CD4 V3/V4領域に対するモノクローナル抗体のHIV-1感染抑制効果の検討

原  著 〔東女医大誌 第63巻 第11号頁1361∼1366平成5年11月〕

CD4 V3／V4領域に対するモノクローナル抗体の

HIV−1感染抑制効果の検討

聖マリアンナ医科大学 難病治療研究センター（指導：西岡久寿樹教授）       ハス   ヌマ    トモ   コ

      蓮 沼  智 子

      （受付 平成5年7月13日） Role of CD4 V3／V4 Region for HIV・11nfection

         Tomoko HASUNUMA

Institute of Medical Science， St． Marianna University School of Medicine   Cell surface・expressed CD4 binds to the envelope glycoprotein of HIV−1 and mediates syncytia formation through interacting with membrane−expressed HIV−1 gp120． Further possible roles of the CD4 molecule in the proρess of cell infection by HIV−1 remain poorly understood． In our study， we describe two monoclonal antibody（mAb）that recognize the V3／V4 domain of the CD4 molecule． Although these mAb do not inhibit gp120−CD4 binding or HIV−1 induced syncytia formation， they inhibit HIV−1 infection of human peripheral blood lymphocytes． These findings suggest that discrete， definable domains of the CD4 molecule may be involved in interactions following HIV−1 envelope binding that lead to virus entry into the cell．          緒「 雷  Human immunode負ciency virus type−1（HIV−

1）は後天性免疫不全症候群（AIDS）の原因ウイ

ルスである．このHIV−1は細胞の表面に発現して

いるCD4分子と結合し細胞内に侵入することが

知られている1）∼5）．ウイルス側．の結合部位はエン ベロープのgp120であり6）心10）， CD4分子側の主な 結合部位はV1領域に存在するこ・とが明らかにさ れているが11）12），CD4分子のその他の領域がHIV・

1感染において何等かの役割を担っているかは未

だ不明である．本研究においては，CD4分子の細胞 外領域のうちV3／V4領域の， HIV−1感染における 役割について検討するため，この領域を認識する

モノクローナル抗体を作製し，これらの抗体の

HIV−1感染におけるin vitroでの影響を調べた．

さらにこれらの抗体のCD4−gp120結合および感

染によるシンシチウム巨細胞形成に及ぼす影響に ついても検討を加えた．          方  法  1．抗ヒトrsCD4モノクローナル抗体の作製．

 ヒトリコンビナソト可溶性CD4（以下rsCD4）

として細胞外ドメインのV1からV4までの領域

を含む375アミノ酸rsCD4（Biogen， Inc．， Cam− bridge， MA， USA）13）と， V1／V2領域のみの180 アミノ酸rsCD4（Biogen， Inc．）13）を使用した． BALB／Cマウス（Charles River Breeding．Col− onies， Wilmington， MA）に毎週50μgの375アミ

ノ酸rsCD4を完全フロインドアジュパンド

（Sigma Chemical Co．， St． Louis， MO， USA）

のエマルジョンとして4∼5週にわたり免疫し

た．これらのマウスより脾臓を摘出し脾細胞を分 離し，スタンダードな方法14）でNS・1細胞と融合し

た．得られたハイブリドーマ細胞が産生した

rsCD4に対する抗体をELISA法にて，375アミノ

酸rsCD4で反応するが，180アミノ酸rsCD4とは

反応しないものを選んだ．これにより6つのモノ

クローナル抗体が得られ，それぞれ5D4，7C2，1

B2，1D5，7A4，そして7C3と命名した．

 2．使用した他のモノクローナル抗体

 今回使用したモノクローナル抗体のうち，

OKT3（抗CD3）とOKT4（抗CD4）はAmerican

Type Culture Collectionより購入したハイブリ ドーマ細胞から採取，A缶Gel Protein Aカラム （Bio Rad， Rockville Centre， NY）で精製した．

17Thy5D7（抗CD4）と7PT3F9（抗CD8）はDr．

S．Schlossman（Dana−Farber Cancer Institute， Boston， MA， USA）より頂いた． Leu3a（抗CD4） （Becton Dickinson， Oxnard， CA， USA），12T4 D11（抗CD4）（Coulter Corp．， Hialeah， FL， USA）

はCD4のV1領域を認識する抗体として， MOPC−

21（Cappel， Organon−Teknika Corp．， Westches− ter， PA， USA），8F2（Dana−Farber Cancer Institute， BostonのDr． C． Morimotoより頂い

た）はT細胞において特異的な認識部位を持たな

い抗体として使用した．また，OKT4はCD4の

V3／V4領域を認識する抗体として使用した15）．

 3．ヒト正常リンパ球へのHIV IIIB株感染抑

制試験  ヒト正常リンパ球をFicoll−diatrizoate比重遠 心法にて分離し5μg／ml Con A（Sigma）を含む 10％FCS（Flow Laboratories， Mclean， VA， USA）一RPMI1640培地（GIBCO， Grand Island， NY， USA），含L−glutamine（2mM）， penicillin （50U／ml）， streptomycin（50μg／m1）にて37℃，

5％CO2存在下で3日間培養した．細胞を1×PBS

にて洗浄後，PBSで100倍希釈した腹水を各抗体

として添加し30分間37℃にて反応させた．1回細

胞を洗った後，32infectious dose（1 infectious doseがヒト末梢リンパ球を感染させる最小量）の

HIV IIIB株で2時間培養した．3回洗浄後，前述

のそれぞれのモノクローナル抗体を400倍希釈で

調整し37℃，5％CO2存在下で培養した．3，7，

10そして14日後にそれぞれの培養上清を採取し， HIV p24抗原量をAntigen Capture Kit（Coulter Corp．）で測定した．

 4．AIDS患者の培養リンパ球における感染抑

制試験

 AIDS患者より得られた末梢血を上記と同様の

方法でリンパ球を分離した．得られた細胞を3日

間Con−Aで刺激後，抗CD8抗体（7PT3F9）で反

応させたのち，マウスIg−Dynabeads（Dyna1， Inc．， Great Neck， NY， USA）（細胞106個に対し100μ1）

を結合させ，抗CD8陽性リンパ球を除去した．こ

の操作は，CD8陽性細胞がHIV−1感染において抑

制効果を示す16）ことが知られているため，その効 果を除去するために行った．残ったりンパ球を前

述の今回得られた抗V3／V4 CD4モノクローナル

抗体で同様に反応させた1抗体添加後，3，6，

9日に培養上清を採取し前述のキットでHIV

p24抗原量を測定した．

 5．抗V3／V4rsCD4モノクローナル抗体による

gp120とrsCI）4との結合阻害性の検討

 1）Cellular EHSAによる検討

 96穴プレートに4．5×104個／wellの糸田胞濃度で

CD4陽性CHO cellをまき，それぞれの精製した

モノクローナル抗体を1．25，2，5，5，10μg／mlの 濃：度で加え4℃で1時間反応させた．0．15μg／ml

のrgp120を加え1時間4℃で反応させた．さらに

1，000倍に希釈されたウサギ抗gp120血清50μ1で 1時間4℃で反応させた後，5，000倍希釈のアルカ リフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブ リン（Jackson ImmunoResearch， West Grove， PA， USA）で1時間4℃で反応させた．10μg／mI

PNPP（Boehringer Mannheim， Germany）で発

色させ，前述のELISA readerで測定した．

 2）gp120発現細胞におけるrsCD4と抗CD4

V3／V4抗体との競合試験

 HIV−1111b envを発現したB細胞line（KT1−

1）（Viagene， Inc．， San Diego， CA， USA）に 375アミノ酸rsCD4を結合させた後，抗CD4， V3／

V4抗体を加えその結合能をみた．106個のKT1−1

細胞を10丁目ヒトAB血清加PBSで前処理（室

温30分）した後，100μgのrsCD4を10％ヒトAB

血清一PBSで1時間室温でインキュベートした．

その後，2％一FCS−PBSで2回洗浄した後， FITC

で標識したそれぞれのモノクローナル抗体で

4℃，30分反応させた．細胞はPBSで洗浄した

後，1％ホルマリンで固定させ，フローサイトメ

トリー（EPICS−C；Coulter Corp．）で測定した．

表1 180及び375アミノ酸CD4に対する反応性

C。ntr。1 mAb．

Newly generated mAb CD4 construct

OKT3

19Thy5D7

OKT4

5D4 7C2 1B2 1D5 6B4 7C4 7C3

180（V1−2） R75（V1−4） 一一 十十  十 ｝十 皿十 一十  十 一十 『十  十

 6．シンシチウム巨細胞形成の阻害試験

 1）CEMX174 cell liheを10MOI（multiplicity of infection）のりコンビナントHIV−1 env− vaccinia（VAbT271−2−1；Applied Bio Technol− ogy， Cambridge， MA， USA）またはコントロー ルのvaccinia constructを室温で2時間感染させ た．1×105個／m1の細胞に，1または10μg／mlのそ れぞれの精製したモノクローナル抗体100μ1を添 加し96穴プレートで17時間から20時間培養した． グリッド付きの培養皿に移しシンシチウム細胞を 鏡視下でカウントした．

 2）他の方法として100μ1のHIV−1111b感染

H9細胞（4×105個／ml）と50μ1のCEMX174細胞

（4×105個／ml）を混合培養し，各抗体を1または 0．1μg／ml添加後，96穴プレートで24時間培養し た．1）と同様の方法でシンシチウム細胞をカウン トした．          結  果  1．rsCD4 V3／V4に対するモノクローナル抗体 の作製

 上記の方法にて得られたrsCD4に対する抗体

をsolid ELIsAにて375アミノ酸に反応するが

180アミノ．_には反応しない抗体を選択した．コン トロールの抗体として，CD4のV1領域を認識する 抗体である19Thy5D7， CD4 V3／V4領域を認識す

る抗体としてOKT4を使用した．この方法により

6つの抗体が得られ，5D4，7C2，1B2，1D5，7A4， 7C3と命名した（表1）．

 2．作製した抗rsCD4抗体によるヒト末梢リン

パ球のHIV・1感染の抑制

 今回得られた6つの抗体によるヒト末梢血リン

パ球のHIV−1感染の抑制効果を検討した． HIV−1 111b株に感染した1｛9細胞の培養上清を， Con−A

刺激後IL・2で培養した正常ヒトリンパ球に添加

した．同時に6つの抗体をマウス腹水の状態で添

表2 ヒトPBLにおける抗CD4抗体5D4と7C2の

 HIV・1増殖抑制効果 P24抗原

mAb

d3 d7 d10 d14 無添加 一 ＋／一 升 十 19Thy5D7 _{一   一 一}

OKT4

『 一 ＋β 十 5D4 一 一 ＋／一 ＋／一 7C2 _{一 一 一 一} lB2 _一 ＋／一 升 升 1D5 ｝ 十 升 十 7A4    ． ＋／一 十 ザ 7C3 ＋／一 十 十 升 畑中の記載は，培養上清中のp24抗原価によりそれぞ れ，一：＜0，1ng／m1，十／一：0．1∼5，0，十：5．0∼15．0， 升：＞15．0とした．

干し2週間培養した．3，7，10および14日後，

培養上清を採取しHIV・1p24抗原価を測定した結

果，表2に示すように，HIV−1 envとCD4の結合

を阻害する19Thy5D7は完全にウイルスの増殖が

抑えられた．一方，CD4 V3／V4を認識する抗体で

あるOKT4は全くウイルスの増殖を抑えなかっ

た．しかしながら今回新たに作製された抗体のう

ち，5D4と7C2はCD4のV3／V4を認識するにも拘

らず明らかなウイルスの増殖抑制効果が認められ た．

 さらに前述のHIV−1感染抑制が認められた2

つの抗体について，AIDS患者より得られたリン

パ球でのウイルスの増殖抑制効果を検：白した．そ

の結果，表3に示すように抗体を全く加えなかっ

たリンパ球では培養上清中のp24抗原価は著しく

増加しているにも拘らず，5D4と7C2は明らかな抑 制効果が認められた．

 3．5D4と7C2のHIV−1 envとCD4分子の結合

阻害能の検討

 上記の実験で抑制効果を示す2つの抗体がウイ

ルスgp120とCD4との結合を阻害しないか以下

表3 AIDS患老末梢リンパ球における抗CD4抗体5  D4と7C2のHIV−1増殖抑制効果 抗 体 _iμ9／m1）濃 度 p24 Ag d3 d6、 d9 無添加 P9Thy5D7 TD4 VC2  1． D10 @1 P0 @1 P0 ＋／一 @一 @一 @一 @一 {／一 @｝ 表中の記載は，培養上清中のp24抗原価によりそれぞ れ，一：〈0．1ng／ml，十／一：0，1∼5．0，十：5．0∼15．0， 十ト：＞15．0とした。

表4 抗CD4抗体によるrgp120とCD4＋CHO細胞

 との結合阻害能 抗体濃度（ug／n1D 抗 体 10 5 2．5 1．25

MOPC

keu3a

nKT4

TD4 VC2 表中の±はEHSAメーターの0．D．で，0．15未満を一，0．15 以上を＋とした． の2つの方法で検討した．

 1）cellular ELISAによるgp120とCD4分子の

結合阻害実験

 CD4陽性CHO cellをそれぞれの抗体で前処理

した後のリコンビナントgp120との結合をウサギ

抗gp120抗体で検出した結果を表4に示す．その

結果，CD4 V1領域を認識するLeu3aはほぼ完全

にrgp120の．結合を抑えたが，5D4，7C2は

MOPC21やOKT4等と同様に結合阻害は認めら

れなかった．

 2）5D4，7C2のgp120発現細胞とrsCD4分子の

結合抑制能  gp120を発現している細胞KT1−1（B cell line）

とrsCD4をあらかじめ結合させ，その後FITCで

ラベルされたモノクローナル抗体を反応させた．

図に示すように5D4，7C2はKT1−1細胞に結合し

たCD4分子に結合していることがわかる．このこ

図 gp120発現細胞に結合したrsCD4への5D4，7C2の  結合性  縦軸に相対的細胞数，横軸に蛍光輝度を示す．V1領  域に結合する抗体，19Thy5D7，12T4DllはrsCD4に  結合していないが，5D4，7C2はV3／V4領域を認識す  るOKT4と同様， rsCD4への結合が認められる． 表5 ワクシニア／HIV envで感染させたCEMX174  細胞でのシンシチウム巨細胞形成阻害試験 シンシチウム細胞数（％抑制率） 抗 体 10μ9／mI 1μ9／mI 無添加 549．6±10，0

OKT3

615．0±6．5（ 0） 475．7±21．8（13．4） 19Thy5D7 11．0±3．6＊（98．0） 8．3±1．5＊（98．4）

OKT4

657．6±12．6（ 0） _{661．3±14．9（} 0） 5D4 515．3±122（ 6．2） 442．0±23．3（19．5） 7C2 445．0±6．9（19．0） 558，3±8．3（ 0） 数値はmean±SDを示す，（）内は抑制率を示す． 有意差＊p＜0．005

とからこれらの抗体はgp120とCD4との結合部

位でないところを認識していることがわかった．  4．シンシチウム細胞形成抑制試験  HIV−1の細胞内侵入において， CD4との結合後 シンシチウム細胞が形成されることが知られてい る17）18）．今回検討しているモノクローナル抗体5

D4，7C2は上記の実験よりワイルスgp120との結

合はブロックしないことが明らかになった．そこ で，シンシチウム形成に及ぼす影響について前述 の2つの方法で検討した．

 まずHIV−l envワクシニアウイルスで感染さ

せたCEMX174細胞はシソシチウムを形成するこ

とが知られているが，この形成の抑制効果を見る

表6 抗CD4抗体のHIV・1感染H9細胞とCEMX174  細胞の混合培養でのシンシチウム細胞形成阻害試験 シンシチウム細胞数（％抑制率） 抗 体 1μ9／ml 0．1μ9／ml 無添加 P9Thy5D7

OKT4

OKT3

TD4 VC2 97．3±4，0 @0．0±0．0＊（100．0） W5．3±4．1（12，4） X0，3±3．0（7．2） P03．0±6．2（ 0） W9．0±3．4（8．5） 31．6±3．2＊（67．5） P10．0±12．4（ V63±7．2（21．5） P15．3±3．5（ P29．0±10，1（ 0） O） O） 数値はmean±SDを示す．（）内は抑制率を示す． 有意差＊p〈0，005

と，表5に示したとおり，CD4とgp120との結合を

ブロックするモノクローナル抗体19Thy5D7はほ

ぼ完全にシンシチウム細胞の形成が抑制された．

それに対し，5D4，7C2はOKT4，0KT3と同様10

μg／mlでも殆ど抑制効果がみられなかった．ま

た，同様にHIV−1（IIIb株）で感染させたCD4陽

性細胞株H9とCEMX174細胞の混合感染による

シソシチウム形成でも表6に示すように，19Thy5

D7では1μg／m1では完全に，0．1μg／mlでも67％ の抑制率が認められた．しかしながら，5D4，7C2 では他の抗体と同様抑制効果はみられなかった．          考  察

 AIDSの原因ウイルスであるHIV・1はCD4陽

性細胞に対し強い親和性を示す．このウイルスの

感染においてはまずHIV−1のgp120とCD4分子

のV1領域のある部位が結合することが明らかに

されている．しかしながらその後のウイルスの細 胞内侵入のイベントについてはまだ明らかにされ ていない部分が多い．

 今回の実験では，CD4のV3／V4領域を認識する

モノクローナル抗体を作製し，これらの抗体の

HIV−1感染抑制効果を検討した．その結果，得られ

た6つのモノクローナル抗体のうち，5D4，7C2の

2つにおいて明らかな感染抑制効果が認められ

た．この効果は，CD4のV1領域を認識するモノク

ローナル抗体よりもやや劣るが，その抑制メカニ

ズムは既知のgp120−CD4結合を全く介さないこ

とが今回の検討で明らかにされた．そしてシンシ チウム細胞形成抑制についても明らかな抑制が認 められなかった．

 CD4 V3／V4領域に対するモノクローナル抗体

のHIV−1感染抑制効果については，他の報告があ り，HIV−1感染においてV1領域以外にも関与して いることが強く示唆されている19）20）．

 一方，臨床的にはCD4分子に対する自己抗体が

患者の10∼20％で認められる．ことが知られてい る21）22）．このCD4分子に対する自己抗体は， V3／ V4領域を認識していることがわかっており，ウイ

ルスとCD4分子の結合により，CD4のC末端の構

造変化が起こり，新たに露出した部位に対して抗 体産生が起こるのではないかと考えられている．

この抗体産生は，AIDSの病期やCD4陽性細胞

数，塵清IgG値などとは無関係であり，この抗体

が存在することで発病および症状の進行が遅れる かどうかはまだ明らかにされていない．しかしな がら，これに関連した報告として，HIV−1に感染し

たチンパンジーにrsCD4を免疫し抗CD4抗体を

産生させるrsCD4分子の免疫療法の実験が行わ

れているが，これらの自己抗体はやはりCD4の

V3／V4領域を認識していることがわかっており， in vitroの実験においいてウイルスの細胞内への 侵入を妨げる効果があると報告されている23）．

 以上のことより，HIV−1がCD4陽性細胞と結合

し細胞内に侵入するとき，CD4のV1領域と結合し

た後のイベントにおいてCD4 V3／V4領域が深く

かかわっていることが示唆された．AIDS患者に

おける抗CD4抗体の役割を含め，さらに検討が必

要であると考えられる．          結  語  1）CD4 V3／V4領域に対するモノクローナル抗 体6つを作製した．

 2）これらの内，2つの抗体5D4と7C2において

in vitroでのHIV−1感染抑制効果が認められた，

 3）これらの抗体はCD4とgp120の結合を阻害

しなかった．

 4）さらに，これらの抗体はHIV−1感染による

シンシチウム形成を抑制しなかった．  稿を終えるにあたり，御指導，御助言を頂きました， 米国マサチューセッツ州ハーバード大学霊長類研究 センター免疫部門のDr． Norman L． Letvin，同大学

Dana Farber Cancer Institute fkRXK FS cD st7ts(Xft5t

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