脳 内 硫 化 水 素 産 生 系 と そ の 代 謝 産 物 の 機 能 に 関 す る 研 究

脳 内 硫 化 水 素 産 生 系 と そ の 代 謝 産 物 の 機 能 に 関 す る 研 究

S t u d i e s o f a N o v e l P a t h w a y o f H y d r o g e n S u l f i d e G e n e r a t i o n a n d P h y s i o l o g i c a l F u n c t i o n o f P o l y s u l f i d e

平 成

2 3

年 度 入 学 小 池 伸

(K o i ke , S hi n)

指 導 教 員 石 井 一 行

背 景

近 年 、 微 量 な が ら 硫 化 水 素 が 生 体 内 で 合 成 さ れ 、 様 々 な 臓 器 に お い て 多 様 な 生 理 作 用 を 有 す る こ と が 示 さ れ 、 注 目 を 集 め て い る 。 硫 化 水 素 は 哺 乳 動 物 に お い て

L-cy st e i ne (L -Cy s)

が

cy st a t hi o ni ne

γ

‐l y a se

、

cy st a t hi o ni ne

β

‐sy nt a hse

、

3 m e rca pt o py r uv a t e sul furt ra nsfe ra se

と

cy st e i ne a m i no t ra nsfe ra se (3 M S T / CAT )

に よ っ て 代 謝 さ れ 産 生 さ れ る と 考 え ら れ て き た 。 産 生 さ れ た 硫 化 水 素 は 、

Bo und S u l fu r

と し て 細 胞 内 に 貯 蔵 さ れ る こ と が 分 か っ て い る が 、 そ の 生 理 的 役 割 に つ い て は 、 未 だ 不 明 な 点 も 多 い 。

一 方 、 哺 乳 動 物 の 生 体 内 に は

D-

ア ミ ノ 酸 は 常 在 せ ず 、 生 体 成 分

は 全 て

L-

ア ミ ノ 酸 か ら 構 成 さ れ て い る と 考 え ら れ て き た 。 し か し 、

最 近 で は 分 析 技 術 の 向 上 と と も に 、 体 内 に

D-

ア ミ ノ 酸 が 存 在 す る

こ と が 明 ら か に な っ て き て い る 。 こ れ ま で に 、

D-cy st e i ne (D -Cy s)

を 基 質 と し た 硫 化 水 素 及 び

Bo un d S ul fur

産 生 系 の 存 在 は 知 ら れ て

い な い が 、 筆 者 ら は 、

D -Cy s

を マ ウ ス 脳 ホ モ ジ ネ ー ト に 添 加 す る と

硫 化 水 素 が 産 生 さ れ る こ と を 発 見 し た 。 第 一 部 で は 、 硫 化 水 素 及

び

Bo und S ul f ur

の

D -Cy s

か ら の 生 合 成 経 路 の 解 明 を 試 み た 。 第 二 部 で は 、

Bo un d S ul fur

の 生 理 機 能 を 解 明 す る 目 的 で 、 そ の 酸 化 ス ト レ ス 障 害 に 対 す る 細 胞 保 護 効 果 に 着 目 し 、 典 型 的 な

Bo und S ul fur

種 で あ る

P o l y sul fi de ( so di um t e t ra sul fi de : N a2S4)

を 用 い 、 細 胞 内 抗 酸 化 機 構 を 統 括 的 に 制 御 す る

K e a p1 -N rf2

系 に 与 え る

P o l y sul fi de

の 影 響 に 注 目 し て 検 討 を 行 っ た 。

第

1

部

1 -1

．

D -Cy s

を 基 質 と し た 硫 化 水 素 産 生 経 路 の 解 析

^{1 )}

マ ウ ス 脳 ホ モ ジ ネ ー ト に

L -Cy s

を 添 加 す る と 硫 化 水 素 の 産 生 が 認 め ら れ る 。 こ の 時 、 偶 発 的 に 用 い た

D -Cy s

添 加 に よ っ て も 濃 度 依 存 的 に 硫 化 水 素 の 産 生 が 起 こ る 事 を 見 出 し た

( F i g . 1 A)

。 こ の 産 生 能 は ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 で 顕 著 に 高 い 事 が 分 か っ た

(F i g . 1 B)

。 哺 乳 動 物 に お い て

D -Cy s

か ら 硫 化 水 素 が 産 生 さ れ る と い う 報 告 は な く 、 こ の 硫 化 水 素 産 生 経 路 の 存 在 と 意 義 に 注 目 し た 。

D -a m i no a ci d o x i da se ( D AO )

特 異 的 阻 害 剤 で あ る 、

i ndo l e -2 - ca rb o x y l i c a ci d (I 2 CA )

前 処 理 に よ っ て 濃 度 依 存 的 に マ ウ ス 脳 ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 に お け る

D -Cy s

か ら の 硫 化 水 素 産 生 が 抑 制 さ れ た

(F i g . 1 C)

。 こ の 結 果 か ら 、

D -Cy s

か ら の 硫 化 水 素 の 産 生 に は

D AO

が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。

Fig.1 ^D-Cysを基質としたマウス脳ホモジネートにおける硫化水素の産生

(A)^D-CysまたはL-Cysを添加したマウス脳ホモジネートにおける硫化水素産生量を測定した。

(B) ^D-Cys を添加したときのマウス脳の各画分における硫化水素産生量を測定した。Whole brain の硫化水素産生量を100%として表した。＊＊P ＜0.01 (C)ミトコンドリア画分におけ る DAO 阻害剤の硫化水素産生能に対する影響を検討した。ミトコンドリア画分に DAO 阻害 剤処理後、D-Cysまたは3 mercaptopyruvate(3MP)を添加し硫化水素産生量を測定した。

＊＊P ＜0.01 means±SE , (n=3)

1 -2

．

D -Cy s

経 口 投 与 に よ る 脳 内

Bo u nd S u l fur

レ ベ ル の 変 動

ヒ ト は

D -Cy s

を 主 に 食 品 か ら 摂 取 す る と 考 え ら れ て い る 。 そ こ で 、 マ ウ ス に

D -Cy s

を 経 口 投 与 し た 際 の 脳 内

Bo un d S ul fu r

レ ベ ル の 変 化 を 調 べ た と こ ろ 、

D AO

が 存 在 す る 小 脳 に お い て は 、 経 口 投 与

3 0

分 後 に 、

Bo un d S ul fur

レ ベ ル の 顕 著 な 増 加 が 見 出 さ れ た が 、 投 与

3

時 間 後 に は

Bo u nd S ul fur

は 定 常 レ ベ ル に ま で 減 少 し た

(F i g . 2 A)

。 ま た 、

D AO

が 存 在 し な い 大 脳 で は

Bo und S ul fur

レ ベ ル に 変 動 は 観 ら れ な か っ た

(F i g . 2 B )

。 一 方 、 大 脳 、 小 脳 い ず れ に お い て も

L -

Cy s

の 経 口 投 与 群 で は

Bo un d S u l fu r

レ ベ ル に 変 化 は 観 ら れ な か っ た

(F i g . 2 A , B )

。 こ の 結 果 か ら 、 経 口 摂 取 し た

D -Cy s

は

L -Cy s

よ り も 効 率 的 に 脳 に 到 達 し 、

D AO

が 発 現 し て い る 小 脳 に お い て 速 や か に

Bo und S ul fu r

に 代 謝 さ れ る と 共 に 、 そ の 後 更 に 代 謝 さ れ 、 恒 常 性 を 保 つ こ と が 示 唆 さ れ た 。

1 -3

．

D-Cy s

の 酸 化 ス ト レ ス 障 害 に 対 す る 細 胞 保 護 効 果

硫 化 水 素 に は 酸 化 ス ト レ ス 障 害 に 対 す る 神 経 保 護 効 果 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 我 々 は 、

Bo u nd S ul fu r

に 酸 化 ス ト レ ス に 対 す る 神 経 保 護 効 果 が あ る か ど う か を 評 価 す る た め 、 マ ウ ス 小 脳 初 代 培 養 神 経 細 胞 に 過 酸 化 水 素

(H2O2)

を 添 加 し て 、 酸 化 ス ト レ ス 障 害 を 誘 導 し 、 そ れ に 対 す る

D -Cy s

前 処 理 に よ る 細 胞 保 護 効 果 に つ

Fig.2 ^D-Cy s マウス経口投与による脳内Bound Sulfurレベルの変化

8 mmol/kg body weight D-CysまたはL-Cysをマウスに経口投与後、各時間後における (A)小脳、(B)大脳中のBound Sulfurレベルを測定した。＊P ＜0.05 means±SE , (n=3)

小 脳 大 脳

い て 検 討 し た 。

F i g . 3

に 示 す よ う に 小 脳 初 代 培 養 神 経 細 胞 に

5 0 µ M H2O2

を 処 理 す る と

2 1

時 間 後 に は 約

4 0 %

ま で 生 存 率 が 低 下 し た が 、

D -Cy s

ま た は

L -C y s

を 添 加 す る と 、

cy st e i ne

濃 度 依 存 的 に 小 脳 初 代 培 養 神 経 細 胞 の 生 存 率 が 上 昇 し た 。 こ の 結 果 か ら 、

D -Cy s

、

L -Cy s

共 に 、 酸 化 ス ト レ ス 障 害 か

ら 小 脳 初 代 培 養 神 経 細 胞 を 保 護 す る 効 果 が あ る こ と が 分 か り 、

Bo und S ul f ur

が そ の 保 護 作 用 に 関 与 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 第

2

部

2 -1

．

Bo und S ul fu r

の 細 胞 内 グ ル タ チ オ ン

(G S H )

レ ベ ル に 与 え る 影 響 と 、 そ の 細 胞 保 護 効 果

^{2 )}

硫 化 水 素 の 貯 蔵 体 で あ る

Bo un d S u l fur

の 細 胞 内

G S H

レ ベ ル に 与 え る 影 響 を マ ウ ス 脳 由 来 樹 立 神 経 細 胞 株

N e uro 2 A (N 2 A)

細 胞 を 用 い て 検 討 し た

と こ ろ 、

N 2 A

細 胞 に

2 5 µ M N a2S4

を 前 処 理 し た 後

、

6

時 間 後 に お い て 細 胞 内

G S H

レ ベ ル の 有 意 な 上 昇 が 観 ら れ た

(Fig.4A)

。 こ の 有 意

な 増 加 を 踏 ま え て 、

Bound Sulfur

の

tert-b u t y l h y d r o p e r o x i d e (t - Fig.3 D-C y s の酸化ストレス障害に対 する小脳神経細胞保護効果の検討 マ ウ ス 小 脳 初 代 培 養 神 経 細 胞 に 50 µM H2O2をD-CysまたはL-Cys 各濃度前処 理したときの、細胞生存率を測定した 。

＊＊P ＜0.01. means±SE , (n=3)

Fig.4 Na²S⁴処理による N2A細胞内GSHレベルの変動と細 胞保護効果の解析

(A)25 µM Na2S4処理時の細胞質内 GSH レベルの時間的推移。

(B)各濃度の Na2S4をN2A細胞に2時間前処理後、100 µM t-BHP をN2A細胞に6時間処理した。その培養上清を用いてLDH assay による細胞障害評価を行った。 means±SD , ＊P ＜0.05 (n=3)

B H P )

由 来 の 酸 化 ス ト レ ス 障 害 に 対 す る 細 胞 保 護 効 果 を 評 価 し た 。

1 0 0 µ M t-BHP

を 曝 露 す る

2

時 間 前 に

N a2S4

を 前 処 理 し た 細 胞 は 、 そ の 細 胞 障 害 性 が

N a2S4

未 処 理 の 細 胞 に 比 べ て

N a2S4

濃 度 依 存 的 に 軽 減 さ れ

(F i g . 4 B )

、

N a2S4

が 酸 化 ス ト レ ス に 対 す る 細 胞 保 護 効 果 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。

2 -2

．

Bo und S ul fu r

の

K e a p1 -N rf2

系 に 与 え る 影 響

細 胞 内

G S H

レ ベ ル は

K e a p1 -N rf2

系 に よ っ て 緻 密 に 制 御 さ れ て い

る 。 そ こ で

Bo u nd S ul fur

の

K e a p1 - N rf2

系 に 対 す る 影 響 に つ い て 調

べ た 。

2 5 µ M N a2S4

処 理 に よ っ て

N 2 A

細 胞 の 核 内

N r f 2

の 蓄 積 量 の

増 大 が 、 処 理 後

6

時 間 を ピ ー ク と し て 確 認 さ れ た

(F ig. 5 A )

。 通 常 の

状 態 で は 、

N rf2

は 細 胞 質 内 で

K e a p1

に よ っ て ユ ビ キ チ ン 化 さ れ プ

ロ テ ア ソ ー ム に よ っ て 分 解 さ れ て い る 。 そ こ で 、

Bo und S ul fur

の

K e a p1

に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 非 還 元 条 件 下 で 行 っ た ウ

ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ の 結 果 、

N a2S4

処 理 に よ っ て

1 3 9 kD a

と

1 6 0 kDa

の 二 つ の バ ン ド が 出 現 し 、 約

6 9 kD a

の バ ン ド が 消 失 し た

(F i g . 5 B)

。

K e a p1

の 分 子 量 は

6 9 kD a

で あ る こ と か ら 、

N a2S4

処 理 に

よ っ て

K e a p1

の 立 体 構 造 変 化 が 誘 導 さ れ 、

K e a p1

の ダ イ マ ー 体 が

形 成 さ れ る 事 が 示 唆 さ れ た 。 こ の 結 果 か ら 、

N a2S4

は

K e a p1

の 立 体

構 造 変 化 を ト リ ガ ー と し て

N rf2

の 核 内 移 行 を 促 進 さ せ る も の と 考

え ら れ る 。 ま た 、

N rf2

は 細 胞 質 内 で リ ン 酸 化 さ れ る こ と に よ っ て

核 内 に 安 定 的 に 移 行 す る と 考 え ら れ て い る こ と か ら 、

Bo un d S ul fur

が

P I 3 K / AK T

経 路 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た と こ ろ 、

P I 3 K

阻 害 剤 で あ る

L Y2 9 4 0 0 2

の 前 処 理 に よ っ て

N a2S4

に よ る

N r f2

の 核 内 移 行 が 有 意 に 抑 制 さ れ た

(F i g . 5 C)

。 こ れ は 、

P I 3 K / AK T

経 路

に よ る

N rf2

の リ ン 酸 化 が

N a2S4

に よ る

N rf2

の 核 内 促 進 作 用 に 関 与

し て い る こ と を 強 く 示 唆 す る も の で あ る 。

ま と め

本 研 究 に よ り 、 従 来

L -Cy s

か ら の み 産 生 さ れ る と 考 え ら れ て き た 硫 化 水 素 あ る い は

Bo und S ul fu r

が 、

D -Cy s

か ら も

D AO / 3 MS T

経 路 依 存 的 に 産 生 さ れ る こ と が 初 め て 明 ら か に な っ た 。 今 後 、 摂 取 ま た は 投 与 し た 場 合 に 、

D -Cy s

は

L -Cy s

よ り も 毒 性 は 少 な い 事 か ら 、

D -

Cy s

の 臨 床 的 な 応 用 も 期 待 さ れ る 。 ま た 、 本 研 究 の 結 果 か ら 、

Bo und S ul fu r

は

K e a p1

の 立 体 構 造 変 化 と 、

P I 3 K / AK T

経 路 の 活 性 化 と い う 二 つ の 作 用 に よ っ て

N rf2

の 核 内 移 行 を 促 進 し 、 酸 化 ス ト レ ス 障 害 に 対 す る 細 胞 保 護 効 果 を 発 揮 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ の 事 に よ り 、 こ れ ま で 硫 化 水 素 の み を 反 応 種 と 想 定 し た 様 々 な 生 理 作 用 の 中 で 、

Bo und S ul fu r

が 関 与 す る 可 能 性 を 示 し て い く こ と が 更 に 重 要 に な る 事 が 予 想 さ れ る 。

参 考 文 献

1) Shibuya N., Koike S., Tanaka M., Ishigami-Yuasa M., Kimura Y., Ogasawara Y., Fukui K., Nagahara N., Kimura H., Nature communications., 4, 1366 (2013).

2) Koike S., Ogasawara Y., Shibuya N., Kimura H., Ishii K., FEBS letters., 587, 3548-3555 (2013).

Fig.5 Na2S4処理による Keap1-Nrf2系に対する影響

(A)25 µM Na²S⁴処理した N2A 細胞の核画分における各処理時間での Nrf2のウェスタンブ ロッティング法による検出を行った。 (B)25 µM Na²S⁴処理したN2A細胞の全抽出物におけ る各処理時間での非還元条件下でのウェスタンブロッティング法によるKeap1の検出を行っ た。 (C)15 µM LY294002を30分間前処理または未処理後、25 µM Na²S⁴を6時間処理した N2A細胞の核画分におけるNrf2のウェスタンブロッティング法による検出を行った。