3号 （3月 ）2014〕 139
原
著
血
中低
カ
ル
ボ キ シ
ル
化
Matrix
Gla
Protein
（
ucMGP
）濃 度測 定 法
の
開発
と血
管
の
ビ タ
ミ
ン
K
栄
養
評
価
に
お け
る
有
用
性
の
検
討
＊ 1神戸薬 科 大 学 衛 生 化 学 研 究 室＊t
！ 成 入 病 診 療 研 究 所津川
尚子
1，金森
健悟
1，澤
田夏美
1，高瀬
友 貴
1，中
山智恵
1，藤
田朋 子 1
，
井
上玲香
1，
金月 真 央
且， 内野 由
理 ’， 白木
正孝
2， 岡野 登
志夫
且 Vitamins（Japan），
88（3），
139−
144（2014）Development
ofAssay
Method
for
Plasma
Concentration
of
Un
“ercarboxylatedMatrix
Gla
Protein
（
ucMGP）
， andlts
Usefulness
in
Estimation
of
Vascular
Vitamin
K
Status
．
Naoko Tsugawa1
，
Kengo
Kanamorii
，
Natsumi
Sawadai，
Tomoki
Takasei，
Chie
Nakayamai，
To皿 oko Fujita1，
Reika lnoue1
，
Mao KingetsuJ， Yuri Uchinoi
，
MasatakaShiraki2
，
ToshioOkano1
‘Departmentof Hygienic Sciences
，
Kobe Pharmaceutical University 2ResearchInstitute and Practice for lnvolutional Diseases
Matrix Gla protein（MGP ）is
known
as a potent vascular calcificationinhibitor
．
MGPis
a vitaminKdependent
protein （VKDP
）whichis
activatedby
gamma −
carboxylation ofGlu
residues （Gla
）in
thepresence
of vitaminK ．
lt
is
considered thatplasma
concentration efundercarboxylatedMGP
（ucMGP ）willbe
usefU1 as the rnarkerfor
vascular vitaminK
statUs．
However，
a method to accurately quantify the plasma ucMGP concentration has not been well established．
In present study ， we have developed the assay methodfor
plasma
concentration of ucMGP ， and which could
be
concluded tobe
a usefU1 markerin
the
estimation ofvascular vitaminK
statUs．
Key words ：Matrix Gla protein， ucMGP ， Vascular calci且cation ， Vitamin K， Vitamin K status
（Received December 24
，
20／3
）緒
言
Matrix
Gla
Protein
（MGP
）は，1983
年 に 発 見 さ れた分 子 量 約10kDa
の分 泌 タン パ ク質で 1），84
個の ア ミノ 酸か ら構成 さ れ，
主に血 管平 滑筋で産 生 さ れ る 2）3〕．
MGP 遺伝子 欠 損マ ウス は重篤 な血管石 灰 化 を発 症 し て死亡する 4）こ とか ら，
MGP は強 力 な 血 管 石 灰 化 抑 制 因 子 と考えら れ てい る．
また，
MGP は ビ タ ミン K 依 存 性 タン パ ク質 （VKDP ）の 1つ で あ り，
Prothrombin （PT ）やOsteocalcin（OC ）と同 様にビ タミン K に よっ て グル タミ ン酸 残 基 （Glu
）の y位 がカルボ キシ ル化 （Gla
化）さ れるこ とで生 理 活 性 を発 揮 する s〕．MGP
は，
N 末か ら 2，
37，
41，
48，
52 番目の 5 つ の Glu 残基が Gla化修飾 され6 〕，
また，
N 末か ら 3，
6，
9 番目の 3 つ の セ リン残 基 がリン酸 化 さ れるこ とが 報告さ れ てい る7 ｝．
Gla 化 修 飾を受 けた MGP は産生 組織中で機 能を ＊140 津川 尚子
，
金森 健 悟，
澤田 夏美，
高瀬 友貴，
中山 智恵，
藤 田 朋 子，
井上 玲 香
，
金月 真央，
内野 由理，
白木 正孝，
岡 野 登 志夫 〔ビタ ミ ン 88巻 発 揮 する が，
Gla化 されなかっ た低カル ボ キ シ ル化MGP （ucMGP ）は血 中に放 出さ れ る
．
こ の こ と か ら，
ucMGP の 血 中濃度はPT やOC の 低 Gla化 体 で あ るProtein
Induced
by
Vitamin
K
Absence
orAntagonists
−II
（PIVKA II），
Undercarboxylated Osteocalcin（ucOC ） な ど と同 様に ビ タ ミン K 栄 養の 充 足・
不 足 指 標とな り，
特に 血管に お け る ビ タ ミン K 栄 養マー
カー
とし て の意 義を もつ可能 性が高い が，
血中ucMGP 濃度 を 正確に 定 量 する方 法 は 充 分に確 立 さ れてい ない．
精 度の高い 血 中ucMGP 濃 度測定 法の開 発は，
ビ タ ミン K の血管 作 用 を 明 らかにする た めに 有 用であ り，
その臨 床 応 用 は様々 な疾 患に お け る ビ タ ミン K 必 要 量の評価に 利用 するこ と がで き る，
血管 中 膜の石灰化を伴 うメ ン ケベ ル ク型 動 脈 硬 化 症 は，
特に リン・
カルシ ウム代 謝 異 常 を伴 う慢 性 腎疾患 （CKD ）や糖尿病患者に お い て発症 しや す く，
生命 予 後に深 く 関 与 する．
この た め に，
こ れ らの疾 患 患 者に お け るビタ ミン K 必 要量は健 常 者 と 異な る可 能 性も高い もの の詳 細な検 討は行わ れて い な い．
このような背景か ら，
わ れ わ れ は 精 度の高い血 中 ucMGP 濃 度測 定 法が 必要 と考え，
ELISA に よ る ラ ッ トおよ びヒ ト血 中ucMGP 濃 度 測 定 法を開 発 し，
血管 に お け る ビ タ ミ ン K 栄 養マー
カー
と して の 血中 ucMGP 濃 度の有 用 性につ い て検 討した．
方 法
1
）試薬a）抗原ペ プ チ ド：G】a化を受ける グル タミ ン酸 残基4 箇 所 を含 むucMGP の
35
か ら54
アミ ノ酸 残 基（35−
54 ） を 認 識部位 とする た め に作 成したucMGP （35−
54 ）−
Key−
hole Limpet Hemocyanin （KLH ）conjugate
．
ラッ トucMGP抗 原ペ プ チ ド：N 末 端
一
AQERvRELNKPAQEINREAC−
（KLH ）とヒ トucMGP 抗 原ペ プ チ ド：N 末 端
一
VQERIR−
ERSKPVHELNREAC−
（KLH ）を，
オペ ロ ンバ イオテ ク ノロ ジ
ー
社で 依 頼 合 成 した．
使 用 時に，
抗 原ペ プ チ ドComplete （50 ％ KLH conjugate ucMGP （
35−
54）と 50 ％Freund’
s A〔ljuvant：Complete （S夏GMA 社 製 〉を200μL／
匹となる ように混 和 したエ マル ジ ョン溶 液）と抗原ペ プ チ ドIncomplete（50％ KLH conjugate ucMGP （
35−
54）と 50％ Freund’
s Adjuvant：lncompleteを100μL／匹 とな るように混 和 したエ マ ル ジョン溶 液 ）と して調 製し た
．
b
）標 準 液 ：大腸 菌で発現さ せ て調 製 したラッ トあるいはヒ トの リコンビナン トfU11 length ucMGP （1
−
84）を標準品として用いた
．
鮮 液の調 製 には 25 mmoYL ホ ウ酸 緩 衝液 （pH 7，
4）を用い た．
c）標 識 抗 原 ：ビ オ チ ン標 識 し たラ ッ トお よ びヒ トucMGP （35−
54 ）（オペ ロ ン バ イ オ テ クノ ロジー
社に合 成 依 頼 ）をlnmol1L
となる よう調 製 した．
d）緩 衝 液 （PBS ）：Na2HPO41．
15 g，
NaH2PO4295 mg，
NaC19g を 水で 溶 解し，
全 量 を1L に調 製、
e）洗 浄 液 （PBS−
T ）：Tween−
20 （和光純薬社 製）を0，
05％とな る よ うPBS
に 添 加 した．
f
）ブロ ッキング 溶 液 ：Blocking One （ナ カ ラ イ テ ス ク社製 ）を20％ になる ように水で希 釈した溶液．
g）発 色試 薬：NeutrAvidin−
HRP 溶液 （Anti−
Mouse lgG antibody，
HRPlabeled
：KPL 社 製 ），
Peroxi
−
dase Substrate Tablet Set （SIGMA 社 製）お よびTetrameth−
ylbenzidine（TMB
）（TMB
Substrate
Kit
：Therrno
FisherScientific社 製）を使用
，
h
）反 応 停 止 液 ：lmol1L
硫 酸 i）力 価 測 定 用 96穴プ レー
ト：イ ム ノプレー
ト96−
well マ キシソー
プ （NalgeNunc 社 製 ）．
j
）ELISA 用96
穴プレー
ト： Precoated（Goat Anti−
Mouse IgG ）EIA 96−
WeU Strip Plate（
Cayman
社 製 ）2
）ucMGP 抗 体の作 成 ucMGP の 特 異 的 抗 体 を 得 るため に6
週 齢の 雌 性 Balb！cマ ウス （日本SLC 社）3匹 に 対 し て免 疫 を行っ た．
1
回 目の免 疫では，
ラッ トあ るい はヒ トucMGP 抗原ペ プチ ドComplete を 投与し，
そ の後2
週 間 お きに抗 原 ペ プ チ ドIncompleteを3回投 与し た．
抗 原ペ プチ ドは，
背 部 皮 下 注射に よ り2回に分 けて投 与し た．
最 終免 疫 後，
マ ウス尾 静 脈 血 を 採 血 管 （HEPARINIZED CAplL−
LARY TUBES 匚Chase 社 製 ］）を 用い て20μL 採 取 し，
PBS
で100
一
24300 倍希釈 して血清力価の確認 を行っ た，
血 清 力 価の確 認 は，
大 腸 菌 を 用い て作 成 した ラ ット お よびヒ トの リコ ン ビ ナ ン トfull lengtlユucMGP （1
−
84 ）を定 着 させ た イム ノプ レー
トを 調製し た後 希 釈 血 清 を添 加 し，
HRP 標 識の 二 次 抗 体 （抗マ ウ ス IgG 抗 体 ）を用い て発 色させ るこ と によ り行っ た．
血 清 力 価 確認後，
マ ウス の脾臓 を摘 出し て脾 細 胞とP3UI を 細 胞 融 合 さ せ，
HAr 培 地 を加 え たハ イ ブ リ ドー
マ を lo5 cells 〆well1200 μL と なる ように96穴 プレー
トに播 種 し，
力 価の確 認と共に シングル コ ロ ニー
を作成 し てモ ノ ク ロー
ナル抗 体を得た．
ま た，
ウ ェ ス タン ブロ ッテ ィ ン グ に より抗 原認識 特異性の評 価 を行っ た．
3
＞Enzyme−linked
immunosorbent
assay （ELISA
）抗マ ウス IgG ヤ ギ抗 体 をコ
ー
テ ィン グ した96 穴プ レー
ト を洗浄液 （PBS−
T ）で 3回洗 浄 し た後，
10％ ウシ 胎 児 血 清 （FCS
）含 有PBS −
T で希釈 したucMGP 抗 体の 0．
25μg〆mL 溶液を100
μL
ずつ 添 加 し，
室 温，1
時 間 静 置し てプレー
トに結合さ せ た．
洗 浄 液で 3回洗 浄した 後，
標 準 溶液 （1．
1〜
1620nmol ／L ）ま たは血漿 検体 と標 識 抗 原 溶 液の等 量 混 合 液 100μL を添加し た．
室 温で 1 時 間静置 し た後に3回洗浄 し，
NeutrAvidin−
HRP 溶 液3号 （3月 ）2014〕 血 中ucMGp 濃 度 測 定 法の開 発と ビタ ミ ン K 栄 養 評 価 141
を100μL加え た
．
室温で 1時 間 静 置 後，
3回 洗 浄 し，
発 色 液
100
μL
を加 え た．
室 温で7
分 程 度 反 応 させ た 後，
反 応停止液 100μLを加えて反応 を停止さ せ た
．
そ の後，
マ イ クロ プ レー
ト リー
ダー
（Benchniark［BIO−
RAD 社 製D
を 用いて，450nm
お よび655
nm （対 照 波 長）で吸 光 度を測 定し た．
4
）精 度評価 添 加 回 収 試 験 希釈 試 験 同 時 測 定 再 現 性，
日差 再 現 性 を 検 討 し た．
添 加回収 試 験で は、
血漿に 同容 量の ucMGP （1−
84 ）25，
50，100， 200 nmol1L を 添加し，
最終添 加 濃 度 12．
5，25，50，100nmol ／L を 調 製 して用い た．
希 釈 試 験には 血 中ucMGP 濃 度 が 高 値 と予 想される ワ ル フ ァ リン投 与ラッ トあるい はワ ル フ ァ リン服 用 患 者の 血 漿 を用い た．
その 他の試 験に は，
正 常ラッ トあるい は健常成人の血漿を用い た．
また，
ヒ トgla化 MGP （35−
54）ペ プ チ ドと反 応 し ない こ と も確認した．
競 合 的ELISA 法に よ る測 定 条 件 を検 討し た結果，
リコ ン ビナン トucMGP （1−
84 ）を標 準品 として 1，
1〜
1，
620nmol1L
の 範 囲で 良 好 な 標 準 シグモ イ ド曲線 を得るこ とが で きた．
希 釈試 験で は，
原点を 通る直 線 回 帰 式の傾 き及び相 関係 数はT ラ ッ トucMGPELISA
で 傾 き＝
1．
116，
r＝0，
976 （図 1），
ヒ トucMGP ELISA で 傾 き≡
1．
131，
r＝
0．
998 （図2）で あっ た こ と よ り，
良 好 な 希 釈 直 線 性 が 得 られ た と判 断 し た．
添 加 回 収 試 験に おいて も，
ほ ぼ 100％の 回収率が得 ら れ た （表 1，
2）．
ラ ッ トucMGP ELISA の同 時 測 定 再 現 性お よ び 日差 再 現 性 試 験の変 動 係 数 （CV
）値 は 各々 4．
2％，
9．
O％ であり （表 3），
ヒ トucMGP ELISA の同時測定再 現性，
日差 再 現 ［生試 験のCV
値は各々4．
0
％，
5．
0％ （表4）で，
測 定 精 度 とし て は ほ ぼ良 好であると判 断さ れ た．
こ れ らの こ と か ら，
開 発 したラ ッ トおよ びヒ ト血 中u。MGP 5）ビタ ミ ンK
栄養と血中ucMGP 濃 度ラ ッ ト血漿 ；ワルフ ァリン 50mg ！kgを3 日 間連続経 口投 与 した 10週 齢の
SD
系 雄 性ラッ ト （日本SLC
社 ） と非 投 与ラッ トの血漿 を検 体 とし て 用い た．
血液 凝固 分析装 置 （Coagu Chek XS ： ロ シュ 社 製）で測 定 したワル フ ァ リン投 与 ラッ トの
PT−INR
（lnternational
Normal−
ized
Ratio；国際 標 準 化比）値は 45 以 上 であっ た，
ヒ ト血漿 ：イン フォー
ム ドコ ン セ ン トに基づい て本 研 究 へ の 参加に同 意 が 得 ら れた長 野 県 在 住の通 院 高 齢 女 性 （平均年 齢 68．
1± 8．
6歳）126 名とメ ナ キノ ンー
4 （MK−
4） 45 mgl 日 を 服 用 する通 院高 齢女性 （平 均 年 齢679
±9，
1 歳 ）44名 およ び ワル フ ァ リン服 用 患 者5
名 （68，
3
±3．
5
歳 ）の血 中ucMGP 濃 度 を測 定 した．
ま た，
MK−
4お よ びワ ル フ ァ リンを服用 し ない 非服 用者の血中ビ タ ミ ン K 濃 度と 血中ucMGP 濃 度の相 関 関 係につ い て も検 討 した．
ビ タミ ンK の血 中濃度は，
Suharaら が開発し た LC−
MSIMS 法s）に よ りフ ィ ロ キ ノ ン （PK ），
メナキ ノ ンー
7（MK−
7）およ び MK−
4 を測 定 した．
結 果 ◆ 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 8 6 4 2 11 § 週 騨 き 署 コ 丹 野 月 屡 構 皿 恥 ＼ 蝿 騨 」 窪 。 づ 仔 黙 僧 屡
．
磆 ◆ ◆ ◆ ◆ 抗 ラ ッ トucMGP （35−
54 ）モ ノクロー
ナル抗 体 （以下，
ラッ トucMGP （
35−54
）mAb ）お よ び 抗ヒ トucMGP （35−
54
）モ ノ クロー
ナ ル抗 体 （以 下，
ヒ トucMGP （35−
54 ） 皿 Ab ）の特 異 性 を検 討 し た．
ラ ッ トucMGP （35−
54 ） 皿 Ab は，
ラ ッ トucMGP （35．
54），
ucMGP （1−
84）を 認 識 する が ヒ トucMGP （35−
54，
1−
84 ）とは交差 反応性 を 示さ な かっ た．
また，
ヒ トucMGP （35−54
）mAb はヒ ト ucMGP （35−54
），
ucMGP （1−84
）を 認 識 す るが ラ ッ ト ucMGP （35−54，1−84
）と は 交 差 反 応性を示さなかっ た，
y＝1．
ll6xr＝
0．
976 2040 60 80 希 釈 率 （％） 100 図1 希 釈試 験 （ラット血中ucMGP 濃 度測 定 ） ワル ファリンを投 与し たラッ ト血漿を用いて希 釈 試 験を実 施 し た，
原 点 を 通 る直線 回帰式の傾 き は1．
116，
相 関係 数は 0，
976と なっ た．
0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 ワ臼
0 8ρ
0 4 ワ自
11
1
（
、
O
）
醤 匙 き 署 口 丑 蝋 目 屡 確 株 ＼ 製 騨 き 23 岳 蕪 弓 屡 艇 20 40 6Q 80 100 120 希釈率 （％） 図2 希 釈 試、
験 （ヒ ト血中ucMGP 濃 度測 定 ） ワル フ ァリン服用 患者の血漿を用いて希 釈 試 験を実 施し た．
原 点 を 通 る 直 線 回 帰 式の傾 き は 1．
13，相 関係 数は0998 と なっ た，
142
津川 尚子，
金 森 健 悟，
澤田 夏 美，
高 瀬 友 貴，
中 山 智 恵，
藤出 朋 子，
井 上 玲 香，
金 月 真 央，
内 野 由 理 白 木 正孝，
岡 野 登 志 夫 〔ビ タ ミン 88巻 表1 添 加 回 収 試 験 （ラッ ト］flLHP
ucMGP 濃 度測 定 ） （ 日 ＼ Ho 日 自）
遡 爨 幽 O Σ o ⇒ 40 添加 濃 度 （nmQl1L ） 測定値 （nmol 〆L） 回 収率 （％） CV 値 （％） 3530 012．
525．
050．
0100．
0 2．
015，
6 ± 0．
6 107，
6 ヨ： 3．
9 25．
5 」： 0，
7 94．
6 ± 2．
4 49．
7 ± 1．
3 95．
5 ± 2．
6 97．
4 ± 4．
0 95．
5 ± 3．
9 3．
62．
62．
74，
1 （mean ±SD） 〔n＝
3） 2520151050 ＊＊ 対 照群 ワル フ ァリン （n＝
5） 投与群 Student，
s t−
test ＊ ＊ PくO，
Ol 表2 添 加回収 試 験 （ヒ ト血 中ucMGP 濃 度 測 定 ） 添 加 濃度 （nmol1L ） 測定値 （nmol ！L） 「目1
収 率 （％） CV 値 （％） 05．
015、
045．
0135．
0 ll．
9 ± 0．
1 16．
1 ± Ll 95．
3 ± 7．
1 27．
1 ± 4．
O lOO．
9 ± 14．
9 62．
1 ± 7．
l lO9．
1 ゴ：
103 160．
1 ± 21．
6 109，
0 ± 12．
3 7．
514．
89，
511．
3 図3 ワ ルファ リン投 与ラッ トの血 中ucMGP 濃 度 ワル ファ リン50mg 〆kg を3 日間連 続 経冂投 与し た 10週齢 のSD
系 雄 性ラッ トとvehicle 投 与ラッ トの血中ucMGP 濃 度を測定した．
血中ucMGP 濃 度は，
ワ ル ファリン投与で約 4倍上昇した，
〔mean 土 SD） （n＝
3） 表3 同 時 再 現 性お よ び 口差 再 現 性 （ラ ッ ト血中ucMGP 濃 度 測 定 ） 70 60 血 漿検体 同時再 現性 日差 再現 性 12345 12．
1ll．
110．
911．
4U．
3 ll．
412，
810．
011．
912．
3婁
501互
40 望鼕
30馨
書
20 10 平 均 ± SDCV （％） 1正．
4 ± 0．
54．
2 11．
7 ± Ll9．
2 （nmol 〆L） 表4 同時再現性 お よ び 日 差 再 現 性 （ヒ ト血 中ucMGP 濃 度 測 定） 0 非 服 用 者MK
−
4ワ ル フ ァ リン 服 用者 検 体No
．
同 時再 現 性 日 差再 現 性 12345 29，
027，
826．
226，
826．
3 27．
226．
527．
324．
126．
4 図4MK−
4および ワル ファ リン服 用 者と非 服 用 者の血 中 ucMGP 濃 度 MK−
4服用患 者 （n＝
44＞，
ワ ル ファ リン服 用 患 者 （n≡
5）お よ び MK−
4 と ワルフ ァ リンを服 用しない非 服用者（n＝
126） の 血 中ucMGP 濃 度 を比 較 した，
Dunett検 定により，
対 照 者に 比べ て ワル ファ リン服 用 者の血中ucMGP 濃 度が約3 倍 高い こ とを確 認 した （＊ ＊ ＊lDunett 検 定p＜O．
OOI），
ま た，
Dunett検 定で は対照者とMK−4
服 用 者の血中ucMGP 濃 度 に有意 差 を 認めな かっ たが，
Student’
s t−
testを用い た2群 間 比 較 に おい て はMK−
4服 用者の血 中ucMGP 濃 度が有 意に 低いこ とを確認 した （p＜0．
001＞．
平 均±SD
CV （％） 27．
2 ± 1．
24．
0 26．
3 ± L35，
0
（nm 。UL）3号（3月）2014〕 血 中ucMGP 濃 度 測 定 法の開発と ビタ ミ ン K 栄養 評 価 143 40
（
35 ぐ尸
δ 30ε
遡 25耋
20毳
、
目 15100 1 2 3 4 血 中PK濃 度 （ng ／mL ） 5 図5 血中ucMGP 濃 度と血 中PK 濃 度の関 係 MK−4
と ワル フ ァリンを服 用 しない非 服 用 者 （n＝
126）の血 中 ビ タミ ンK 濃 度と血中ucMGP 濃 度の関係を検 討した結 果 血 中PK 濃 度と 血中ucMGP 濃 度に有 意な負の相 関 関 係が 認 め ら れ た（p＝
0，
013）．
ELISA 測 定 法は，
血中ucMGP 濃 度測 定に利 用 可能と 判 断し た．
次に，
この方 法を用い て ワ ル ファ リン投 与ラッ トの 血 中ucMGP 濃 度 を 測 定 した 結 果，
非 投 与 群では5．
9
± O．
5nmol1L であっ た の に対し，
ワ ル フ ァリン投与群で は24．
4±4．
O nmol ！L とな り，
ビ タ ミン K 作用が阻害さ れ る と血 中ucMGP 濃 度 が 約4倍 高 く上昇 する こ と を 確 認 し た （p
〈0，
01）（図 3）．一
方，
ヒ トに おい て ビタ ミン K の作用発現に影響 する薬剤を服用 し ない 対 象者 に比べ て MK−
4服 用 者の血 中ucMGP 濃 度は有 意に低 くt ワ ル ファ リン服 用 者の血 中ucMGP 濃 度 は 約3
倍 高い こと を確 認した（図4 ）．
ま た，
ビ タ ミン K の作 用 発 現に影響する薬剤を服 用し ない 対 象 者におい て，
血 中ビタ ミ ン K 濃 度と 血中ucMGP 濃 度の相 関 関 係を検 討し た結果 血中ビ タ ミン Kl （ブ イ ロキノ ン ：PK ）濃 度と有 意 な負の相 関 関 係を示 した （図5）．
考 察 ビ タ ミン K 不足の 指標 と し て PT や OC の低 Gla 化 体で あるPIVKA−
II，
ucOC の 血中 濃 度測定がすで に 臨 床 応 用 さ れてい るよ うに，
血 中ucMGP 濃 度 は 血 管に おける ビ タ ミン K 栄養の指 標とし て有 益 な情 報を与え る こ と が期待さ れる．
血中ucMGp 濃 度測定につ い て は，
すで に幾つ かの報 告 9）’
13）が あるが，
血 中ucMGP 濃 度が著 し く 異 な る場 合がある．
例え ば，
大 動 脈 弁石 灰 化 症患者の平 均血中ucMGP 濃度 11）と，
他の報 告に お ける心血管 疾 患 患 者の血中 濃 度 には約 lo倍の差 が ある13），
こ れ らの 方 法で は，
検 体 を 希 釈 し た 後 に Assay 系へ 添加して い る が，
検 体の希 釈 操 作は 最終濃 度の計 算の 際に係 数 を か けるた めに僅か な測 定 値の差 が血中濃 度に大 きな影響を与えるこ とがある，
そこ で，
本 研 究では 既 報で使 用 さ れた抗 体（抗ヒ トucMGP （35−
49 ）抗体）よ りもさらに Gla 化を受 けるグルタミン酸 残 基 を一
つ 多く認 識 する モ ノ クロー
ナル抗 体を作 成し，
検 体を希釈せずに測定で きる条件を検討 し，
良 好 な 精 度をもつ 測 定 法を開 発 するこ と が で きた．
こ の方 法を 用い て血 中ucMGP 濃 度 を 測 定 した結 果 ワルフ ァ リ ン連 続 経口投 与 後の ラ ッ ト血 中ucMGP 濃 度 が 有 意に 上昇 する ことが確 認で きた．
ま た，
ヒ トにおい てもワ ル フ ァ リン服用や ビ タミ ンK
栄 養の低 下と ともに血 中 ucMGP 濃度が 上昇 する こと を確認し た．
これ ら のこ と か ら，
血 中ucMGP 濃 度 は 血 管で の ビタミンK
栄 養の 指標として 利用で きると考え られ た．
ラッ トにワ ル フ ァ リンを投 与 する と 血管平 滑筋が石 灰化する14）こと や，
ワル フ ァ リン の 長 期 服 用は心 臓 弁の石 灰 化リス ク を増 大さ せ る こ とが報 告さ れ てい る 15 〕．
MGP の 作用メ カニ ズム として は
，
Gla
化 後にBone Morphogenetic Protein−
2 （BMP−
2 ）と結合 して作用 を 阻害し，
血 管 平 滑 筋 細 胞か ら骨 芽 細 胞様 細胞へ の分 化誘導を抑 制 する こ とで石 灰化を 阻害 する と考えら れ てい る 16）’
2°）．
し た がっ て，
血中ucMGP 濃 度の 上昇は 血管に おける ビ タ ミンK
不 足の指 標で あ ると ともに，
血 管 石 灰 化 リス ク の指 標 と して も有 用である可 能 性は高い．
し か し，
こ の点につ いては 大 動 脈 弁や冠 動 脈の石 灰 化 を伴 うワル フ ァ リン服用者の血 中ucMGP 濃 度 が非服 用 者 と 比 較 して低 下 する とい う報 告 15）があ り，
本 研 究の結 果は 血 中ucMGP 濃度に おける ワ ル フ ァ リン服 用の影 響の点 で この研 究と矛盾する．
この報告は，
動脈 弁石 灰化を 伴っ た 長 期ワル フ ァ リン服 用 患 者 が 対 象であ り，
リン 酸 化さ れ た p−
ucMGP が 石灰 化 部 位へ 沈 着 したこ と が 21｝血中ucMGP 濃 度の低下 に影響するの で は ない か と考 察 してい る．
そ れ 故に，
血 管 石 灰 化 リス クの評 価 には非リン酸化体であるdp−
ueMGP 濃 度 を 指 標にする べ きであると提 案さ れ てい る が，
MGP の リン酸化に つ い て は未だ不 明 な 点 が多い．
今 後これ らの 点を明確 にする た め に本 研 究で 開 発 した測 定 法で血 管 石 灰 化モ デ ル ラッ トあるい は 血管石 灰化 病 変を有する患者の血 中ucMGP 濃 度 を測 定 し，
ビ タ ミン K 栄養状 態を考慮 しな が ら石 灰 化マー
カー
と して の有 用 性につ い て詳 細 に検 討 する必要があると考える，
（平 成25．
12．
24 受付）144
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