分子病理診断:
進化し続けるバイオマーカー
谷田部 恭 （YATABE, Yasushi)
愛知県がんセンター 遺伝子病理診断部 第27回がん臨床研究フォーラム 「肺がん診療最前線：過去、現在、そして未来は？ 平成29年６月９日（金） 国立がん研究センター内国際研究交流会館肺癌治療の変遷
肺癌診断の一例
診断: non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma
2本のCTガイド下針生検組織標本で、およそ30％に分化傾向の乏しい非小 細胞肺癌が認められます。形態学的には組織亜型の判別は困難ですが、免 疫染色ではTTF-1陽性、p40陰性を示し、生物学的には腺癌の特徴を持 ちます。 遺伝子検査の結果は以下のとおりで、免疫チェックポイント阻害剤に対する効 果が期待できます。
１．EGFR遺伝子： Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません。 ２．K-RAS遺伝子： Codon 12に点突然変異が検出されました。
３．HER2遺伝子： Exon 20 insは検出されません。 ４．BRAF遺伝子： V600Eは検出されません。
５．ALK遺伝子： IHCで確認しましたが、陰性です。 ６．ROS1遺伝子：IHCで確認しましたが、弱陽性です。 ７．Tumor Proportion Score (TPS): 70%
肺癌診断の一例
診断: non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma
2本のCTガイド下針生検組織標本で、およそ30％に分化傾向の乏しい非小 細胞肺癌が認められます。形態学的には組織亜型の判別は困難ですが、免 疫染色ではTTF-1陽性、p40陰性を示し、生物学的には腺癌の特徴を持 ちます。 遺伝子検査の結果は以下のとおりで、免疫チェックポイント阻害剤に対する効 果が期待できます。
１．EGFR遺伝子： Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません。 ２．K-RAS遺伝子： Codon 12に点突然変異が検出されました。
３．HER2遺伝子： Exon 20 insは検出されません。 ４．BRAF遺伝子： V600Eは検出されません。
５．ALK遺伝子： IHCで確認しましたが、陰性です。 ６．ROS1遺伝子：IHCで確認しましたが、弱陽性です。 ７．Tumor Proportion Score (TPS): 70%
PD-L１: IHC 22C3にて陽性(高発現)と判定します。
肺癌診断の一例
診断: non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma
2本のCTガイド下針生検組織標本で、およそ30％に分化傾向の乏しい非小 細胞肺癌が認められます。形態学的には組織亜型の判別は困難ですが、免 疫染色ではTTF-1陽性、p40陰性を示し、生物学的には腺癌の特徴を持 ちます。 遺伝子検査の結果は以下のとおりで、免疫チェックポイント阻害剤に対する効 果が期待できます。
１．EGFR遺伝子： Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません。 ２．K-RAS遺伝子： Codon 12に点突然変異が検出されました。
３．HER2遺伝子： Exon 20 insは検出されません。 ４．BRAF遺伝子： V600Eは検出されません。
５．ALK遺伝子： IHCで確認しましたが、陰性です。 ６．ROS1遺伝子：IHCで確認しましたが、弱陽性です。 ７．Tumor Proportion Score (TPS): 70%
PD-L１: IHC 22C3にて陽性(高発現)と判定します。
肺癌診断の一例
診断: non-small cell carcinoma, favor adenocarcinoma
2本のCTガイド下針生検組織標本で、およそ30％に分化傾向の乏しい非小 細胞肺癌が認められます。形態学的には組織亜型の判別は困難ですが、免 疫染色ではTTF-1陽性、p40陰性を示し、生物学的には腺癌の特徴を持 ちます。 遺伝子検査の結果は以下のとおりで、免疫チェックポイント阻害剤に対する効 果が期待できます。
１．EGFR遺伝子： Exon 19 del, Exon20 ins, L858Rは検出されません。 ２．K-RAS遺伝子： Codon 12に点突然変異が検出されました。
３．HER2遺伝子： Exon 20 insは検出されません。 ４．BRAF遺伝子： V600Eは検出されません。
５．ALK遺伝子： IHCで確認しましたが、陰性です。 ６．ROS1遺伝子：IHCで確認しましたが、弱陽性です。 ７．Tumor Proportion Score (TPS): 70%
PD-L１: IHC 22C3にて陽性(高発現)と判定します。
腺癌と扁平上皮癌を区別する理由
1. 生物学的に異なる腫瘍
2. 腫瘍の特性による薬剤効果の違い
ペメトレキセド : 腺癌に有効性が示されている。 ベバシズマブ: 有害事象が扁平上皮癌では高い。 ニボルマブ: 有効性の傾向が異なる。実際に分けようとすると…
高分化
低分化
腫瘍かどうかが難しい
分化の傾向は明らか
実際に分けようとすると…
高分化
実際に分けようとすると…
高分化
低分化
腫瘍かどうかが難しい
分化の傾向は明らか
免疫染色による判別
63歳 男性 喫煙者 末梢の4cm大結節
免疫染色による判別
TTF-1
生物学的特徴に基づいたWHO分類
腺癌 Lepidic Acinar Papillary Micropapillary Solid扁平上皮癌
Keratinizing Non-keratinizing Basaloid これまでは大細胞癌に含まれていた腫瘍も 免疫染色でTTF-1陽性であれば充実性 腺癌に入れられる これまでは大細胞癌に含まれていた腫瘍も 免疫染色でp40陽性であれば 非角化型扁平上皮癌となるIV期非小細胞肺癌 PD-L1 IHC 22C3 TPS ≥50% TPS 1-49% ペムブロリズマブを考慮 化学療法を考慮 化学療法を考慮 TPS <1% ニボルマブ治療や その他の治療法を考慮 扁平上皮癌 非扁平上皮癌 ニボルマブを除くそ の他の治療を考慮 *1 PD-L1 IHC 28-8を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが、IHC 28-8による再検査が困 難な場合には、PD-L1 IHC 22C3の結果で代用することも可能。 *2 最適使用推進ガイドラインを参照して保険償還に関して注意する必要がある。 *2 *1 EGFR検査 ALK検査 遺伝子異常に応じた分子標的治療 を考慮 EGFR変異 陽性 ALK融合 遺伝子陽性 ペムブロリズマブ治療や その他の治療法を考慮 一次治療後、増悪 ROS1検査 ROS1融合 遺伝子陽性 日本肺癌学会 PD-L1検査の手引より
IV期非小細胞肺癌
PD-L1 IHC 22C3 EGFR検査 ALK検査 ROS1検査
頻度 30％ 4-5％ 1％ ～30％ DNA抽出 PCR解析 免疫染色 FISH解析 免疫染色 RT-PCR解析 22C3 免疫染色 28-8 免疫染色
EGFR変異検査
IV期非小細胞肺癌 PD-L1 IHC 22C3 TPS ≥50% TPS 1-49% ペムブロリズマブを考慮 化学療法を考慮 化学療法を考慮 TPS <1% ニボルマブ治療や その他の治療法を考慮 扁平上皮癌 非扁平上皮癌 ニボルマブを除くそ の他の治療を考慮 *1 PD-L1 IHC 28-8を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが、IHC 28-8による再検査が困 難な場合には、PD-L1 IHC 22C3の結果で代用することも可能。 *2 最適使用推進ガイドラインを参照して保険償還に関して注意する必要がある。 *2 *1 EGFR検査 ALK検査 遺伝子異常に応じた分子標的治療 を考慮 EGFR変異 陽性 ALK融合 遺伝子陽性 ペムブロリズマブ治療や その他の治療法を考慮 一次治療後、増悪 ROS1検査 ROS1融合 遺伝子陽性 日本肺癌学会 PD-L1検査の手引より 耐性変異陽性 オシメルチニブ治療を 考慮
EGFR-TKI耐性変異
再生検による耐性変異検査
再生検の実際
リキッドバイオプシーとは?
Liquid biopsy is defined as non-invasive blood tests that detect the features of tumor cells that are shed into the blood from the primary tumour and from metastatic sites.
1. Circulating tumour cells (CTCs)
2. Circulating free/fragments of tumor DNA (cfDNA)
cfDNA
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2015 Jan;24(1):206-12.
Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer: a meta-analysis.
cfDNAによるEGFRの実際
EGFR T790T T790M Wild-type 21 0 Mutation 21 9 愛知県がセンター 2017.02-05まとめ • 58.8％でEGFR変異が検出された • それらはすべて組織での変異パターンと一 致した。 • そのうちの30％でT790Mが検出されたIV期非小細胞肺癌
PD-L1 IHC 22C3 EGFR検査 ALK検査 ROS1検査
頻度 30％ 4-5％ 1％ ～30％ DNA抽出 PCR解析 免疫染色 FISH解析 免疫染色 RT-PCR解析 22C3 免疫染色 28-8 免疫染色
ALK融合遺伝子検査
RNA抽出可能 （細胞診・新鮮凍結組織など） 肺癌検体 EGFR/KRAS 変異検査 RT-PCR IHC 陰性 陽性 陰性 陽性 FISH 陰性 ALK 阻害薬 臨床的（40歳以下の患者など）、形態学的（粘液 産生を伴う篩状増生パターンを示す腺癌や印環細胞 癌、TTF-1陽性の粘液産生性腺癌） ＊ALK融合遺伝子陽性肺癌患者には進行が非常に速く迅速な治療薬開始が必要と判断される患者も含 まれる。このような医学的判断がなされた場合には、IHC検査偽陽性の可能性につき患者・家族に十分 説明の上、FISH検査結果を待たずにALK阻害薬を投与することも選択肢となるであろう。この際は、十分 な精度管理がなされたIHC法である確認、FISH検査のオーダーと後日の結果確認が必要である。 迅速な治療開始を要する場合に限り* ・ 精度管理されたIHC法での結果 ・ IHC偽陽性の可能性を十分に説明 ・ FISHによる確認が必要 陽性 日本肺癌学会 ALK検査の手引よりIHC （免疫染色、免疫組織化学染色）
DAB DAB DAB DAB 抗原賦活化 組織内抗原への 一次抗体反応 一次抗体 組織内抗原 二次ポリマー抗体の反応 酵素反応による発色肺癌におけるALKの免疫染色
ALKのタンパク発現
ALK融合遺伝子検査
RNA抽出可能 （細胞診・新鮮凍結組織など） 肺癌検体 EGFR/KRAS 変異検査 RT-PCR IHC 陰性 陽性 陰性 陽性 FISH 陰性 ALK 阻害薬 臨床的（40歳以下の患者など）、形態学的（粘液 産生を伴う篩状増生パターンを示す腺癌や印環細胞 癌、TTF-1陽性の粘液産生性腺癌） ＊ALK融合遺伝子陽性肺癌患者には進行が非常に速く迅速な治療薬開始が必要と判断される患者も含 まれる。このような医学的判断がなされた場合には、IHC検査偽陽性の可能性につき患者・家族に十分 説明の上、FISH検査結果を待たずにALK阻害薬を投与することも選択肢となるであろう。この際は、十分 な精度管理がなされたIHC法である確認、FISH検査のオーダーと後日の結果確認が必要である。 迅速な治療開始を要する場合に限り* ・ 精度管理されたIHC法での結果 ・ IHC偽陽性の可能性を十分に説明 ・ FISHによる確認が必要 陽性 日本肺癌学会 ALK検査の手引よりALK break apart FISH
Break apart FISH ALK gene
Probe Probe
Standard FISH procedure
<標本の下準備> １．脱パラフィン ２．洗浄 ３．加熱処理（2xSSCに入れ10分間電子レンジで加熱 ） ４．ペプシンによるタンパク質分解 ５．PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥 ＜ハイブリダイゼーション＞ ６．切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける ７．80～90℃のホットプレート上で10分間加熱し変性処理 ８．37℃でovernightハイブリダイズ ＜洗浄・検出＞ ９．２×SSC中５分浸漬しカバーグラスを静かにはずす 10．50％ホルムアミドで余分なプローブを除去 11．DAPI染色後マウント 12．蛍光観察IV期非小細胞肺癌
PD-L1 IHC 22C3 EGFR検査 ALK検査 ROS1検査
頻度 30％ 4-5％ 1％ ～30％ DNA抽出 PCR解析 免疫染色 FISH解析 免疫染色 RT-PCR解析 22C3 免疫染色 28-8 免疫染色
Updated CAP/IASLC/AMP guideline (Draft)
Recommendation: Physicians should use ROS1 molecular
or cytogenetic testing on all lung adenocarcinoma patients, irrespective of clinical characteristics, when selecting
patients for ROS1-targeted therapy.
Expert Consensus Opinion: Physicians may use ROS1 IHC
as a screening test in lung adenocarcinoma patients;
however, positive ROS1 IHC results should be confirmed by a molecular or cytogenetic method.
1. A sensitivity of ROS1 IHC was 100% relative to FISH or RT-PCR, so tumors lacking ROS1 expression can be safely interpreted as lacking a ROS1 fusion.
2. The specificity of ROS1 IHC is more variable, ranging from 92 to 100% with different methods and interpretive cutoffs.
ROS1 IHCの問題点
ROS1最構成は1％程度の頻度の低い異常であり、一施設のみで十分な陽性コン トロールを集めることは困難。 論文にはいくつかの方法が記載されているが、実際その通りにやっても微妙なところ が異なり、うまくいかない（ように思える <-症例が少なく確信が持てない）。 どの程度の染色感度を持てば、満足な感度をもって検出されているかわからない。IV期非小細胞肺癌
PD-L1 IHC 22C3 EGFR検査 ALK検査 ROS1検査
頻度 30％ 4-5％ 1％ ～30％ DNA抽出 PCR解析 免疫染色 FISH解析 免疫染色 RT-PCR解析 22C3 免疫染色 28-8 免疫染色
免疫チェックポイント阻害剤
免疫チェックポイント阻害剤の効果予測検査
本邦で承認されている免疫チェックポイント阻害剤
• 腫瘍細胞のPD-L1の発現によらない* • 扁平上皮癌、腺癌では効能に差がある。 • EGFR/ALK陽性例にも • 二次治療にのみ *ただし保険償還では問題を生じることがある。 • PD-L1陽性の • EGFR/ALK陰性例に（一次治療） • 一次治療も二次治療もニボルマブ
ペムブロリズマブ
治療ライン 初回治療 二次治療以降 薬剤 ペムブロリズマブ ペムブロリズマブ ニボルマブ PD-L1免疫染色 染色キット 22C3 22C3 28-8 染色の必要性 必須 必須 必要* （コンパニオン診断） （コンパニオン診断） 適応判断基準値 ≥50％ ≥1％ ≥1％ EGFR・ALK陽性 肺癌の有効性 有効性を示すデータがない 遺伝子変化に関係ない 遺伝子変化に関係ない 組織型 有効性に差はない 有効性に差はない 組織型により有効 性の傾向が異なる * 必須ではないが適正使用推進ガイドラインで施行が求められている。
免疫チェックポイント阻害剤にけるIHC
PD-L1 IHC 評価方法について
1.陽性細胞は
腫瘍細胞のみ （リンパ球やマクロファージの陽性像は考慮しない） 少なくとも100個の腫瘍細胞で評価する 細胞膜陽性所見を陽性とする 部分的でもよい 1+程度の弱い染色でもよい 2.腫瘍全体での陽性腫瘍細胞の割合を求める = Tumor
proportion score (TPS)
3.TPSによって以下の臨床的に意味のある分類に分ける
High expression ≥ 50% Low expression 1-49% No expression <1%免疫チェックポイント阻害剤の効果予測検査
ハーモナイゼーション研究
BluePrint German study NCCNS study Yale study AZ study Reference (PMID) 27913228 27389313 28278348 27541827 28073845
Study body FDA, AACR, Parametrical companies, IASLC German pathologists supported by BMS, Roche and AstraZeneca NCCN sponsored
BMS funding Institutional study AstraZeneca directed
N= 39 15 training and 15
validating 90 30 493
Histotypes N.A. 18 ADC and 12 SQC N.A. N.A. 270 non-SQC, 210 SQC, 13 ASC
Sample types Mostly surgical but
few biopsies NA Surgical samples Tissue microarray from Surgical samples
N.A.
Antibody clones 22C3, 28-8, SP142,
and SP263 22C3, 28-8, SP142, SP263 and E1L3N 22C3, 28-8, SP142, and E1L3N 22C3, 28-8, SP142, SP263, 904.9A11, and E1L3N
22C3, 28-8, SP263
IHC Platform Lab developed tests Following the manufacturers’ instructions, except E1L3N Following the manufacturers’ instructions, except SP142 and E1L3N
Lab developed tests Ventana and Dako
Number of pathologists 3 9 16 Quantitation by
image analysis 2
Concordance of the
clones comparable among 22C3, 28-8, and SP263 assays
Staining proportion similar in 22C3 and 28-8, less in, and
more in SP263 Detection of less tumor cells in SP142 and 22C3 than 28-8 and E1L3N High concordance across the antibodies High concordance across the antibodies (>0.9) Intra-observer
variation N.A. N.A.
for tumor cells κ=0.6 to 0.8
(2 tier cut-off) k=0.88 to 0.86 75.9%-97.5%
IV期非小細胞肺癌 PD-L1 IHC 22C3 TPS ≥50% TPS 1-49% ペムブロリズマブを考慮 化学療法を考慮 化学療法を考慮 TPS <1% ニボルマブ治療や その他の治療法を考慮 扁平上皮癌 非扁平上皮癌 ニボルマブを除くそ の他の治療を考慮 *1 PD-L1 IHC 28-8を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮するが、IHC 28-8による再検査が困 難な場合には、PD-L1 IHC 22C3の結果で代用することも可能。 *2 最適使用推進ガイドラインを参照して保険償還に関して注意する必要がある。 *2 *1 EGFR検査 ALK検査 遺伝子異常に応じた分子標的治療 を考慮 EGFR変異 陽性 ALK融合 遺伝子陽性 ペムブロリズマブ治療や その他の治療法を考慮 一次治療後、増悪 ROS1検査 ROS1融合 遺伝子陽性 PD-L1 IHC 28-8を施行してその結果によってニボルマブの適応を考慮す るが、IHC 28-8による再検査が困難な場合には、PD-L1 IHC 22C3の 結果で代用することも可能 (最適仕様推進ガイドラインより）。
