Notch シグナル伝達系は蝸牛感覚上皮細胞極性形成に必要である

【報　告】

Notch シグナル伝達系は蝸牛感覚上皮細胞極性形成に必要である

楯谷　智子^＊1，＊2，坂本　進^＊2，＊3，影山　龍一郎^＊2

＊1 京都先端科学大学　健康医療学部　言語聴覚学科

＊2 京都大学　ウイルス・再生医科学研究所

＊3 米国国立聴覚・伝達障害研究所（NIDCD）

Notch signaling is required for Epithelial Polarity Formation in cochlear sensory epithelium

Tomoko Tateya

，Susumu Sakamoto

，Ryoichiro Kageyama

＊1

Department of Speech and Hearing Sciences and Disorders, Faculty of Health and Medical Sciences, Kyoto University of Advanced Science

＊2

Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University

＊3

National Institute of Deafness and Communication Disorders, National Institutes of Health

要　　旨

発生期の内耳において有毛細胞と支持細胞は共通の感覚上皮前駆細胞から生じるが，Notch シグ ナル伝達系は複数の段階で重要な役割を担っていることが報告されており，感覚上皮前駆細胞の形 成・維持や，有毛細胞と支持細胞の運命決定に必要であるとされる．感覚上皮前駆細胞から有毛細 胞・支持細胞分化が起こる過程で，時期毎の Notch シグナル伝達系の役割を知るために，Atoh1- EGFP マウス胎仔蝸牛培養系を用い 1 日の時間窓で Notch シグナル伝達系阻害薬を作用させた．そ の結果，特定の時期における Notch シグナル伝達系阻害薬の投与によって Atoh1 陽性細胞がロゼッ ト様構造を形成し，上皮細胞極性が攪乱されていた．その時期以外の Notch シグナル伝達系阻害薬 投与によっては大きな影響がないことより，Notch シグナル伝達系は発生期蝸牛の感覚上皮前駆細 胞群の上皮細胞形成に必要であり，その影響には臨界期があることが示唆された．

キーワード：蝸牛，有毛細胞，感覚上皮前駆細胞，Atoh1，Notch シグナル伝達系 Key Words: cochlea, hair cells, prosensory cells, Atoh1, Notch signaling pathway

Ⅰ 　 は じ め に

難聴は最もありふれた感覚器障害の一つであり，

補聴器では聴覚補償できないほど高度難聴者はわが 国でも数十万人いると推測されているが，高齢化社 会を迎え益々難聴者の数は増えると考えられてい る．しかしながら，高度難聴者の大多数に対して有 効な治療がないのが現状である

．

難聴の多くは内耳性難聴で，聴覚を司る蝸牛にあ る有毛細胞に障害があると言われている．蝸牛の有

毛細胞は，音信号を神経が伝達できる電気信号に変 換する感覚細胞である．哺乳類では，成熟した蝸 牛有毛細胞は一度傷害を受けると再生しないとさ れ，このことが難聴治療の困難さの原因とされてい る

．

難聴の根本的な治療には，失われた有毛細胞を何

らかの方法で再生させることが必要である．臓器の

再生を目指す際のアプローチ方法の一つは，その

臓器の発生を再現するというものである

．そのた

め、発生過程を解明していくことが再生医療の基礎

として重要である．

内耳は蝸牛と，平衡感覚を司る前庭系から成る感 覚器官であり，英語で labyrinth（迷路）と呼ばれ るほど複雑な構造を持つが，内耳の始まりは耳プラ コードと呼ばれる単純な一層の外胚葉である．この 細胞層が陥入して球形の耳胞となり，それがさらに 腹側に突出し蝸牛管となる．蝸牛管はコイル状に伸 張していき， 「蝸牛」と呼ばれるように巻貝状の特徴 的な形態となる．

蝸牛管上皮の一部より，音センサーである蝸牛感 覚上皮（コルチ器）が発生する．まず蝸牛管の底部 に，将来コルチ器となる領域である感覚上皮予定領 域が決定される．この領域を構成する感覚上皮前駆 細胞（prosensory cells）は，有毛細胞とそれを取り 囲む支持細胞の共通の祖先と考えられている．蝸牛 管が伸張していくのと同時に，感覚上皮前駆細胞か ら有毛細胞あるいは支持細胞への分化が進行し，蝸 牛感覚上皮が形成される

．

塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子 である Atoh1 は，最初に感覚上皮前駆細胞と幼弱な 有毛細胞に発現する有毛細胞マーカーであり，有毛 細胞への分化を促進すると考えられている

．有 毛細胞分化は蝸牛の基底回転側で先行し，次第に頂 回転側へと進行する．また，有毛細胞分化は内有毛 細胞で先行し，外有毛細胞は 1 日前後遅れて分化す る

．内有毛細胞と外有毛細胞は機能が異なり，音 を受容して神経に伝えるのは内有毛細胞であり，外 有毛細胞は音に対する感受性を調整していると考え られている．

また，有毛細胞分化に引き続き，有毛細胞周囲の 細胞が支持細胞へと分化する．このような細胞分化 の過程においては Notch シグナル伝達系の側方抑制

（lateral inhibition）という機序が重要であることは よく知られている

．先に Atoh1 を発現し有毛細 胞に分化した細胞は，隣接する感覚上皮前駆細胞に Notch シグナルを送る．Notch シグナルを受けた感 覚上皮前駆細胞は Notch シグナル伝達系の下流であ る塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因 子 Hes/Hey を発現し，支持細胞へと分化誘導される

8–11）

．この側方抑制の仕組みは，1 列の内有毛細胞・

3 列の外有毛細胞・それらを囲む支持細胞という整 然とした蝸牛感覚上皮の構造形成のために，重要な 役割を果たしていると考えられている

．

しかしながら，Notch シグナル伝達系に関連する 因子は感覚上皮予定領域において，側方抑制の働く 時期よりも前から発現していることも知られてい

る

．Notch シグナル伝達系は複数の段階で重要

な役割を担っていることも報告されており，側方抑

制による運命決定だけでなく，感覚上皮前駆細胞の 形成・維持に必要であるとされる

．本研究では，

感覚上皮前駆細胞から有毛細胞・支持細胞分化が起 こる過程で，時期毎の Notch シグナル伝達系の役割 を知るために，Atoh1とHes5の蛍光レポータータン パク質を発現するマウスの胎仔蝸牛培養系を用い，

1 日の時間窓で Notch シグナル伝達系阻害薬を作用 させた．その結果，特定の時間窓でのみ上皮細胞極 性が攪乱され，蝸牛発生においてこれまで報告のな かった Notch シグナル伝達系の役割が示唆されたた め，報告する．

Ⅱ　方　　　法

本研究は生体マウス組織を用いた動物実験から成 る．マウスは，有毛細胞分化により GFP を発現する Atoh1-EGFP, 支持細胞分化により mCherry を発現 するpHes5-NLS3-mCherryを使用した

．Tateya ら

の方法に従って，胎生 14.5 日（E14.5）で胎仔マ ウス内耳を採取し，蝸牛培養系を確立した．Notch シグナル伝達系を阻害する薬剤としてγ-セクレター ゼ阻害薬 DAPT 25µM を用いた

．培養と薬剤投 与のスケジュールを図 1 に示した．培養後の固定，

免疫染色，共焦点顕微鏡撮影方法は Tateya らの方 法に従った

．

なお全ての実験は京都大学ウイルス・再生医科学 研究所において，「京都大学における動物実験の実 施に関する規程」の定めるところに従い，動物実験 委員会の承認を得た実験計画に基づいておこなわれ た．

図 1．蝸牛培養と薬剤投与のスケジュール

Ⅲ　結　　　果

1．E14.5 から 1 日間培養した蝸牛上皮

免疫染色結果を図 2 に示す．図の上が蝸牛軸

側（内有毛細胞側）であり，図の下が血管条側

対照群の基底回転では，内側の 1 列の Atoh1 陽性 細胞と外側の 3 列前後 Atoh1 陽性細胞の間に p75

陽性細胞が認められた．これらはそれぞれ，内有毛 細胞，外有毛細胞，柱細胞を示唆している．一方，

頂回転～中回転では Atoh1 陽性細胞は内側に 1 列の み明瞭に観察された．生体の蝸牛の正常発生過程で は，有毛細胞分化は内有毛細胞から外有毛細胞へ，

基底回転側から頂回転側へ進行することが知られて おり，培養蝸牛の Atoh1 陽性細胞の出現パターンは 生体内の発生過程を模倣していることが示された．

一方，DAPT 添加培地で培養した蝸牛の中～基底 回転では，Atoh1 陽性細胞数が増加していた．これ は，支持細胞に分化するはずであった感覚上皮前駆 細胞が，Notch シグナル伝達系の阻害により側方抑 制が働かず，有毛細胞に分化しつつあることを示唆 している．

2．E14.5 から 5 日間培養した蝸牛上皮

免疫染色結果を図 3 に示した．共焦点顕微鏡 で 3 次元的に z-stack 撮影されており，Maximum intensity projection と xz 平面像では 3 次元画像が 2 次元的に再構成されている．Maximum intensity projection は各チャンネルごとに最も強い輝度を xy 平面（培養皿および培養開始時の蝸牛上皮頂端面に 平行な平面）に投影したものであり，また xz 平面 とは xy 平面内の縦の白線を通り xy 平面に垂直な平 面像であり，図の左側が（培養開始時の）蝸牛上皮 頂端面側で図の右側が基底膜側である．なお，xz 平 面内の縦の白線を通り xz 平面に垂直な平面像とし てxy平面が示されている．図の上が蝸牛軸側（内有

毛細胞側）であり，図の下が血管条側（外有毛細胞 側）である．Atoh1（緑）は有毛細胞マーカー，Sox2

（赤）は支持細胞マーカー，DAPI（青）は核染色で ある．

E14.5 から 5 日間培養すると，生体マウスであれ ば E19.5 であり出産日に相当する．E19.5 あるいは P0（出産日）であれば生体の蝸牛では頂回転まで有 毛細胞分化は完了しているが，E14.5から5日間培養 した対照群の蝸牛上皮においても頂回転側まで複数 列の Atoh1 陽性細胞が観察された．また，有毛細胞 の対照群の xz 平面では上皮の頂端面側に Atoh1 陽 性細胞，基底膜側に Sox2 陽性細胞があり，E19.5 あ るいは P0（出産日）の蝸牛上皮と同様のパターンで あった．

図 2．E14.5 から 1 日間培養した蝸牛上皮

図 3．E14.5 から 5 日間培養した蝸牛上皮

（外有毛細胞側）である．Atoh1（緑）は有毛細胞

マーカーである．p75

（マゼンタ）は内有毛細胞

と外有毛細胞の間に存在する支持細胞である柱細胞

のマーカーであり，有毛細胞の分化に従って柱細胞

に限局するようになる．

一方，DAPT を 1 日間添加し，その後は通常の 培地を用いた培養蝸牛上皮では，Atoh1 陽性細胞が 放射状に配列したロゼット様構造を形成していた．

xy 平面像・xz 平面像では，ロゼット様構造の内部 に管腔様の空隙がみられた．ロゼット様構造の出現 には部位による偏りがあり，DAPT1 日目投与群で は中～基底回転に多く，DAPT2 日目投与群では頂

～中回転に多く観察された．

つまり，DAPT 投与を 1 日後にずらすことによっ て，ロゼット様構造の形成部位は頂回転側に移動し たことになる．このような DAPT による上皮細胞 極性攪乱効果は，E14.5 蝸牛の中～基底回転から，

E15.5の頂～中回転に限局して観察されたことより，

感覚上皮前駆細胞が有毛細胞に分化する直前の蝸牛 上皮に限定されると考えられた．

3．E14.5 から 7 日間培養した蝸牛上皮

対照群の免疫染色結果を図 4 に示した．共焦点顕 微鏡で z-stack 撮影された 3 次元画像のスクリーン ショットであり，緑が F-actin，赤が Atoh1，白が Hes5（支持細胞マーカー）青が DAPI（核染色），

上が内側で下が外側である．F-actin は細胞骨格を 描出するためのもので，特に有毛細胞の頂端面側の 構造を可視化することが出来る．生体の蝸牛有毛細 胞のような規則的配列は形成できていなかったもの の，培養蝸牛でも約 4 列の有毛細胞配列が維持され ていた．また，Hes5陽性の支持細胞の平面的配列も 観察された．

腔であり，その周辺に配置する細胞は Atoh1 陽性で あった（矢頭）．さらに，Atoh1 陽性細胞に囲まれた 管腔様構造の外腔側には Hes5 陽性細胞も見られた

（矢印）．

図 4．E14.5 から 7 日間培養した対照群の蝸牛上皮

図 5． E14.5 から 7 日間培養した DAPT1 日目投与群の蝸 牛上皮

このような Atoh1 陽性細胞や Hes5 陽性細胞の存 在は，本来の蝸牛上皮が持つ上皮細胞極性は攪乱さ れたまま Notch シグナル伝達系の側方抑制が働き，

細胞分化が進行していることを示唆している．

Ⅳ　考　　　察

ある細胞が分化して特定の細胞に運命決定される ためには，周りの細胞との間でやり取りする情報が 大事である．発生のプロセスの多くは，そのような 情報のやり取りである様々のシグナル伝達系によっ て制御されている．細胞外シグナル分子が，細胞間 でやり取りされるシグナルの実体であり，情報の受 け手の細胞において細胞内シグナル伝達経路を活性 化し，細胞の運命や行動が決定される．その際，細 胞が単一のシグナルにのみ制御されることはまれで あり，実際には複数のシグナル伝達系が互いに影響 しあっているものと考えられる．例えば神経幹細胞 の分化においては，複数のシグナル伝達系が，ある 局面ではそれらが相乗的に作用してひとつの細胞系 譜の進行を誘導する一方で，別の局面ではお互いに 抑制しあうというネットワークを構築し，神経幹細 胞の運命づけを左右している

．

内耳発生においても同様に，複数のシグナル伝達 系の関与が考えられる．近年，内耳においても多数 の遺伝子やシグナル伝達系が発生・分化に関与して いることが報告され，それらの異常によってさまざ まな発生異常・機能異常が起こることが明らかに なってきた．発生期の内耳感覚上皮において何らか の報告がなされているシグナル伝達系に，Notch，

ヘッジホッグ，FGF および TGFβ/BMP シグナル伝 一方，DAPT を 1 日間添加し，その後は通常の

培地を用いた培養蝸牛上皮（図 5）では，管腔が入

り組んだような構造が観察された．図 5 も図 4 と同

様，緑が F-actin，赤が Atoh1，白が Hes5（支持細

胞マーカー）青が DAPI（核染色）である．白線の

交差する点を含む緑色の領域は管腔様構造をなす内

達系がある

．これらはいずれも感覚上 皮における関連遺伝子の発現が報告されており，ま た，部位あるいは時期特異的な機能があることが示 唆されているものである．同じ因子やシグナル伝達 系が，部位によってまた時期によって，違う役割を 帯びて「使いまわし」されているということでもあ る．

蝸牛のように発生過程が複雑であり，狭い範囲で あるにもかかわらず部位により発生の進行度が異な るような臓器については，実験のデザインや結果 の解釈に注意を払う必要がある．培養蝸牛に対し DAPT 等の薬剤を用いることで特定のシグナル伝 達系の機能を調べる研究はこれまで多くの報告があ

るが

、本研究の新規な点は、薬剤投与を 1

日とその後 wash out することによって時間窓を狭 くした上で、蝸牛の頂回転・中回転・基底回転といっ た発生段階の違う部位毎に調べたことである。今後 は時間窓を 12 時間や 6 時間など，より短くして検証 すべきと考えられる．

本研究においては，先ずは単一のシグナル伝達系 につき調べるのが妥当と考え，Notch シグナル伝達 系阻害薬を培養蝸牛に用いた．培養系に移すことに よって，生体に対しては用いにくい高濃度の薬剤を 安定して使用できる利点はあるが，蝸牛管を開く手 術操作や周辺の間葉系組織の除去により複数のシグ ナル伝達系の未知の相互作用が減弱・消失する等の 影響が出る可能性がある．今後は別の実験系、出来 れば生体内で検証していくことが重要になると考え られる．

上記のような課題はあるものの，本研究により Notch シグナル伝達系阻害薬によって発生期蝸牛感 覚上皮予定領域の上皮細胞極性が攪乱されること，

その後に阻害薬を wash out すれば再度側方抑制が 働くことが示された．これは，人工的に蝸牛感覚上 皮を誘導しようとする際に，既存の上皮細胞極性を リセットする目的で応用できるかもしれない．ま た，リセット後にも側方抑制が働き有毛細胞と支持 細胞が分化しうることも示唆している．

謝　　　辞

本研究は，文部科学省の補助金（基盤研究 C）を 受けて実施した（16K11179）．利益相反（COI）は ない．

文　　　献

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