡特に,歯状回門におけるReeIin陽性細胞の分布異常は,その時点における不 可逆的なニューロン新生障害及び移動異常の可能性を示唆し,これらの発達異常の鋭敏な指標とな る可能性が示唆された｡今回の研究成果は,環境中にある神経毒性物質の検出の一助となるものと 思われた｡ 審 査 結 果 の
要
旨 本研究は,発達期甲状腺機能低下による脳発達障害に着目した｡抗甲状腺剤を陽性対照に神経 発達に関与する鋭敏なエンドポイントに基づく評価系の確立を目的とし,弱い抗甲状腺作用を有 する臭素化難燃剤(BFRs)暴露例のニューロン発達障害影響を解析･評価した｡ 第l章では,BFRsであるテトラブロモビスフェノールA(TBBPA)及びヘキサブロモシクロ ドデカン(HBCD)を発達期暴露した際の毒性影響を,脳発達障害の形態計測手法を導入して検 討した｡その結果,TBBPAに脳発達障害はみられなかったが,HBCDでは発達期甲状腺機能低 下の反映を示唆した白質低形成を認めた｡第2章一1では,発達期甲状腺機能低下を介した脳発達障害によるニューロン分化の障害指標 遺伝子探索を目的とし,抗甲状腺剤のプロピルチオクラシル(PTU)及びメチマゾール(MMI) を発達期暴露した際の脳海馬CAl領域特異的な遺伝子発現解析を行った｡その結果,E血a5の 受容体であるEphA5とThchykinin receptor3(Tbcr3)の2分子を見出し,免疫染色により海馬 CAl領域に陽性細胞の分布を確認した｡また,Tbcr3は成熟期まで持続的な発現を認め,これは 持続するニューロンの移動異常影響に対する神経保護作用を反映する結果と考えられた｡ 第2章一2では,遺伝子発現解析の結見PTU投与群で発現変動がみられたReelin分子の発現 変動を検討した｡その結見 甲状腺機能低下により,海馬歯状回門(ニューロン新生部位)で Reelinを産生する未熟GABAニューロンの永続的増加を生じ,これはニューロン新生障害と細 胞移動異常が成熟後まで持続することを示唆する変化と考えられた｡ 第3章では,上記3分子を用いて,3種のBFRs(デカブロモジフェニルエーテル(DBDE), TBBPA及びHBCD)曝露例におけるニューロン発達障害影響の検出を試みた｡その結見 いず れのBFRでも低用量あるいは中間用量から細胞移動異常を示唆する発達期神経毒性作用を海馬 歯状回あるいはCAl領域で認めたが,成熟後までの永続性は認めなかった｡ 以上の結果から,抗甲状腺剤及びBFRsを用いて海馬におけるニューロンの発達関連分子を 見出し,ニューロンの発達障害を基盤とした発達神経毒物の鋭敏な評価系を確立した｡本研究成 果は,環境中にある神経毒性物質の検出の一助となるものと思われた｡ 以上について,審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論文とし て十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1) 題 目 DevelopmentaltoxicityOfbrominated8ameretardants,tetrabromobisphenoIA andl,2,5,6,9,10-hexabromocyclododecane,)nratOffgpringa負ermaternal exposurefrommid-geStationthroughlactation 著 者 名:Saegusa,Y.,Fttjimoto,H.,Woo,G-H.,lnoue,K.,Takahashi,M.,Mitsumori,K., Hirose,･M.,Nishikawa,A.andShibutani,M. 学術雑誌名:ReproductiveToxicology 巻･号･貢･発行年:2S(4):456-467,2009 2)題 目:Geneexpressionprofilingandce11ulardistributionofmoleculeswithaltered expressioninthehippocampalCAlreglOnaRerdevelopmentalexposureto anti-thyroidagentsinrats 著 者 名:Saegusa,Y.,Woo,G-H･,Fqiimoto,H.,lnoue,K.,Takahashi,M･,Hirose,M･, Igarashi,K.,Kanno,J.,Mitsumori,K.,Nishikawa,A･aJldShibutaniM･ 学術雑誌名:TheJoumalofVeterinaryMedicalScience 巻･号･頁･発行年:InPress 既発表学術論文 1)題 目:β-Naphthonavoneenhancesoxidative$treSSreSpOnSeSandtheinductionof PreneOP]asticlesionsinadiethy]nitrosamine-initiatedhepatocarcinogenesis modeIinpartia‖yhepatectomizedrats 著 者 名:Dewa,Y,Nishimura,J.,Muguruma,M.,Jin,M.,Saegusa,Y,Okamura,T., 7bsaki,M.,Umemura,T.andMitsumori,K. 学術雑誌名:恥ⅩicoIo訂 巻･号･貢･発行年:244(2-3):179-189,2008 2) 題 目:PossibleinvoIvementofoxidativestressinfbno石brate-induced hepatocarcinogenesisinrats 著 者 名:Nishimura,J.,Dewa,Y.,Okamura,T.,Muguruma,M.Jin,M.,Saegusa,Y, Umemura,T.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology ト 巻･号･頁･発行年:82(9):64l-654,2008 3)題 目:Extremelyweaktumor-PrOmOtingeffbctoftroglitazoneonsplenic hemang10SarCOmaSinrasH2miceinducedbyurethan 著 者 名:Jin,M.,Matsumoto,S.,Dewa,Y.,Nishimura,J.,Saekusa,Y,Hasumi,K.and Mitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology
貢 ● 号 巻題 ) 4 ･発行年:82(10):77ト777,2008 目:Hepatocarcinogenicsusceptibilityofftno斤brateanditspossiblemechanismof carcinogenicityinatwo-StagehepatocarcinogenesismodelofrasH2mice 著 者 名:Kawai,M.,Jin,M.,Nishimura,J.,Dewa,Y.,Saegusa,Y･,Matsumoto,S･,Taniai, E.,Shibutani,M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:Tbxico】0gicPathology 巻･号･頁･発行年:36(7):950-957,2008 5)題 目:RoleofNrf2andoxidatjvestressonfho丘brate-inducedhepatocarcinogenesisin rats 著 者 名:Nishimura,J.,Dewa,Y.,Okamura,T.,Jin,M.,Saegusa,Y･,Kawai,M., Umemura,T.,Shibutani,M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ToxicologicalSciences 巻･号･貢･発行年:106(2):339-349,2008 6)題 目:HepatocarcinogenicsusceptibilityofrasH2micetotroglitazoneinatwo-Stage hepatocarcinogenesismodel 著 者
名:Jin,M.,Saekusa,Y,Dewa,Y,Nishimura,J.,Matsumoto,S.,Shibutani,M.,
Hasumi,K.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･貢･発行年:83(2):173-181,2009 7)題 目:Thresho]ddoseofpiperony)butoxidethatinducesreactiveoxygen SpeCies-medjatedhepatocarcinogenesisinrats 著 者 名:Muguruma,M.,Kawai,M.,Dewa,Y,Nishimura,J･,Saegusa,Y,Yasuno,H･,Jin, M.,Matsumoto,S.,Takabatake,M.,Arai,K.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ArchivesofToxicology 巻･号･貢･発行年:83(2):183-193,2009 8)題 目:Acasereportofacerebellarneuroblastomainap53nurlmutationmouse 著 者 名:Ago,K.,Shibutani,M.,Saegusa,Y.,Shima,T･,Taniai,E･andMitsumori,K･ 学術雑誌名:TheJournalofVeterinaryMedicalScience 巻･号･貢･発行年:71(3):345-347,2009 9)題 目‥ AssessThentofdevelopmentale能ctsofhypothyroidisminratsfromjnuteroand lactationexposuretoanti-thyroidagents 著 者 名:Shibulani,M.,Woo,G-H.,FLtjimoto,H.,Saegusa,Y.,Takahashi,M.,Inoue,K., Hirose,M.andNishikawa,A. 学術雑誌名:ReproductiveToxico]ogy 巻･号･貢･発行年:2g(3):297-307,2009 10)題 目:CrosstalkbetweenPTEN/Akt2andTGFPsignalinginvoIvingEGFreceptor down-regulationduringthetumorpromotionprocessfromtheearlystageinarat two-Stagehepatocarcinogenesismodel 著 者 名:Taniai,E.,Kawai,M.,Dewa,Y.,Nishimura,J.,Harada,T.,Saegusa,Y., Matsumoto,S.,Takahashi,M.,Mitsumori,K.andShibutani,M. 学術雑誌名:CancerScience 巻･号･貢･発行年:100(5):813-820,2009 11)題 目:InvoIvernentofoxidativestressinhepatocelluJartumor-PrOmOtingactjvityof oxftndazoleinrats 著 者 名:Dewa,Y.,Nishimura,J.,Muguruma,M.,Jin,M.,Kawai,M.,Saegusa,Y., Okamura,T.,Umemura,T.andMitsumori,K. 学術雑誌名:ArchjvesofToxico]ogy 巻･号･頁･発行年:83(5):503-5】1,2009 12)題 目:Mo]ecularexpressionana]ysisofP-Naphthonavone-inducedhepatocellular tumorsinrats 著 者 名:Dewa,Y.,Nishimura,J.,Jin,M.,Kawai,M.,Saegusa,Y.,Harada,T･,Shibutani, M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:TbxicologicPathology 巻･号･頁･発行年:37(4):446-455,ZOO9 13)題 目:ModincatiollOfdietarycopperlevelsontheearlystageoftumor-prOmOtionwith propylthiouracilinarattwo-Stagethyroidcarcinogenesismodel 著 者 名:Shima,T.,Nishimura,J.,Dewa,Y.,Saegusa,Y.,Matsumoto,S･,Kawai,M･,Harada,T.,Mitsumori,K.andShibutani,M. 学術雑誌名:Chemico-BiologicalInteractions 巻･号･貢･発行年:180(2):262-270,2009 14)題 目:InductionofliverpreneopJasticfbciinF344ratssubjectedto28-dayoral administrationofdiheptylphthalateanditsinvivogenotoxicpotentia】 著 者 名:Jin,M.,Dewa,Y.,Kawai,M.,Nishimura,J.,Saegusa,Y.,Kemmochi,S･,Harada, T.,Shibutani,M.andMitsumoriK. 学術雑誌名:Toxicology 巻･号･頁･発行年:264(1-2):16-25,2009 15)題 目:Mechanisticstudyonhepatocarcinogenesisofpiperonylbutoxideinmice 著 者 名:Kawai,M.,Saegusa,Y.,Jin,M.,Dewa,Y.,Nishimura,J,,Harada,T.,Shibutani, M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:TbxicologicPathology 巻･号･頁･発行年:37(6):76ト769,2009 16)題 目:Cytokeratin8n8isausefu1immunohistochemicalmarkerforhepatocellular prolifもrativelesionsinmice 著 者 名:Kawai,LM.,Saegusa,Y,Kemmochi,S.,Harada,T.,Shimamoto,K.,Shibutani, M.andMitsumori,K. 学術雑誌名:TheJournalofVeterinaryMedicalScience 巻･号･貢･発行年:InPress 17)題 目:InvoIvementofgIycogensynthasekinase-3Psignalingandaberrant nucleocytoplasmiclocalizationofretinoblastomaproteinintumorpromotionina rattwo-Stagethyroidcarcinogenesismodel 著 者 名:Ago,K.,Saegusa,Y.,Nishimura,J.,Dewa,Y.,Kemmochi,S.,Kawai,M., Harada,T.,Mitsumori,K.andShibutani,M. 学術雑誌名:Experimentaland7bxico)0gicPathology 巻･号･頁･発行年:InPress 18)題 目:Rapiddepositionofglomeru]arlgAinBALB/cmicebynivalenolandits modifyinge能ctonhighlgAstrain(HJGA)mice 著 者 名:Dewa,Y.,Kemmochi,S.,Kawai,M.,Saegusa,Y,Harada,T.,Shimamoto,K･, Mitsumori,K.,Kumagai,S,,Sugita-Konishi,YandShibutani,M･ 学術雑誌名:ExperimentalandTbxicologicPathology 巻･号･頁･発行年:InPress
