テルモ株式会社
テルモメディカルプラネクス高 橋 誠
Terumo cop. Terumo Medical Pranex Makoto TakahashiIn the two series, we have introduced the basics of Swine experiment operation and IVR techniques from
the IVR Summer Seminar
‘03. This time, as a repetition of the previous series, we will present the method
of the angiogram of the uterine artery and bile duct of the Swine, the receiving of swine and anesthesia as
the practice of animal experiment.
はじめに
IVR 学会学術夏季セミナーで行った, IVR の動物実験 基礎と手技についてのまとめを, 稚拙ながら IVR 学会誌 に 2 回掲載させていただき, 動物概要と血管造影像を紹 介した。今回は掲載の折り返しということで, ブタの子 宮動脈の造影, 胆管造影と, 動物実験の実際として, ブ タの受け入れ, 麻酔方法を紹介する。ブタの子宮, 胆管系
1. ブタの繁殖と生殖器について ブタの雄は 7 ∼ 7.5 ヵ月で受精可能な精子を形成でき るようになる。実際の繁殖には 10 ヵ月後を供用するこ とが多い。ブタの雌では系種によって異なるが, 食用の 大型豚で 6 ∼ 8 ヵ月前後で性成熟するといわれている。 ただし小型種の方が成熟が早い傾向にあり, 栄養状態等 でも異なる。実際の繁殖には 9 ∼ 10 ヵ月を供用するこ とが多い。 ブタの性周期は 21 日周期で, 左右の卵巣から十数個 排卵され, 一度に生まれる仔数は 2 ∼ 14 頭である。な お, 妊娠期間は 114 日である。 Fig.1 に示すように卵管に続く 2 つの子宮角とそれら が合致した, 子宮体及び子宮頸になる。 子宮頸部は螺旋状に狭くなった管として認められ, 子宮 頸部の後端は他の家畜とは異なり膣部の粘膜の明確な 境界なしに膣粘膜へ移行する。 Fig.2 に示した雄の陰茎先端の形体は, 雌の子宮頸部 の螺旋状に適した形体が伺える。 Fig.3 に雌畜の生殖器（子宮）における動脈の分布を 示す。ブタの子宮に分布する血管は子宮卵巣動脈から 分かれた前子宮動脈と, 内腸骨動脈から分枝した中子宮 動脈と後子宮動脈からなる。中子宮動脈は子宮間膜を 伝わって子宮角及び子宮頸部に分布し, 後子宮動脈の一 部は膣部に一部子宮頸部に分布する。中子宮動脈は妊 娠した子宮角側が発達する。 雌ブタを使用した子宮関連実験には, 食用ブタを用い る場合 9 ∼ 10 ヵ月令から成熟し始めるが, 体重も重くな り 100o ぐらいとなり, カテ台にのせられない。そのた ＜食肉用＞ ＜実験用＞ランドレース等（中型） ミニブタ Yucatan miniature pig 等
新生仔 1 ∼ 2o 0.5 ∼ 1o 体重 100 ∼ 150o/150 ∼ 200 日 20 ∼ 60o/100 ∼ 200 日 体重増加率 0.2 ∼ 1o/日 0.2 ∼ 1o/日 繁殖適齢期 ♂ 10 ヵ月 ♀ 9 ∼ 10 ヵ月 8 ∼ 9 ヵ月 妊娠期間 114 日（産仔数 4 ∼ 14 頭） 114 日（産仔数 2 ∼ 9 頭） 寿命 15 年∼ 25 年 15 年∼ 20 年 Table 1 食用ブタ（大型ブタ）とミニブタの繁殖による比較1, 2）
めミニブタという 1 年以上飼育しても 40 ∼ 50o に体重
が留まるブタを使用するほうが良い。
使用する際は, 経産ブタを用いることと, 大凡の性周 期に合わせ発情が造影当日に合うように, ホルモン （pregnant mare serum gonadotrophin）注射を実験の 2 ∼ 3 日前に投与することで, 以下の造影像が得られた。 Fig.4 に, 左内腸骨動脈から後子宮動脈起枝部までの 造影像を示す。前回紹介したがブタは大動脈から内腸 動脈と外腸骨動脈が分かれ, 今回提示したのは内腸骨動 脈から後子宮動脈への像である。 Fig.5 に, 子宮頸部から子宮角に至る子宮動脈血管像 を示す。子宮角で左右の子宮動脈が合流している。 2. 胆管造影 Fig.1 雌ブタの生殖器の解剖2） Fig.2 雄ブタの陰茎 先端3） Fig.3 雌畜の生殖器（子宮）における動脈の分布2） Fig.4 後子宮動脈起枝部の造影像 （1 ：後子宮動脈起枝部, 2 ：内腸骨動脈） Fig.5 子宮動脈の DSA 像（マイクロカテーテル2.7 Fr.） （1 ：子宮頸部の血管像, 2 ：子宮角の左に向 かう子宮動脈） 外科的切開により胆嚢を露出し, 胆嚢をタバコ縫合し て シ ー ス を 固 定 し て 胆 道 経 由 に て 造 影 を 実 施 し た （Fig6, 7）。我々は, 十二指腸内視鏡を持っていないた め, 豚の経十二指腸内視鏡による造影方法は実績がな い。十二指腸内視鏡の参考として, ｢Anesthesia, & Experimental Techniques in Swine｣1）
の Endoscopic / Laparoscopic Surgery の章を確認いただくことをお勧め する。 Fig.6 に示すように胆嚢胆管は胆嚢付近で湾曲してお り, ワイヤー等挿入時は胆嚢内への胆管開口部には慎重 な確認が必要である。Fig.7 は胆嚢管の中にシースを進 め, シースの先端は胆嚢管の総胆管への開口部付近まで 進めて造影した時の DSA 像である。
以上が造影の説明である。 次に, これから実験に際しての注意点と, 我々の実施 している麻酔方法について解説する。
実験を始める前に
近年, 動物愛護及び実験再現性の観点から, 飼育環境 及び実験操作については規定を制定し, それに基づき実 験を行うことが必要である。 ① 飼育環境ついては, 飼育動物種毎にケージの大き さや空調換気等が設定されており, 大学などの研究施設 でも実験への信頼性から各施設で基準を定め, それに基 づき運営されていることは, マウス・ラット等の小動物 では知られている。ブタに対する基準は設定されてい ないため, 大動物に準拠して運用する4, 5） 。 ② 実験処置についても麻酔方法6, 7） , 動物の疼痛8∼10） , 安 楽死11, 12） について適正に実施される必要がある。でき れば基本的なガイドラインを作成し, それに基づき実験 計画・実施を適性に行うことが必要である。 Table 2 に示されるように日本では管理基準は設定さ れていないが, 通常各施設でアメリカあるいはヨーロッパ の基準に適合する形に設定をし, それに基づき実験を実 施する。あるいは, 実験担当者が管理基準を実験計画書 に明記し, それに基づき実験を実施している場合もある。 動物愛護と実験の関係を述べる14, 15） 。以下に動物愛護 の精神の抜粋を示す。 動物愛護と実験の基本は, 動物が受ける苦痛を理解す ることにある。 ① 動物が過度の肉体的, 社会的および環境的因子を 受けたとき, 動物は苦痛を被り, ストレス反応を引き起 こし, 動物の通常の生理状態を大きく変動させる。 ② 動物に苦痛を生じさせる可能性のある場合, 実験 者は適当量の 麻酔薬, 鎮痛薬, 静穏薬などを動物に予 Fig.6 豚の胆嚢の造影像 シース 8 Fr.（1 ：胆嚢, 2：胆嚢管, 3：胆嚢管の総胆管への開口部） Fig.7 豚の胆嚢の造影像 シース 8 Fr. （1 ：総胆管, 2 ：乳頭, 3 ：肝内胆管） アメリカ合衆国 ヨーロッパ連合 日 本 動物福祉法(1966, 85 改) 実験動物の保護についての法 動物の愛護及び管理に関する法律 根拠法令 保健研究拡張法(1985, 96 改) ・行政規定の適正化に関する (1973,99 改)→実験動物の飼養及 →農務省･NIH 行政令 指令(1986) び保管等に関する基準(1980) →各国国内法令 研究施設, 仲介扱者, 輸送者 実験実施＝許可制 登録、許可制等の公的規制 実施者 ＝登録制 動物飼養者＝登録制 なし 及び施設に 行政当局：査察権限。 実施施設＝登録 or 許可制 対する規則 上記に関する公務執行妨害に 違反に対する刑事罰は各国内 罰則なし 罰金 法による イヌ, ネコ, サル,モルモット, イヌ, ネコ, サル, モルモット, ほ乳類 及び 鳥類 対象動物 ハムスター, ウサギ, 他 ハムスター, ウサギ, マウス, 及び (対象外 : マウス, ラット, 鳥類) ラット, ウズラ 飼養要件に関する 飼養要件 動物管理基準あり 動物管理基準あり 具体的数値基準なし （農務省, NIH） 備 考 施設に動物実験管理委員会の 設置を義務づけ Table 2 動物実験管理体制の国際比較13 ∼ 15）め投与し, 発生する苦痛を事前に防止する配慮が必要で ある。 ③ 無拘束あるいはそれに近い状態の動物に処置を施 す事で, 処置に対する動物の反応をより明確に捉える事 が可能となる。 具体的には①飼育環境や飼育頭数が適切な（動物にス トレスを与えない）状態で飼育する。②できる限り動 物に苦痛を与えないようにし, 適切な麻酔や鎮痛薬を計 画的に施す。③無理な拘束や長時間に及ぶ拘束はしな い。また生命尊重かつ最小限での効果を得るために, sacrifice は最小にすることは必要だ。これらを理解し遵 守する必要がある。逸脱する場合には, 納得させるべき 理由を説明する必要があり, 海外論文等で麻酔（疼痛管 理）の説明が求められることもあり, 研究者として十分 考慮して実験を行うことが必要である
実験前飼育
本シリーズの第一回で述べたようにブタは呼吸器感 染等にかかり易く, 供給先から搬入した際, 実験に適し たものかどうかを, 体重測定や受け入れ検査により確認 する。呼吸器の異常なブタを見出した場合には, 受け入 れを拒否した方が良い。さらに輸送中のストレスと飼 育環境の変化で, 急な下痢や鼻汁, 咳を出すものもあ る。その場合は他の飼育動物へ影響しないように, 速や かに隔離し, 抗生剤等の投与などで治療する。 実験当日までの流れの一例を示す。 実験当日までの流れ（例） ①受け入れ検査：搬入業者からの提出書類の確認, 外貌 検査, 呼吸器の異常有無, 血算, 体重測定, 体洗浄。 ②馴化期間：実験 1 週以上前に搬入が望ましい。（飼育 環境に慣らす, 摂食, 糞便等健康状態の観察） ③異常個体の隔離と治療：異常な個体は速やかに検疫 室等の別室に移して, 必要に応じて治療する。ただし 呼吸器異常についての対応はコロニー全体へ蔓延す るので, 適切な淘汰処理が必要になる場合もある。 ④事前の投薬の開始：例えばインターベンションを行 う場合, アスピリン約 20m/o 経口投与（抗血栓用） チクロピジン, カルシウム拮抗剤も必要により投与する。 ⑤実験前日より絶食：水は自由摂取 以上のように, 異常の有無や健康状態確認を行う受け 入れ検査と, 実験に用いるまでの一定期間の検疫と飼育 環境順化を行う。次に問題なければ, 事前の投薬や実験 前日の絶食を行い, 実験当日に臨むことになる。麻酔方法について
ブタは非常に神経質な動物である。補綴等により興 奮状態に陥り, 規定の麻酔薬投与量でも十分な麻酔深度 が得られない場合や, ストレスによる体温の上昇もあ り, 麻酔管理がしにくくなる。そのため, 筋肉注射によ る鎮静剤の投与を実施した後, 静脈麻酔またはケタミン 筋肉注射による導入麻酔を実施した方がスムーズな麻 酔状態が得られる。 麻酔方法については多くの方法があり実験の手技や 目的により更にいろいろな方法があり1） , 慣れている方 法が実施しやすいことは明快である。ここでは我々が 行っている方法を以下に紹介する。 ①前投与薬及び鎮静薬：臀部に筋肉注針で Atropine （0.05m/o）と azaperone（4m/o, 鎮静剤：商品名： ストレスニル）投与 ②導入麻酔薬：①投与後約 5 分から 10 分後, ketamine （5 ∼ 10m/o）を筋注投与 ③維持麻酔（気管支挿管より） ガス： N2O : O2=1 : 1 1.5 ∼ 4 ％ 流量： 5 ∼ 10p/o/x （だだし, 麻酔深度及び酸素濃度の許す範囲で可変実 施, 40kg で各ガス 2L/x 程度） 吸入麻酔薬： seboflaaene（導入時は 4 ％, 維持は 1.5 ∼ 3 ％） 麻酔の注意点は, ブタでは大きくなるにつれ脂肪が増 えることもあり, 大型になる程体重当たりの導入麻酔投 与量は多くなる。またケタミンの効果は 30 分程度であ り, ケタミンだけでは十分な筋肉弛緩は得られないの で, マスク等にてセボフレンの吸入麻酔をした後, 気管 挿管する場合もある。 セボフレンの濃度は笑気を入れた場合, 維持麻酔 2.5 ％（麻酔器メモリ）程度でも麻酔状態が得られる。 笑気がない場合は 3 ％以上必要になる。カテーテル手技 実験など外科的ダメージが少ない 3 時間を越える実験な どでは, 笑気濃度を増やしても, セボフレンによる吸入 麻酔だけでは十分効かなくなることがある。このとき は鎮静薬（azaperone など）の追加で十分な麻酔状態を 得られることが多い。呼吸状態の悪くなった状態で, 酸 素流量の確保を優先し, 笑気の追加ができない場合は有 効な手段であろう。 施設によりセボフレンでない気化器の場合もあるの で, 参考までに「Surgery, Anesthesia, & Experimental Techniques in Swine」1） によれば豚の吸入麻酔薬の MAC は笑気で 195, ハロタン 0.91 ∼ 1.25, イソフレン 1.2 ∼ 2.04, デスフルラン 8.28 ∼ 10 である。 また, ブタは腹部臓器が大きいため仰臥位では, 腹部 臓器による横隔膜への圧迫から換気量が減少する。ま た, 前肢補綴により胸郭のコンプライアンスの低下をも たらし, 十分な呼吸が得られない場合があり, 麻酔によ り自発呼吸が停止する場合もある。特に 50o 以上のブタでは起き易く, さらに, 腹部臓 器重量で静脈が圧迫され循環血流量が減少することも 予想され, 長時間に及ぶ実験では自発呼吸だけでは炭酸 ガスの蓄積による循環障害が起こることがあるので, 強 制呼吸器による呼吸管理とサチレーションモニターに よる呼吸状態の確認をお勧めする。 また, 麻酔による代謝機能の低下等により体温が低下 していくので, 急性期の実験でなければ麻酔後のヒート マットや湯たんぽ等による復温を実施すべきである。 実験後に十分な復温がなされずに, ケージにそのまま戻 してしまうと, 体調が急変してしまい良好な結果が得ら れない場合もある。 参考に代表的な他の麻酔薬及び麻酔ルートを提示す る1, 6, 7） 。 （前投与薬）
・Anticholinergics : Atropine（0.05m/im or 0.02m/o
iv）and glcopyrrolate（（0.004 ∼ 0.01m/o/im）
・ Tranquilizers（麻酔に記載） （注射麻酔）
・ketamine 15m/o and azaperone 2m/o（20∼30x）
・ketamine 33m/o and midazolane0.5m（flowed by 8 ∼ 33m/o/h and midazoolam0.5 ∼ 1.5m/o/h）
・ ketamine 20m/o and xylazine21m/o
・pentobarbital 20 ∼ 40m/o（flowed by 5∼40m/o/h）
（吸入麻酔）
・N2O : O2=1 : 1 or 2 : 1 with 1.5 ∼ 4 ％ inhalotan or 1.5
∼ 4 ％ seboflaaene
・Muscula : pancuronium（0.5m /o ）（flowed by pancuronium（0.2m/o/h））
・ Ventilation Rate 12 ∼ 15beats/x（20 ∼ 40kg）
・ Tidal volume 5 ∼ 10p/o
・ Ventilatory pressure 18 ∼ 22b H2O 我々の麻酔方法の問題として, セボフレンの吸入麻酔 時, スムーズな麻酔導入にも関わらず, 体温上昇を示す ものの頻脈, 不整脈, 血圧の不安定, 高い炭酸ガス濃度, 低酸素を示す例を認めた。セボフレンの影響なのか, ス ト レ ス に よ る 異 常 代 謝 な の か 不 明 で あ る 。 以 前 azaperone が入手できない時期があり, このような頻脈 のブタがあったことから, ストレスによるものが主と考 えられる。しかし, こういった事例は現在のところ強制 呼吸器による呼吸コントロールと補液による血圧調整 の対処療法を施せば, 問題ないレベルにある。我々は経 験上, ある頻度でブタには起こりうることと理解してい るが, 今後の検討すべき点であろう。 次回は動物の取り扱い手技の実際を予定する。 謝辞 今回, ブタの子宮動脈の造影像を提供して頂いた静岡市立 静岡病院 画像診断科 宮本信一先生に感謝申し上げます。 【文献】
1）M. Michael Swindle : Surgery, Anesthesia, & Exper-imental Techniques in Swine, Iowa State Press, 1988. 2）｢家畜臨床繁殖学｣, 星 修三, 山内 亮, 朝倉書店, 東京, 1985, p17, 19. 3）｢家畜比較解剖図説｣, 下巻, 加藤喜太郎, 養賢堂, 東 京, 1983, p360 ∼ 418. 4）日本建築学会編：平成 8 年版 ガイドライン・実験動 物施設の建築および設備ガイドライン アドスリー （1996 年）
5）National Research Council (USA) : Guide for the care and use of laboratory animals National Academy Press（1996）.
6）Laboratory Animal Anaesthesia-An introduction for research workers and technicians, P. A. Flecknell, Academic Press, 1992.
7）Formulary for Laboratory Animals, C. T. Hawk and S. L. Leary, Iowa State University Press/Ames, 1995. 8）IASP : Ethical standards for investigations of
experi-mental pain in animals., Pain 9, 141 - 143,（1980）. 9）Board of Trustees of the Scientists Center for Animal
Welfare (1985) : Consensus Recommendation on Effective Institutional animal Care & Use Commit-tees. Lab. Anim. Sci., Special lssue, Jan. 1987. 10）「実験動物海外技術情報」No. 7, page 16,（（社）日 本実験動物協会, 海外技術情報調査小委員会編集, 昭和 63 年 1 月 20 日発行）. 11）実験動物の飼養及び保管等に関する基準の解説：実 験動物飼育保管研究会編, 内閣総理大臣官房管理室 監修, 昭和 55 年, ぎょうせい.
12）2000 Report of the AVMA Panel on Euthanasia, J. Amer. Veterinary Med. Assoc., 218, 669-696, 2000. http://www.avma.org/.
13）ISO10993 - 2 Animal welfare requirements（1992 年発 行）.
14）医学生物学領域の動物実験に関する国際原則（1985 年 CIOMS）
15）動物の愛護及び管理に関する法律（平成 11 年 12 月 22 日改正 法律 第 221 号.
