博 士 （ 理 学 ） 宮 本 啓 一
学位論文題名
Study on Mechanism of Cryogelation （クリオゲル形成の機構に関する研究）
学位論文内容の要旨
炎症性疾患血漿に見られるクリオゲル化現象は、細胞性EDA（十）フィブロネク チン（EDA（十）FN）．血漿フィブロネクチン(pFN)．フィブリノーゲン(Fbg)．ヘパリ ン(HP)か らな る熱 可逆 性の 血漿 ゲル化 現象 である。生体内におけるクリオゲル の形 成は 、関 節炎 症反 応の 促進 、抹消 血管 の循環障害等に関与しているとされ るが 、そ の形 成メ カニ ズム に関 しては 明ら かでない。本研究では、このクリオ ゲルをin vitroで再現し、その過程を物理化学的な測定（動的光散乱測定・濁度 測定 ・円 偏光 二色 性測 定・ 透過 電子顕 微鏡 観察）から解析することで、ゲル形 成のメカニズムを明らかにすることを目的とした。
ま ずク リオ ゲル を構 成す る成 分を細 胞お よび血漿から各カ抽出・精製し、再 び組 成比 を変 えて 混合 した 溶液 中の会 合体 形成挙動にっいて検討した。動的光 散乱 測定 測定 から は、 温度 変化 に伴う 流体 力学的な会合体サイズの変化を検討 し た 。
FN/Fbg
、FN/HP
、Fbg/HP
の2成 分系 溶液 では 温度 依存 的な 変化は 見ら れ なか った がFbg/FNHPの3
成分 系で は15℃以 下で 会合 体サ イズ の増加 が見 られ、30
℃ の サ イ ズ で 規 格 化 す ると 、5
℃ で はpFN
を 含 む 場 合 で17
倍 、EDA(+)FN
を 含む 場合 では2000
倍程度増加した(Fig.l)。これは、EDA(+)FN/HP相互作用がFbg 共存 下で 大き く作 用す るこ とに よると 考え られた。濁度測定から温度変化に伴 う会 合体 形成 量の 変化 を検 討し た結果 、Fbg/FN/pFN/EDA(+)FN/HP4成分 系会合 がゲ ル形 成量 が多 く、 得にFN
中 の組成 比(pFN： EDA(+)FN)がゲル形成に大きく 関 わ る こ と が わ かり 、 種 々 の検 討か らク リオ ゲル 化最 適条 件は モル比 換算 でFbg: EDA(+)FN: pFN: HP= 15
：0.05
： 0.95：1
で ある こと を明ら かに した。次 にク リオ ゲル の高 次構 造変 化に関 する 情報を円偏光二色性分光測定により 検討 し、
4
成分 によ る最 適会 合体 形成 条件 でFbgの構 造変 化を 確認 した 。Fbg単 独 で の 測 定 結 果 はpFNを 加 え な い 系 と 同 一 で ある こ と か ら もpFN
によ るFbg
の 構造 変化 作用 が示 唆さ れた 。こ の推測 は、 クリオゲル構造を透過型電子顕微鏡 に よ る 直 接 観 察(Fig.3
） か ら も 支 持 さ れ 、 最 適 会 合 体 形 成 条 件 下 で 作 成0 1 0 2 0 3 0 40 Te mperaturaくoc)
FIl the tcmyntumdopcndmceofWbnC．ヤ 瞬.inBrtiM(vnBo)Of plotan輩g卩ldon卩1耳tekmmr (FbVHP,Fb0■ olutoud．VWOヤは 。 normdirdlOVl30lC (V30)IIwwlltenpcrt一魯I＆mpk iobriom wcre正1ヰcdwith 2lmM HEPES (pH 7J6)，Solution r:mVranrtwI亀 lo暗fdfium邵to SIC．SItaiW凹 幽w■Nt.t 90b Fbi− 轟3Xlザ MFNluXlザMHP一5．4XlずMくHめ ■m5JXld M（lt艸 ′ ） ．
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0
Temperature (oC)
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し た 溶 液 中
(b)
で はFbg
粒 子 （ 繊 維 ） 間架 橋し た網 目状 構造 が形 成さ れ、pFN
を 加え ない 系(a)とは 会合構造が明らかに異なることがわかった。F遍．3 aectron micr08raphs of negatively stained cryogeL Cryogel that farmedmthe grid surf弧eat4℃w終mcdbcfb陀Sta缸 缸gw此2％ 出偲phomsIt岨 錚 伽，acid（negathe sm1血 め ． ロcC恤nmtrographofcry曙clundcrscveralc億 轟6m＆Mag血 血atb珥X 10．000．
以 上 の 結 果 か ら 、 ク リ オ ゲ ル は
Fbg
の 会 合 に 対 しEDA(+)FN
がHP
を 介 し てFbg
粒子 間を 結合 し、pFN
に よるFbg
の構 造変 化が さらに 会合体形成を促進することでマクロなネットワーク構造が構築されゲル化に至ると結論ずけた。
正 常 血 漿 中 の
EDA(+)FN
濃 度 は 総FN
の1
％ 以 下に しか 過ぎ ない が、 炎症 性疾 患患 者血 漿中 のEDA(+)FN比率 は総FN
の およ そ2‑‑‑3％ にま で増大している。本 研 究で 明ら かに した クリ オゲ ル形 成最 適条 件はEDA(+)FNが総FNの5％であり、患 者血漿中の状態がゲル形成最適条件と良く一致していることは生体内の形成 メカニズムのモデルに類似していると考えられる。
以上本研究によルクリオゲル形成の条件およびその会合構造を明らかにした。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査 教 授 西村紳一郎
副査 教 授 駒井 喬（三重大学）
副査 教 授 長田義仁
副 査 助 教 授 佐 々 木 直 樹
学位論文題名
Study on Mechanism of Cryogelation （クリオゲル形成の機構に関する研究）
クリ オゲ ル 化現 象は 、自己免疫疾 患や感染症などの炎症性疾 患血漿に生じる熱可逆性の血 漿 ゲル化現 象で、関節炎症反応の促進 、抹消血管の循環障害等に関 与しているとされるが、その詳 細は明ら かでない。本論文は、クリ オゲル化現象の解明を目的に 、
in vitro
でのクリオゲル再現 過程を種 々の物理化学的測定（動的 光散乱・濁度・円偏光二色性 ・透過電子顕微鏡観察）を駆使 し て ク リ オ ゲ ル の 形 成 機 構 と い う 観 点 か ら 実 験 ・ 解 析 ・ 考 察 を 実 施 し て い る 。はじめにクリオゲルを構成する成分（細胞性EDA（十）フィブロネクチン（EDA（十）FN）．血漿フイ ブ口ネクチン（pFN）．フィブリノーゲン（Fbg）．ヘバリン（HP））の混合溶液中の会合体形成挙動に ついて検 討してしゝる。動的光散乱測定により、温度変化に伴う流体力学的な会合体サイズの変化 を 検 討 した 結 果
EDA(+)FN
とHP
の 相 互作 用がFbg
共存 下で 大き く 作用 する こと で 、会 合体 サイ ズが増大 することを明らかにした。 また濁度測定により、温度変 化に伴う会合体形成量の変化を 検 討し た結 果 、FN中の 組成比(pFN：EDA(+)FN)
がゲル形成に最 も影響することがわかり、ク リ オゲル化の最適条件を明らかにした。次に クリ オ ゲル の構 造を円偏光二 色性分光測定から検討し、
pFN
によるFbgの構造変化効果 を 発見した 。また透過型電子顕微鏡に よる直接観察から、クリオゲ ル形成条件下ではFbg
粒子間 で 架橋した 網目状構造が形成され、pFN
を加えない系とは会合構造 が全く異なることも明らかに し た。最 後 に 以 上 の 結 果 か ら 、 ク リオ ゲル は
Fbg
の 会 合に 対しEDA(+)FN
がHP
を 介し てFbg粒 子間 を 結合 し、pFN
によ るFbg
の構造変化 が更に会合体形成を促進す ることでマク口なネットワー ク 構造が構築され、その結果としてゲル化に至ると結諭している。以上の ように申請者はクリオゲル 形成条件とゲル構造に関する 多くの知見を示した。即ち本論
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文は、クリオゲル形成機構解明に関する重要な発見と、生体内での炎症性疾患の病態解明に貢献 する形成モデルの提案が含まれており、審査員一同はこれらの成果を高く評価し、北海道大学博 士（理学）の学位を授与される資格あるものと認めた。
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